人隐孢子虫RT-PCR-ELISA检测方法的建立

目的建立一种高度敏感和特异的人隐孢子虫的RT-PCR-ELISA检测方法。方法根据人隐孢子虫与其他隐孢子虫粘附蛋白p23基因的多重比对,设计一对引物(其中p1引物带有生物素标记)用来扩增含高变区目的片段;采用RT-PCR方法扩增目的片段,扩增产物与探针引物进行液相杂交,将杂交产物与微孔板上包被的链霉亲和素结合,再与辣根过氧化酶标记的抗地高辛抗体反应。用所建立的方法对22份临床样本进行检测,并与常规检测方法进行比较。结果所建立的RT-PCR-ELISA检测方法具有高特异性和敏感性,比常规的PCR方法灵敏度提高了100(0.08:8ng)左右。临床检测结果显示,该方法的检出率高达86%(19/22),而RT-PCR、蔗糖漂浮法和抗酸染色法的检出率仅为27%(6/22)、27%(6/22)和50%(11/22)。结论本试验成功建立了人隐孢子虫的RT-PCR-ELISA检测方法,检出率比常规检测方法高。

人隐孢子虫的研究进展

人隐孢子虫(C.hominis)为近年来被新命名的隐孢子虫种之一,作为引起人体隐孢子虫病的主要病原之一,受到研究者的广泛关注,近年来对其生物学特性,流行病学,基因组学等相关方面开展了大量的研究,本文主要从上述3方面综述了人隐孢子虫的研究现状。

猴源人隐孢子虫的分离与鉴定

为了解感染不同灵长类动物的隐孢子虫种类以及与感染人的人隐孢子虫(C.hominis)之间的遗传差异,本研究采用形态学和分子生物学方法对猴源隐孢子虫进行分离和鉴定。利用常规方法分离猴粪便中的隐孢子虫卵囊,通过改良抗酸染色和荧光显微镜观察对其进行形态学鉴定;并采用PCR方法扩增其卵囊壁蛋白(COWP)基因和18SrRNA基因,扩增产物克隆至pMD-18-T载体中,对阳性克隆进行测序并作进化树分析。结果表明:抗酸染色和荧光检查结果与所报道的人隐孢子虫的结果一致。PCR扩增产物经电泳检测,明显地出现554bp和370bp大小的片段,与预期结果一致;两种基因的序列分析结果显示该猴源隐孢子虫与C.hominis的相似性均为100%。由此可认为本次分离的隐孢子虫为C.hominis。

噬菌体展示技术筛选人隐孢子虫P23抗原表位

目的本研究利用噬菌体展示技术筛选人隐孢子虫P23抗原表位,为研制其抗原表位疫苗奠定基础。方法首先用人隐孢子虫重组P23抗原免疫动物以制备抗体,将该抗体与噬菌体展示随机肽库结合,通过ELISA和Western-blot方法鉴定阳性克隆,并对阳性克隆进行增殖,然后对其序列测定和抗原表位预测。结果噬菌体肽库结合抗体后,经ELISA方法可鉴定10株为阳性克隆,Western-blot检测可发现有67kD目的条带出现;序列分析结果可发现它们中具有3个不同结构表位序列,命名为ep1,ep2,ep3,且预测出具有良好的亲水性。结论所得序列是具有B细胞抗原表位。

人隐孢子虫IbA19G2基因亚型蒙古沙鼠感染模型的建立

人隐孢子虫Cryptosporidium hominis是人类的主要感染虫株,目前已获取且传代保存的国内分离株较少,在生物学特性研究也未见报道.在本试验自感染前第10天起至排卵囊结束后14天,采用胃管灌服地塞米松（0.75 mg/（只·2天））抑制蒙古沙鼠免疫力,对国内C.hominis Ib亚型分离株生物学特性进行研究.结果显示,感染后第3天,感染组有卵囊排出,感染后第6天出现高峰期,此后逐渐下降直至感染后第10或11天排卵囊结束.感染前后基于18S rRNA和gp60基因分析,表明遗传学无差异.建立了持续稳定的C.hominis Ib亚型分离株啮齿动物模型,为C.hominis卵囊扩增和进一步研究其生物学特性等提供了重要的参考依据.

猴源人隐孢子虫P23抗原基因克隆表达及其免疫活性的测定

为探索隐孢子虫病免疫预防的新途径,本文对猴源人隐孢子虫Cryptosporidium hominis P23抗原基因进行了克隆、表达及其免疫活性的测定.采用RT-PCR方法对猴源C.hominis P23抗原基因进行克隆,构建重组质粒pGEX 4T 1 P23,并用IPTG诱导其在E.Coli Rossetta中表达;采用SDS PAGE检测其表达效果;采用Dot ELISA和淋巴细胞转化试验分别检测其与抗体反应特性和淋巴细胞增殖情况.结果表明：所克隆的P23抗原基因大小为342 bp;重组质粒表达蛋白的大小为40 kDa（含26 kDa的融合蛋白GST）,以1、5、10 μg剂量的重组蛋白rP23均能刺激鼠脾脏淋巴细胞增殖,并能够与感染猴血清中的抗体明显地发生反应.

武汉市腹泻婴幼儿隐孢子虫感染的分子流行病学调查

目的了解武汉市2岁以下婴幼儿腹泻患者的隐孢子虫感染状况,为预防隐孢子虫感染提供分子流行病学依据。方法采集2014年8月—2015年7月在湖北省人民医院和武汉大学中南医院就诊的2岁以下婴幼儿腹泻患者粪便,过滤沉淀后于2.5%重铬酸钾溶液中4℃保存;采用酚-氯仿法提取基因组DNA、18S rRNA巢式PCR(Nested-PCR)扩增技术检测隐孢子虫感染,并对阳性PCR产物测序;所获序列进行Blastn比对,应用MEGA软件采用邻接法构建系统进化树进行虫种鉴定。结果共收集到298份婴幼儿腹泻患者的粪便样本。经巢式PCR扩增技术检测,298份样品中有9份扩增出隐孢子虫阳性条带,阳性率为3.02%(9/298),其中1~2岁腹泻幼儿阳性率为5.93%(7/118),<1岁患儿的阳性率为1.11%(2/180),差异有统计学意义(χ~2=4.13,P<0.05)。9份阳性PCR产物经测序后与Gen Bank中的参照序列进行比对,结果显示7份样本为微小隐孢子虫感染,2份样本为微小隐孢子虫与人隐孢子虫混合感染。绘制种系发育进化树发现,9条SSU r RNA基因序列与已发表的微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)位于同一个进化支上。结论武汉地区婴幼儿腹泻患者中存在隐孢子虫感染,主要感染虫种为微小隐孢子虫。

2015-2016年南京市隐孢子虫抽样调查报告

目的对南京市人群感染隐孢子虫状况进行抽样调查,为隐孢子虫病防治提供科学依据。方法选择南京市六合、栖霞、高淳等3个区的3个村,以及南京市中大医院门诊部为抽样调查点,于2015年和2016年每年每点各收集100份左右人群粪便样品,采用金胺酚—改良抗酸染色法对粪便样本进行检测,并采用荧光定量PCR法对阳性样本再进行分子生物学检测确认。结果 2015年和2016年在3个村抽样点共调查健康人群581人,未发现隐孢子虫感染者。在中大医院门诊部的慢性腹泻患者中采集202份粪样,检测出隐孢子虫阳性者9例,隐孢子虫感染率为4.46%;阳性者经采用荧光定量PCR法对隐孢子虫进行确认,结果有7例显示了明显的对数扩增曲线、为隐孢子虫核酸阳性,2例无明显的对数扩增曲线,隐孢子虫核酸阳性率为3.47%。结论在南京地区抽查的健康人群中未发现隐孢子虫感染者,而在医院门诊的慢性腹泻患者中发现了隐孢子虫感染者。提示应加强对门诊慢性腹泻患者隐孢子虫的检测,为该病的诊断、治疗提供依据。