多溴二苯醚类化合物干扰人雌激素受体alpha活性机理的理论研究

基于分子对接方法探讨了多溴二苯醚(PBDEs)类化合物与人雌激素受体α亚型间的分子作用机理.对多溴二苯醚类化合物是否具有拟雌激素功能的研究得出:可通过对接打分值和化合物结构特征来推测PBDEs母体化合物是否具有拟雌激素活性;对HO-PBDEs,与氨基酸残基GLU53和/或ARG394形成氢键可能是影响其拟雌激素活性的重要因素;对MeO-PBDEs,疏水MeO-位于结合腔的疏水中部有利于拟雌激素活性.从结构及构象分析得出,邻位疏水基(Br-、MeO-)有利于PBDEs类化合物的拟雌激素活性.同时对多溴二苯醚类化合物是否具有抗雌激素功能的结合特征研究发现,表现出抗雌激素活性的部分PBDEs类化合物伸进通常被雌激素受体拮抗剂雷洛昔芬和4-羟基它莫西芬的烷基胺侧链占据的通道,而大多数未表现出抗雌激素活性的PBDEs类化合物的结合模式类似雌激素受体激动剂17β-雌二醇,位于结合腔,没有伸进通道.本研究从化合物结构及化合物在受体内结合的构象特征上解释化合物活性不同的原因,以期能够利用构象分析得到的结果进行筛选.

酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母

应用酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母,用以检测类/抗雌激素化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.采用多聚酶链反应(PCR)法扩增人雌激素受体(hER)基因,构建诱饵质粒pGBKT7-ER LBD;分别提取并纯化两种含有ER共激活因子基因的靶质粒pGAD424-GRIP1和pGAD424-SRC1;诱饵质粒和靶质粒同时转染酵母细胞Y187,于营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu)上筛选阳性菌落,分别构建两种ER双杂交酵母ER+GRIP1和ER+SRC1.考察双杂交酵母与不同激素:17β-雌二醇(E2)、二氢睾酮(DHT)、孕酮(PG)以及三碘甲状腺原氨酸(T3)的结合情况,并考察了雌激素受体拮抗剂4-羟基他莫昔芬(4-OHT)与酵母的相互作用.结果表明:ER+GRIP1和ER+SRC1酵母均能够专一性的和E2结合,并存在显著的剂量-效应关系,E2对ER+GRIP1和ER+SRC1酵母β-半乳糖苷酶活性诱导的EC50值分别为7.3×10-11mol·L-1和1.5×10-10mol·L-1,其中ER+GRIP1酵母细胞诱导产生的酶活性值明显高于ER+SRC1酵母细胞.4-OHT能够抑制E2诱导ER+GRIP1酵母细胞产生的酶活性,并存在显著的剂量-效应关系,IC50值为1.0×10-7mol·L-1.表明重组人雌激素受体基因酵母可以用于检测化合物和环境样品的类/抗雌激素活性.

雌激素受体β基因小干扰RNA表达载体的构建及表达研究

目的构建针对人雌激素受体(estrogen receptor,ER)β基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)真核表达载体,转染人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblast cells,HPLFs)后观察其对ER-β基因表达的抑制作用。方法设计并合成针对ER-β基因siRNA的寡核苷酸序列,插入载体pSilencer3.1-H1-neo中形成重组载体。重组载体经测序鉴定后转染HPLFs,western blot检测转染前后ER-β蛋白的表达情况。结果测序结果与所合成的寡核苷酸完全一致,证实成功构建了针对ER-β基因的siRNA表达载体。Western blot检测显示转染HPLFs后可使其ER-β蛋白表达显著下调。结论针对ER-β基因的siRNA表达载体成功构建,并能有效抑制HPLFs中ER-β基因的表达。

人雌激素受体相关受体逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建人雌激素受体相关受体α(hERRα)逆转录病毒载体。方法用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pSG-hERRα质粒和pLXSN空白质粒,采用凝胶DNA回收方法回收纯化hERRα片段,用T4连接酶进行连接反应,构建成PLXSN-neo-hERRα重组体。结果经PCR、酶切鉴定、测序等对重组体进行鉴定,证实构建的重组体方向、序列正确。结论已成功构建hERRα逆转录病毒载体,为研究hERRα的功能奠定了基础。

DDT类农药的拟雌激素活性研究

目的研究DDT类农药(p,p′-DDT、o,p′-DDT、p,p′-DDD、p,p′-DDE)的拟雌激素活性。方法用重组人雌激素受体(hER)基因酵母细胞(W303-1A-hER-ERE-LacZ)评价DDT类农药的拟雌激素活性。将终浓度为10-9～10-15mol/L的17β-雌二醇、终浓度为10-3～10-9mol/L的p,p′-DDT、o,p′-DDT、p,p′-DDD、p,p′-DDE加入酵母细胞培养液,作用4h,通过定量测定β-半乳糖苷酶的活力表达DDT类农药的雌激素作用强度。结果DDT类农药能像配体一样与hER结合,发挥雌激素效应,并具有剂量-效应关系;o,p′-DDT雌激素活性较强,EC50为5.30×10-7mol/L,p,p′-DDE雌激素活性较弱,EC50为9.28×10-5mol/L,同分异构体间(o,p′-DDT、p,p′-DDT)雌激素活性具有协同效应,联合效应相加指数(AI)为1.5;同系物间(p,p′-DDD、p,p′-DDE)雌激素活性具有拮抗效应,AI=-1.38;4种DDT类农药联合雌激素效应呈协同作用,回归方程为y^=2.6006x2-28.079x-21.757,EC50为2.57×10-8mol/L,AI=0.83。结论DDT类农药是经雌激素受体(ER)介导的环境雌激素,p,p′-DDT、o,p′-DDT、p,p′-DDD、p,p′-DDE联合效应拟雌激素活性呈协同激活作用。

DDT类农药同分异构体和同系物的联合雌激素效应

[目的]研究DDT类农药同分异构体和同系物的联合雌激素效应。[方法]用重组人雌激素受体（hER）基因酵母细胞（W303—1A／hER—ERE—LacZ）评价DDT农药同分异构体和同系物的雌激素活性。将终浓度为10^-4-10^-15的17β-雌二醇、终浓度为10^-3-10^-9的p，p＇-DDT、o，p＇-DDT和p，p＇-DDD、p，p＇-DDE加入酵母细胞培养液，作用4h，通过定量测定β-半乳糖苷酶的活性表示DDT农药的雌激素作用强度。[结果]o，p-DDT和p，p＇-DDD能像配体一样与hER结合，发挥雌激素效应，并且具有剂量效应关系，回归方程分别为^y=1．4553x^2＋47．366x＋333．31和^y=-0．1658x^3．6506x^2—23．176x-25．809。同分异构体间比较，o，p＇-DDT相对雌激素活性较强，EC50为2．04×10^-7mol／L，而p，p-DDT的EC50为3．71×10^-4mol／L，两者雌激素作用呈协同效应，联合效应相加指数（AI）=0.74（〉0）；同系物间比较，P，P＇-DDD雌激素活性明显较强，EC50为2．78×10^-7mol／L，而p，p＇-DDE的EC50为5．88×10^-5mol／L，两种同系物的雌激素作用呈拮抗效应．AI=-1．13（〈0）。[结论]o，p-DDT和p，p＇-DDD是经雌激素受体（ER）介导的环境雌激素，o，p-DDT与p，p＇-LDDT同分异构体间雌激素活性具有协同效应，p，p-DDD和p，p-DDE同系物间雌激素活性呈拮抗效应。

新型人雌激素受体(hERα)变异体的克隆及在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的核定位

本研究通过提取人雌激素受体(hERα)阴性的人乳腺癌组织RNA,半巢式RT-PCR扩增获得一种新的hERα变异体ERα30的完整编码序列,并构建pEGFP-N1-ERα30融合表达载体转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231,荧光显微镜观察ERα30的表达及亚细胞定位。结果表明,ERα30的开放阅读框编码271个氨基酸的蛋白质,预测分子量为30 kD,该变体缺乏LBD/AF2结构域,在其C端具有一段特殊的10个氨基酸的结构域;ERα30-EGFP融合蛋白在MDA-MB-231细胞的表达主要分布于细胞核;对ERα30的深入研究有望为乳腺癌的基础与临床研究中有关雌激素效应和ERα功能的问题提供更多的解释。

基于共转染的植物雌激素活性成分筛选方法的建立与应用

目的:建立一种以共转染为基础的、高效灵敏的植物雌激素活性成分的细胞筛选方法,应用此方法研究鹰嘴豆提取部位的雌激素效应。方法:RT-PCR方法扩增人雌激素受体α(hERα)cDNA,并构建哺乳细胞表达载体pERα。将此载体与含有雌激素应答序列(3×ERE)的Luc报告基因载体(pERE-Luc)以不同比例共转染MCF-7细胞,比较不同比例下Luc的活力,确定最佳共转染比例。用芒柄花素、鹰嘴豆豆芽素A和染料木素等植物雌激素验证了该模型的灵敏性,并进一步测定了鹰嘴豆不同提取部位的Luc活力。结果:将pERα与pERE-Luc共转染MCF-7细胞,与pERE-Luc单转染相比,显著提高Luc的活力,且在10∶1(pERE-Luc∶pERα)时活力最高,Luc活力提高了5倍。用此转染比例测定芒柄花素、鹰嘴豆豆芽素A和染料木素等植物雌激素Luc活力测定结果表明,共转染能诱导Luc的表达,且ER特异性抑制剂ICI 182,780能抑制其活性。利用此模型发现鹰嘴豆的70%乙醇总提取物、乙酸乙酯部位和石油醚部位均具有大量的雌激素活性物质。ICI 182,780能有效抑制其雌激素效应。结论:成功建立了一种共转染为基础的植物雌激素活性成分的筛选方法,该方法具有较高的特异性和灵敏性,可用于植物雌激素活性成分的筛选。

利用酵母双杂合系统筛选与hERRα1相互作用的蛋白质

目的 利用酵母双杂合系统筛选乳腺组织中与人雌激素受体相关受体α1(Humanestrogenreceptorrelated receptorα1,hERRα1)相互作用的蛋白质 ,特别是新的核受体辅助活化因子 ,以进一步研究核受体辅助活化因子在乳腺癌发生、发展中如何参与ERR1调控基因的表达。方法 以质粒pGBT9 hERRα1 LBD为“诱饵” ,筛选人乳腺组织cDNA文库。结果 筛得有阳性相互作用的克隆共 17个。除 3种为已知核受体辅助调节因子外 ,其他为功能已经明确的蛋白 ,其中有3种与hERRα1有明显相互作用。结论 核受体辅助活化因子SRC 1,RIP14 0 。

hERR1在乳腺癌中的表达及其对芳香族化酶表达的调控

目的 了解hERR1在乳腺癌及癌旁组织中的表达情况 ,以及它对芳香族化酶基因表达的调节作用。方法 收集乳腺癌患者的临床标本 ,应用RT PCR法 ,研究癌组织及相应的癌旁组织中hERR1的表达情况 ;采用瞬时转染和CAT活性分析的方法 ,研究hERR1对芳香族化酶基因表达的调节。结果 hERR1在癌组织中的表达明显高于相应的癌旁组织 (16 2 6例 ) ;hERR1以剂量依赖方式促进芳香族化酶启动子Ⅰ 3活性。结论 hERR1在体内可能起到促进乳腺癌生长的作用。

对烷氧基苯酚类物质(p-AOPs)的雌激素活性

对烷氧基苯酚(p-AOPs)是一类广泛应用于化工业、制药业、化妆品等领域的苯酚类化合物,其结构与具有雌激素活性的烷基酚类物质相似,但目前对于p-AOPs的雌激素活性尚未见文献报道.本文利用分子对接技术,预测了常见p-AOPs在人雌激素受体α(hERα)激动剂口袋中的结合情况,发现p-AOPs能够很好地与hERα结合,其酚羟基能够与hERα的Glu353和Arg349形成氢键,疏水区域可以与Phe404等疏水氨基酸产生疏水相互作用;通过磷酸对硝基苯酚法对8种p-AOPs的雌激素活性进行分析,发现4-苯氧基苯酚(PhOP)、4-戊氧基苯酚(PeOP)、4-苄氧基苯酚(PBP)具有较强的雌激素活性,其EC_(50)值分别达到9.41×10^(-7)、1.89×10^(-6)和2.68×10^(-6) mol·L^(-1).与典型环境雌激素双酚A(BPA)的雌激素活性相比, PhOP活性明显强于BPA,而PeOP和PBP与BPA接近.通过分析不同烷基碳链长度的p-AOPs的雌激素活性发现,烷基链碳数在1～5个范围内,碳链越长雌激素活性越大.鉴于p-AOPs具有较强雌激素活性,且其广泛应用于与人体密切接触的一些领域,建议进一步加强对这类物质的人体暴露量、内分泌干扰危害和健康风险的研究.

雌二醇通过ERβ调控ERK磷酸化影响细胞增殖和凋亡

目的探究雌二醇(E2)结合其重组人雌激素受体β(ESR2)对C28I2细胞增殖和凋亡的效应。方法PCR扩增ESR2序列并构建腺病毒重组质粒pAd-ESR2,在HEK293细胞中包装重组腺病毒Ad-ESR2。用Ad-ESR2和ESR2-siRNA处理人正常软骨细胞C28I2,分别设置对照组(C28I2+DMSO)、E2组(C28I2+E2)、Ad-ESR2组(C28I2+DMSO+Ad-ESR2)、E2+Ad-GFP组(C28I2+E2+Ad-GFP)、E2+Ad-ESR2组(C28I2+E2+Ad-ESR2)、E2+sicontrol组(C28I2转染sicontrol+E2)、E2+ESR2-si1组(C28I2转染ESR2-si1+E2)、E2+ESR2-si3组(C28I2转染ESR2-si3+E2)。免疫印迹测定ER Stress和细胞凋亡相关蛋白表达,qRT-PCR检测增殖相关标志基因的表达,借助EdU试剂盒和流式细胞术测定细胞增殖和凋亡情况。使用ERK通路抑制剂U0126分别设定E2组、E2+U0126组(C28I2+E2+U0126)、E2+Ad-ESR2组、E2+Ad-ESR2+U0126组(C28I2+E2+Ad-ESR2+U0126)。通过免疫印迹实验探究C28I2细胞中E2通过ERβ调控ERK信号通路影响ER stress和凋亡。结果成功构建过表达腺病毒Ad-ESR2和靶向ESR2的siRNA;过表达Ad-ESR2能够促进E2处理后IRE1α[1.20±0.06 vs 0.95±0.05,P<0.05]、PERK[1.29±0.04 vs 1.03±0.02,P<0.05]和XBP1s[1.17±0.03 vs 0.82±0.02,P<0.05]的表达,促进凋亡Cleaved Caspase12(P<0.05)、抑制增殖相关标志基因PCNA(P<0.05)、CyclinB1(P<0.05)、CyclinD1(P<0.05)的表达,且ERK磷酸化激活降低(P<0.05);转染ESR2-siRNA后,细胞的内质网应激相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的表达降低,与细胞增殖相关的基因被上调,且细胞内pERK/ERK比值相对增加。经特异性ERK通路抑制剂U0126处理后,雌二醇结合ERβ促进的内质网应激蛋白及细胞凋亡蛋白的表达被拮抗。结论雌二醇靶向ERβ通过激活ERK通路磷酸化调控内质网应激及凋亡,进而抑制软骨细胞增殖。

16α取代雌二醇衍生物的三维定量构效关系和分子对接研究

采用比较分子力场方法(CoMFA)及分子对接方法对一系列雌二醇衍生物的3D-QSAR及其与受体作用方式进行研究,建立了3D-QSAR的CoMFA模型,获得了化合物的相对亲合力RBA(Relative Binding Affinity)与静电场及立体场分布之间的关系;CoMFA模型的统计学参数为:q^2=0.667,r^2=0.939,SD=0.280,F=49.033,立体场与静电场的贡献分别为56.8%和41.6%。相对亲合力小的化合物一般带有较大的取代基,其对接能量得分较低;相对亲合力大的化合物一般带有较小的取代基,其对接能量得分较高。化合物的对接能量得分和相对亲合力之间有良好的线性关系,其线性相关系数R为0.890。活性口袋周围的环境也与3D-QSAR的立体场分布相匹配。对接结果还显示这类化合物和雌激素的结合主要是通过氢键作用来实现,即3-OH与R394上的氨基以及17-OH与受体残基H524咪唑环上的氮形成的氢键。

负载ERRα基因片段慢病毒构建及表达

目的构建编码人雌激素相关受体α(hERRα)的慢病毒载体,并测定其滴度,观察hERRα基因在体外的表达情况及其对人肺癌细胞A549增殖的影响。方法采用PCR扩增hERRα基因片段,插入转移载体pW-PXLD,用磷酸钙法将pWPXLD-hERRα、psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒,浓缩后测定病毒滴度,再将病毒感染A549细胞,用蛋白印迹方法测定感染病毒的A549细胞中hERRα的表达。选择合适滴度的病毒感染A549细胞,采用cell-titer的方法检测感染病毒的A549细胞的活力。结果测序结果显示成功构建了重组质粒pWPXLD-hERRα,测定浓缩后的病毒滴度为1.8×108TU/mL,蛋白印迹方法检测到慢病毒感染的A549细胞中hERRα呈阳性表达;cell-titer glo检测结果表明过表达hERRα能促进细胞增殖。结论成功构建了负载hERR基因片段的慢病毒,hERRα能在感染的A549细胞中高效表达,并促进感染病毒的A549细胞增殖。

GFP-hERα重组质粒的构建及蛋白表达和细胞内定位的研究

目的构建hERα真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法以pcDNA3.1-flag-hERα重组质粒(Dr.Muyan M馈赠)为模板,PCR扩增hERα全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体。将构建的重组质粒测序并转染到乳腺癌细胞MCF-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-hERα在MCF-7细胞内定位。结果 hERα全长基因序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为1800bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为95KD,pEGFP-hERα在乳腺癌细胞MCF-7细胞内定位于细胞核内。结论成功的构建了hERα全长基因真核表达载体pEGFP-hERα,融合蛋白定位于乳腺癌细胞核内。