鼠白细胞介素-2(mIL-2)真核表达质粒的构建及蛋白检测

目的构建重组鼠白细胞介素2的真核表达体系,获得mIL2基因的表达质粒,用其提高DNA疫苗的免疫原性。方法从经PMA刺激的小鼠脾细胞中提取总RNA,采用RTPCR技术调取鼠白细胞介素2基因,并将其克隆至真核表达质粒VR1012中,转染COS7细胞,将转染细胞裂解,进行Westernblot检测。结果获得完整的带有信号肽的mIL2序列的质粒,经Westernblot检测阳性。结论构建了mIL2真核表达体系,并获得有生物活性的mIL2蛋白。

骨形成蛋白7真核表达质粒的构建及在骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建骨形成蛋白 7(hBMP7)基因真核表达质粒 ,并使其在骨髓间充质干细胞中表达。 方法 采用PCR技术扩增BMP7基因 ,将其插入真核表达载体pcDNA3 1中 ,利用梯度离心法分离培养骨髓间充质干细胞 (MSCs) ,然后用构建的BMP7表达质粒转染MSCs,使其得到表达。结果 经过PCR及酶切鉴定证明获得了BMP7真核表达质粒pcDNA BMP7,通过反转录PCR和免疫组化鉴定证明BMP7在转染后的骨髓间充质干细胞中得到了表达。 结论 BMP7真核表达质粒的构建和在骨髓间充质干细胞中的表达 ,为BMP7基因治疗的研究奠定了坚实的基础 ,同时也为组织工程成骨和成软骨的研究提供了改良的种子细胞。

人隔蛋白7的真核表达载体的构建及表达

目的构建人隔蛋白7(SEPT7,hCDC10/SEPT7)的表达载体并对U251人脑恶性胶质瘤细胞系进行转染且检测其表达。方法RT-PCR方法扩增SEPT7cDNA片段,并将扩增的片段插入pCDNA3真核表达载体,构建成含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,以脂质体介导该质粒转染人脑恶性胶质瘤细胞系U251,应用RT-PCR和免疫荧光染色鉴定转染细胞中hCDC10/SEPT7的表达。用流式细胞术对转染前后的U251细胞进行细胞周期分析。结果成功构建含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3/SEPT7,并使其稳定转染U251细胞,在转染的细胞中,证实有SEPT7mRNA表达上调。细胞周期检测结果G0/G1期细胞增多,SPF降低。结论成功构建SEPT7表达载体,并在人脑恶性胶质瘤细胞系获得表达,延迟细胞周期进展。

人隔蛋白7的真核表达载体的构建及表达

目的构建人隔蛋白7（SEPT7，hCDC10／SEPT7）的表达载体并对U251人脑恶性胶质瘤细胞系进行转染且检测其表达。方法RT-PCR方法扩增SEPT7cDNA片段，并将扩增的片段插入pCDNA3真核表达载体，构建成含SEPTTcDNA的重组载体pCDNA3／SEPT7，以脂质体介导该质粒转染人脑恶性胶质瘤细胞系U250，应用RT-PCR和免疫荧光染色鉴定转染细胞中hCDC10／SEPT7的表达。用流式细胞术对转染前后的U251细胞进行细胞周期分析。结果成功构建含SEPT7cDNA的重组载体pCDNA3／SEPT7，并使其稳定转染U251细胞，在转染的细胞中，证实有SEPT7mRNA表达上调。细胞周期检测结果G0／G1期细胞增多，SPF降低。结论成功构建SEPT7表达载体，并在人脑恶性胶质瘤细胞系获得表达，延迟细胞周期进展。

促分裂原活化蛋白激酶信号阻断剂在TPO促进UT7细胞增殖和分化中的作用

目的探索促分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)信号阻断剂对巨核细胞生长分化因子(TPO)促进UT7细胞增殖和分化作用,阐明TPO对UT7细胞作用的机制。方法将EGFPpMSCV和MEK1pMSCV质粒转染UT7细胞;转染细胞与TPO共培养,Westernblot法检测UT7细胞MEK1(MAPK/Erkkinase1)磷酸化;观察转染突变(Ser222A)的MEK1和MAPK阻断剂PD98059对UT7细胞增殖的影响;采用流式细胞仪检测转染突变(Ser222A)的MEK1和MAPK阻断剂PD98059对UT7细胞表达CD41的影响。结果①重组逆转录病毒载体MEK1pMSCV和EGFPpMSCV转染UT7细胞,EGFP阳性率为60.73%。②TPO不同的作用时间(1h,3h),实验组磷酸化MEK1均低于对照组(P值均<0.05)。③MAPK阻断剂PD98059和外源突变MEK基因阻断了TPO对UT7细胞的增殖作用,DMSO对照组的细胞增殖率为98.58%,PD98059组的细胞增殖率为39.00%(P<0.05);转染EGFPpMSCV组细胞增殖率为102.12%,转染MEK1pMSCV组细胞增殖率为48.93%(P<0.05)。④MAPK阻断剂PD98059组UT7细胞CD41表达(10.27%)明显低于对照组(36.43%),转染MEK1pMSCV组UT7细胞CD41表达(24.03%)明显低于转染EGFPpMSCV组(40.16%)。结论TPO诱导UT7细胞MEK1磷酸化,TPO作用时间与UT7细胞MEK1的磷酸化有明显的关系。

人Plk3基因真核表达载体的构建及蛋白表达和定位

目的构建hPlk3真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法提取工具细胞Hela的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPlk3基因cDNA全长,并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。然后将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Westernblot检测其表达。最后利用激光共聚焦扫描显微镜观察pEGFP-hPlk3在COS-7细胞内的定位。结果hPlk3基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为1941bp,并测序成功。Westernblot检测到了GFP-hPlk3融合蛋白表达,分子量约为98kDa。pEGFP-hPlk3在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。结论成功构建了hPlk3基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-hPlk3蛋白在COS-7细胞中主要定位于细胞质和核周。

携带幽门螺杆菌ureB和IL-2质粒DNA的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗构建

目的 构建编码幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,H .pylori)尿素酶B亚单位 (ureB)基因和小鼠IL 2基因以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的核酸疫苗 ,体外转染Cos 7细胞 ,鉴定其表达蛋白的免疫性。方法 应用聚合酶链式反应 (PCR)技术从H .pylori标准菌株CCUG1 7874基因组DNA扩增ureB基因 ,从重组质粒 pCIneo IL 2扩增小鼠IL 2基因 ,通过T A克隆分别插入 pUCmT载体 ,检测ureB及IL 2的核苷酸序列 ,通过酶切、连接反应分别克隆入真核表达载体 pIRES ,PCR和酶切反应进行鉴定 ;重组载体 pIRES ureB和 pIRES ureB IL 2转入减毒鼠伤寒沙门菌LB50 0 0 ,抽提质粒 ,再次转入SL72 0 7,反复传代 ,鉴定核酸疫苗载体菌的稳定性。通过脂质体法将重组载体 pIRES ureB和pIRES ureB IL 2转染Cos 7细胞 ,SDS PAGE及Westernblot法检测表达蛋白的免疫性。结果 扩增出长约 1 70 0bp的ureB基因和 51 0bpIL 2 ,测序结果表明 ,扩增出的ureB基因与基因库H .pyloriureB序列一致 ,IL 2序列和小鼠的IL 2序列一致 ,PCR和酶切鉴定结果证实ureB和IL 2基因克隆入真核表达载体 pIRES ,并成功构建了稳定的幽门螺杆菌ureB和IL 2基因以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的核酸疫苗 ,并且以Westernblot检测到特异性的相对分子质量 (Mr)为 6 6× 1 0 3的UreB蛋白?