人锰超氧化物歧化酶(hMn-SOD)的研究进展

人锰超氧化物歧化酶（ｈＭｎ－ＳＯＤ）是线粒体基质酶，其基因是诱导表达的。作为细胞内氧自由基的清除剂，具有抗衰老、提高细胞对氧应激反应的耐受性及抑制肿瘤发生等方面的作用。文章从ｈＭｎ－ＳＯＤ的结构、理化性质、分子生物学研究、与衰老、肿瘤的相关性及其临床应用等方面对其进行近期研究成果和未来发展趋势进行了综述。

重组人锰超氧化物歧化酶工程菌高效表达培养工艺的研究

目的 确定重组人锰超氧化物歧化酶 (rhMn SOD)工程菌高效表达的最适培养工艺条件。方法 通过摇瓶培养研究了包括接种量、诱导时机、Mn2 + 浓度、诱导后培养时间、发酵过程中 pH变化以及初始 pH值对发酵的影响。 结果 该工程菌的最佳接种量为 3%,最佳诱导时机为接种后 3h ,确定Mn2 + 浓度为 6 0 0 0 μmol·L-1,诱导后培养 5h ,在培养过程中当pH为6 .83时外源蛋白可获得高效表达 ,初始 pH确定为 8.0。 结论 :诱导和培养基的 pH是影响工程菌发酵的主要因素 ,尤其是Mn2 + 的加入表达有活性的rhMn SOD是必需的。

诱导剂对重组人锰超氧化物歧化酶表达的影响

用异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)、乳糖、巯基乙醇对重组人锰超氧化物歧化酶(rh Mn-SOD)工程菌进行诱导 ,结果表明 3种物质都可以诱导 rh Mn-SOD外源蛋白的表述。通过酶活力、比活测定及电泳的结果显示 ,以乳糖作为诱导剂的表达效果明显好于 IPTG和巯基乙醇 ,进一步的实验结果表明乳糖诱导的最佳浓度为 80

重组人锰超氧化物歧化酶高密度发酵培养条件研究

目的:研究发酵罐中采用乳糖诱导高效表达重组人锰超氧化物歧化酶(rhMn-SOD)的条件。方法:通过摇瓶和发酵罐培养研究了培养基、乳糖浓度、诱导时机、表达时间、溶氧条件、补料碳源种类对rhMn-SOD表达的影响。结果:乳糖诱导浓度为0.25%,溶氧浓度为40%～60%,用葡萄糖作为补料碳源进行高密度发酵,菌体密度A600达到28.98,菌体湿重达到60g/L,Mn-SOD活性达到18222.22U/g,比活为1057.5U/mg,实现了rhMn-SOD的高效表达。结论:对培养基配方和发酵条件进行了优化,为rhMn-SOD大规模生产奠定了基础。

人锰超氧化物歧化酶基因在大肠杆菌中的表达

目的 :研究人锰超氧化物歧化酶 (h Mn- SOD)基因在不同大肠杆菌中的表达水平。方法 :以人肝细胞株 (L 0 2 )总 RNA为模板 ,用 RT- PCR扩增出 h Mn- SOD c DNA,构建重组质粒 p SE380 - Mn SOD并分别转化至 3种大肠杆菌 DH 5α、TOP10和BL 2 1。采用 SDS- PAGE和改良的连苯三酚法分别检测 SOD酶蛋白及其活性。结果 :h Mn- SOD基因在 3种大肠杆菌中都可以表达 ,表达量分别为菌体总蛋白质的 11.9%、15 .8%和 30 .2 %。表达产物具有 SOD酶活性 ,酶比活性分别为 90 .15 U/ m g、114 .0 6 U/ mg和 2 16 .13U/ mg。结论 :h Mn- SOD基因在不同大肠杆菌中的表达水平明显不同 ,在 BL2

金属螯合亲和层析分离纯化重组人锰超氧化物歧化酶

以金属铜螯合的亲和层析方法分离纯化重组人锰超氧化物歧化酶,采用3种不同的洗脱方法都可以对重组酶进行分离纯化.但是通过鉴别比较,采用方法1即逐步降低洗脱液的pH和固定洗脱液的NH+4的浓度可以获得较好的结果,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳得到一条分子质量约为22000u的蛋白条带,证明所得到的为纯度较高的重组人锰超氧化物歧化酶（rhMn-SOD）。

诱导条件对重组人锰超氧化物歧化酶发酵的影响

分别研究了3种诱导剂和Mn2+浓度对重组人锰超氧化物歧化酶(rhMn-SOD)发酵表达的影响,并进一步优化了乳糖诱导rhMn-SOD表达的条件。结果表明:异丙基--βD-硫代半乳糖苷(IPTG)和乳糖诱导能够获得类似的表达效果,诱导的同时加入2 mmol/L的Mn2+能够明显提高rhMn-SOD的表达。进一步的实验结果表明:乳糖诱导的最佳浓度为7 mmol/L,最佳时机为接种后6 h,A600为2.1,诱导表达6 h rhMn-SOD活性和比活达到最高。

人锰超氧化物歧化酶cDNA基因的克隆

利用人胚胎肝组织提取总ＲＮＡ，从总ＲＮＡ 中分离纯化出ｍ ＲＮＡ，经逆转录得到ｃＤＮＡ 第一条链，并以之为模板和相应寡聚脱氧核苷酸为引物，进行ＰＣＲ 合成人锰超氧化物歧化酶ｃＤＮＡ 基因，将所得ｃＤＮＡ 克隆到质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ 上，转化大肠杆菌ＤＨ５α细胞，进行诱导表达筛选，将筛选的克隆进行ｃＤＮＡ

重组人锰超氧化物歧化酶纯化条件研究

目的研究重组人锰超氧化物歧化酶(rhMn-SOD)的纯化条件。方法超声法破碎细胞,用热变性方法沉淀蛋白质;优化DEAE离子交换层析的的分离条件,并用葡聚糖凝胶G100分子筛分离纯化蛋白质。结果菌体破碎最佳超声功率为300W,超声70个循环,粗酶液热处理最佳温度为75℃,时间10 min;DEAE上样缓冲液最佳pH值为9.0,洗脱液NaCl含量为0.1 mol/L,G100纯化后,rhMn-SOD比活达到4 411.706 U/mg,纯化倍数是粗酶液的5倍。结论得到了适于分离纯化rhMn-SOD的较简便的工艺。

固定化金属亲和层析胶与亲和层析膜纯化rhMn-SOD和rhCu,Zn-SOD的比较研究

为比较固定化金属亲和层析膜与亲和层析胶的纯化效果,分别用固定化金属亲和层析胶Cu2+柱、Ni2+柱、固定化金属亲和层析膜Cu2+柱、Ni2+柱分离纯化rhCu,Zn-SOD、rhMn-SOD/24a、rhMn-SOD/28。结果表明,亲和胶与亲和膜分离SOD获得相似的纯化效果,纯化倍数均在3到5之间,亲和膜分离所得SOD比活略高于亲和胶,rhCu,Zn-SOD与Cu2+的亲和能力高于rhMn-SOD。固定化金属亲和层析膜色谱为基因工程产物的快速分离鉴定提供了一个简便的方法。

人Mn-SOD cDNA的克隆及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

以人肝细胞株(L0 2 )总RNA为模板,用RT PCR扩增出人锰超氧化物歧化酶(hMn SOD)cDNA ,将其插入含有AOX1基因启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9k ,构建重组质粒pPIC9k MnSOD ,转化毕赤酵母GS115 ,筛选出整合了多拷贝hMn SOD基因的Mut+ 表型菌株,摇瓶培养,0 5 %甲醇诱导表达。SDS PAGE分析显示,诱导4d的培养上清中hMn SOD的表达量约为上清总蛋白的32 % ,酶比活可达2 4 7 7u mg。hMn SOD在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌性表达。