人雄激素受体的雄激素结合区cDNA在E.coli中的高效表达

将编码人雄激素受体 ( h AR)的雄素结合区 ( LBD)的 c DNA片段 ( 1 0 0 5 bp)克隆到由 P1 启动子控制的硫氧还蛋白表达载体p Trx Fus上 ,构建了表达质粒 p Trx AR,并转化到大肠杆菌 G1 72 4中。经色氨酸诱导表达后 ,SDS- PAGE分析 ,可观察到一高效表达的融合蛋白产物 ,此融合蛋白的分子量与理论值 ( 47KD)相吻合 ,氨基酸组分分析证明了L BD目的基因的表达。该融合蛋白的表达量可达菌体总蛋白量的 5 0 %左右。尽管采用不同温度诱导 ,该融合蛋白均以不溶的包含体形式存在。应用分子筛技术 ,该融合蛋白在变性剂 (尿素 )存在下 ,可一步分离纯化。此研究结果为进一步进行 LBD的蛋白质复性研究、免疫分析提供了材料 ,也为蛋白质的高效表达提供了实验途径及体系。

人雄激素受体LBD基因高效表达条件的优化及产物纯化

人雄激素受体（ｈＡＲ）激素结合部（ＬＢＤ）的ｃＤＮＡ片段克隆到表达质粒ｐＴｒｘＡＲ内，在大肠杆菌ＧＩ７２４中可被诱导表达。通过改变诱导培养时间、诱导剂浓度、诱导温度及培养基的ｐＨ，在３４℃～３７℃，ｐＨ６．４～７．７的培养基中，用１００μｇ／ｍｌＴｒｐ诱导培养４ｈ，可获得高效表达的ＬＢＤ融合蛋白产物。其最高表达量为５０～７０ｍｇ／Ｌ湿菌体。产物主要以包含体形式存在。经尿素溶解后，由ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００柱层析获得了电泳纯的目的产物。氨基酸组分分析和相对分子量测定表明与理论值一致。该表达条件的确定，为ｈＡＲ的ＬＢＤ基因表达和进一步研究提供了依据。

人雄激素受体激素结合区cDNA片段在大肠杆菌中表达的影响因素

人雄激素受体激素结合区ｃＤＮＡ片段在大肠杆菌中表达的影响因素王志强王学敏毛积芳卢建△人雄激素受体（ｈＡＲ）是类固醇激素受体超家族的成员之一，其分子为９１９个氨基酸残基组成的多肽链，分３个功能区：Ｎ端区、ＤＮＡ结合区和激素结合区。激素结合区由２４４个氨...

人雄激素受体部分N端区cDNA片段在大肠杆菌中的克隆及表达

N端区是甾体激素受体氨基酸序列差别最大的区域,决定了甾体激素受体抗原的特异性,是制备特异性抗甾体激素受体抗体的首选部位。以前,由于雄激素受体(hAR)纯化的困难,hAR抗体主要是从部分患前列腺癌病人血液中存在的hAR自身抗体纯化获得,利用这种方法制备的hAR抗体不但量少,而且来源也非常有限。 hAR cDNA克隆成功后。

人雄激素受体激素结合区cDNA片段在大肠杆菌中的克隆、表达及其活性检测

人雄激素受体(hAR)为甾体激素受体超家族的成员之一,由一条多肽链组成,分三个功能区:N端区、DNA结合区和激素结合区。C端的激素结合区,是与雄激素结合并介导其发挥生物学效应的关键区域,在目前导致男性两性畸形的主要疾病雄激素抵抗症的研究中发现,该区域内的基因突变是导致雄激素与hAR结合异常的主要原因,但这种由基因突变引起的结合异常的分子机制尚不清楚。根据由hARcDNA推演的氨基酸序列分析表明,hAR分子中不存在二硫键,且氨基酸残基上无糖基化修饰。 以前。

报告基因方法检测壬基酚、双酚A抗雄激素样活性的体外研究

[目的]利用基于报告基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)体外抗雄激素检测方法对壬基酚、双酚A的抗雄激素样活性进行研究,为进一步验证该法在检测抗雄激素样物质的可行性和揭示内分泌干扰作用的机制提供依据。[方法]采用本室建立的瞬时转染人雄激素受体表达质粒pSVAR0、雄激素反应元件调控的报告质粒pMMTV-Luc及内对照质粒phRL-SV40的CHO细胞,在给予1×10-7mol/L二氢睾酮(DHT)后给予不同浓度的壬基酚(NP)及双酚A(BPA),检测报告基因表达活性。[结果]浓度均>1×10-6mol/L的NP、BPA可抑制1×10-7mol/LDHT产生的雄激素样作用,两者具有抗雄激素活性,但较雄激素拮抗剂氟他安(FLU)弱,BPA的抑制作用强于NP。[结论]NP、BPA有一定的抗雄激素活性,BPA的抑制作用强于NP。

基于荧光素酶报告基因的CHO细胞(抗)雄激素样物质检测方法的建立

目的 建立基于报告基因的CHO细胞体外(抗)雄激素检测系统,并研究2 ,4 DDT、甲氧氯的抗雄激素样作用。方法 通过脂质体转染法将人雄激素受体表达质粒pSVAR0、雄激素反应元件调控的报告质粒pMMTV Luc及内对照质粒phRL SV4 0瞬时转入CHO细胞,检测报告基因lucferase的表达,给予DHT、FLU后检测该系统的有效性和特异性,并用2 ,4 DDT、METH等受试物进行验证。结果 转染后的CHO细胞对DHT呈明显的剂量-反应关系,1×10 - 1 0 mol LDHT可出现明显的兴奋效应,至1×10 - 7mol L可达到最大反应值,而未转染雄激素受体质粒与DHT无明显反应,FLU可以显著抑制二氢睾酮的激动效应,说明检测系统有效、特异。验证结果表明3×10 - 7mol L以上2 ,4 DDT及3×10 - 7mol L以上METH可对雄激素受体活性产生抑制作用,2 ,4 DDT的抑制作用强于甲氧氯。结论 本试验建立的基于报告基因的体外(抗)雄激素检测系统是可行的,2 ,4 DDT、甲氧氯有明显的抗雄激素活性作用。

多激素分泌性垂体泌乳素腺瘤的激素分泌谱及克隆分析

目的对多激素分泌性垂体泌乳素腺瘤的克隆状态以及激素分泌谱进行分析。方法对26例女性垂体泌乳素腺瘤患者(单激素分泌性PRL腺瘤7例,多激素分泌性PRL腺瘤19例)进行肿瘤标本的免疫组化分析,并且提取DNA行HUMARA分析。结果免疫组化分析提示本组多激素分泌性垂体PRL腺瘤具有10种不同的激素分泌谱,现代分子生物学HUMARA克隆分析提示11/13例(85%)多激素分泌性垂体PRL腺瘤为单克隆起源。结论结果提示垂体泌乳素腺瘤除了分泌泌乳素外,还可以分泌多种垂体激素,而且绝大多数多激素分泌性垂体腺瘤的起源是单克隆性的。

1例女性杜氏肌营养不良的分子遗传学机制

目的探究1例女性Duchenne型肌营养不良患儿的临床表型及基因变异特点,并分析其分子遗传学发病机制。方法对1例女性杜氏肌营养不良患儿的进行临床评估、肌肉活检病理分析,应用多重连接探针扩增技术(MLPA)和Ion Torrent半导体测序检测患儿的DMD基因,并对其父母进行家系验证,进行染色体核型分析和运用微阵列比较基因组杂交(a-CGH)检测患儿染色体变异情况,采用人雄激素受体基因甲基化特异性PCR(HUMARA-MSP)对患儿进行X染色体失活模式的检测。结果患儿为女性,就诊时3岁,主要表现为肌酸激酶(CK)增高和运动能力稍差,肌肉病理示肌营养不良样改变和抗肌萎缩蛋白的缺失。MLPA技术未检测出患儿存在DMD基因的缺失突变或重复突变,Ion Torrent半导体测序结果发现患儿DMD基因存在c.10223+1G>A单一杂合突变,且该突变为新发突变。患儿染色体核型正常,a-CGH未检测到染色体异常。HUMARA-MSP证实患儿存在明显的X染色体失活偏移。结论该女性患儿携带DMD基因c.10223+1G>A单一杂合突变,X染色体失活偏移是导致该女性DMD患儿的发病原因。

意义不明的克隆性造血的研究进展

一般认为，以血液系统相关肿瘤基因突变为标志的克隆性造血是血液系统恶性肿瘤的重要特征之一，但早在1997年，Champion等“’采用人雄激素受体（human androgen receptor，HUMARA）检测X染色体灭活的方法证实在健康女性体内存在克隆性造血。近年来，采用更敏感的分子生物学检测技术发现克隆性造血在健康人群中颇为常见，但其临床意义以及预后尚不明确，Steensma等将其命名为意义不明的克隆性造血（clonal hematopoiesis of indeterminate potential，CHIP）。本文我们就CHIP的内涵、与骨髓增生异常综合征（MDS）的鉴别以及预后意义进行综述。

一例女性血友病A患者发病机制的探讨

目的探讨1例血友病A（hemophilia A，HA）女性杂合患者患病的机制。方法应用倒位移位聚合酶链反应（inverse shifting—polymerase chain reaction，IS-PCR）检测FⅧ基因缺陷；采用人雄激素受体检测（human androgen receptor，HUMARA assay）方法检测X染色体是否为非随机性失活；采用G显带法分析外周血细胞核型。结果IS-PCR检测发现该患者FⅧ基因存在第22内含子远端倒位；HUMARA检测发现该患者X染色体为非随机性失活——母源X染色体比父源X染色体活性低，即携带有正常FⅧ基因的母源X染色体比携带有缺陷FⅧ基因的父源X染色体甲基化失活比率更高；G显带核型分析显示先证者染色体核型未见明显异常。结论该血友病A女性患者的患病机制可能是由于X染色体非随机性不平衡失活引起的。