脱氧雪腐镰刀菌烯醇对人食管上皮细胞TAP-1和LMP-2表达的影响

目的：探讨不同浓度脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）处理,体外原代培养的人正常食管上皮细胞TAP-1、LMP-2表达的变化。方法：采用Western blot和RT-PCR技术从蛋白水平和mRNA水平上分析不同浓度的DON处理24小时,体外培养的人正常食管上皮细胞TAP-1、LMP-2分子表达的变化规律及其量-效关系。结果：不同浓度（50、100、1 000、2 000μg/L）DON处理人食管上皮细胞24小时后,DON各处理组食管上皮细胞TAP-1蛋白的Western blot半定量检测结果分别为0.47±0.22、0.28±0.16、0.24±0.18和0.21±0.19,统计分析表明DON 100、1 000、2 000μg/L处理组与对照组相比差异有统计学意义（P〈0.05）。相关分析表明,在0~2000μg/L浓度范围内,随DON处理浓度增高,食管上皮细胞TAP-1蛋白的表达量逐渐降低（r=-0.595,n=4,P〈0.01）。RT-PCR结果发现,经不同浓度DON处理食管上皮细胞TAP-1mRNA的相对表达量虽然呈现先升高后降低的趋势,但与对照组相比无统计学差异。DON各处理组LMP-2蛋白的Western blot半定量检测结果分别为2.25±1.03、3.31±1.35、1.90±1.19和2.12±0.22均高于空白对照组（0.91±0.21）,其中100μg/L处理组相对表达量最高,差异有统计学意义（P〈0.05）。RT-PCR结果,DON 100μg/L处理组的LMP-2 mRNA的相对表达量最高为2.23±0.56,明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。其余处理组差异无统计学意义。结论：DON可剂量依赖地抑制体外培养的人正常食管上皮细胞的TAP-1蛋白的表达,但对TAP-1的mRNA未见显著影响。DON（100μg/L）可以促进食管上皮细胞LMP-2蛋白和mRNA表达,其余各浓度未见明显影响。

4种交链孢毒素对人食管上皮细胞Het－1 A的体外毒性研究

目的研究交链孢酚(AOH)、交链孢酚单甲醚(AME)、交链孢菌酮酸(Te A)和腾毒素(TEN)4种交链孢毒素对人食管上皮细胞Het-1 A的体外急性毒性作用。方法将Het-1 A用不同浓度的4种交链孢毒素处理,分别采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin VFITC/PI)双染法、PI单染法和分光光度法研究其对Het-1 A的增殖抑制、细胞凋亡、周期分布和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)活性的影响。结果 4种交链孢毒素对Het-1 A的半数抑制浓度(IC--_(50))值分别为54.31、43.38、121.91和141.96μmol/L,均可引起细胞凋亡,并可通过引起G_2-M期比例上升而影响细胞的周期分布。AOH和AME可通过剂量依赖增强caspase-3活性引发细胞凋亡。结论 AOH、AME、Te A和TEN可通过抑制细胞增殖、引起细胞凋亡、诱导G_2-M周期阻滞等对Het-1 A产生急性毒性。

微囊藻毒素-LR对人正常食管上皮细胞凋亡及对Caspase-3和Caspase-9蛋白表达的影响

目的:研究微囊藻毒素-LR对人正常食管上皮细胞活力及凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-9表达的影响,为探讨其诱导凋亡的途径提供依据。方法:分别用不同浓度(1、3.75、7.5、15、30、50μg/m L)微囊藻毒素-LR处理人正常食管上皮HEEC细胞24h,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力,计算半数抑制浓度(IC)以确定后续实验的MC-LR浓度。进一步用0、6、12、24 50μg/m L微囊藻毒素-LR处理细胞,采用PI-Annexin V双染法检测细胞凋亡,Western blot检测Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达水平。结果:与对照组比较,3.75~50μg/m L的微囊藻毒素-LR均可使人正常食管上皮细胞活力降低(P均<0.01),测定得出IC为24 50μg/m L。因此,选择6、12和24μg/m L的MC-LR用于后续实验。用6~24μg/m L微囊藻毒素-LR处理细胞24 h后,细胞凋亡率升高(P<0.05或P<0.01),Caspase-3和Caspase-9蛋白表达增加(P均<0.01)。结论:微囊藻毒素-LR可以诱导人正常食管上皮细胞凋亡,且可能与细胞凋亡相关的信号分子Caspase-3和Caspase-9的激活有关。

黄曲霉毒素G_1对原代培养人食管鳞状上皮细胞HLA-Ⅰ分子表达影响的研究

目的探讨黄曲霉毒素G1(AFG1)对体外培养的人食管鳞状上皮细胞表面HLA-Ⅰ分子表达的影响。方法采用原代培养、免疫印迹(Western blot)和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析方法研究不同浓度AFG1(50、100、1000和2000μg/L)处理后人食管鳞状上皮细胞表面HLA-Ⅰ分子表达的变化。结果免疫印迹结果表明,经不同浓度AFG1(50、100、1000、2000μg/L)处理细胞24h后,100、1000、2000μg/L AFG1处理组HLA-ABC的蛋白表达均明显低于溶剂对照组(P<0.05),而且在100～2000μg/L浓度范围内,人食管鳞状上皮细胞表面HLA-Ⅰ分子的表达逐渐降低,两者呈明显的负相关关系(r=-0.921,n=3,P<0.01)。RT-PCR检测在mRNA水平进一步证实了AFG1对HLA-ABC表达的影响。其中100、1000、2000μg/L AFG1处理细胞后,HLA-A mRNA的表达明显低于溶剂对照组(P<0.05);2000μg/L处理组HLA-B mRNA的表达较溶剂对照组降低(P<0.05);而各AFG1处理组HLA-C mRNA的表达没有明显影响。结论 AFG1处理可以抑制人食管鳞状上皮细胞表面HLA-Ⅰ分子的表达。

MCC950抑制HEECs细胞NLRP-3炎症小体活化及焦亡的作用机制研究

目的探讨NOD样受体蛋白-3(NOD-like receptor protein 3,NLRP-3)炎症小体抑制剂MCC950抑制人食管上皮细胞(human esophageal epithelial cells,HEECs)氧化应激、炎症和焦亡的作用及相关机制。方法HEECs细胞经传代培养,分为空白对照组、酸刺激组(使用pH=4酸性培养基每日刺激3次,每次15 min,培养48 h)、胆盐刺激组(加入400μmol/L胆盐混合物,每日刺激3次,每次15 min,培养48 h)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)组(加入10μL 100 ng/mL浓度的LPS孵育刺激48 h)、MCC950组(加入10μL 7.5 ng/mL浓度的MCC950孵育4 h后,加入酸、胆盐酸及LPS刺激HEECs细胞并孵育48 h)以及抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-Lcysteine,NAC)组(加入1 mmol/L NAC并孵育4 h后,加入酸、胆盐及LPS刺激HEECs细胞并孵育48 h),每组3个培养皿。采用实时定量逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blotting)实验分别检测氧化应激指标Nox-4(NADPH oxidase 4)、抗氧化蛋白指标[抗氧化蛋白核因子E2相关因子2(nuclearfactor erythroidderived 2-like 2,Nrf-2)和超血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)]、NLRP-3信号通路[NLRP-3/半胱天冬酶(caspase)-1/白细胞介素(intereukin,IL)-1β/IL-18]及细胞焦亡通路[caspase-4/caspase-5/GSDMD]指标的mRNA和蛋白表达水平;通过Hoechst33342染色观察细胞凋亡情况。结果MCC950干预(0.023)以及NAC干预(0.031)有效抑制酸(0.042)、胆盐(0.047)和LPS(0.054)诱导的HEECs凋亡。RT-PCR结果显示,MCC950干预以及NAC干预显著抑制酸(2.40)、胆盐(3.07)和LPS(3.52)诱导的HEECs细胞中Nox-4 mRNA(MCC950:1.68;NAC:1.62)的高表达,并显著上调抗氧化蛋白Nrf-2(MCC950:0.72;NAC:0.57)和HO-1(MCC950:0.74;NAC:0.57)的mRNA表达水平。MCC950干预以及抗氧化剂NAC干预有效地抑制酸刺激、胆盐刺激和LPS诱导的HEECs细胞中NLRP-3(MCC950:1.58;NAC:1.47)、ASC(MCC950:1.56;NAC:1.93)、caspase-1(MCC950:1.64;NAC:1.96)、IL-1β(MCC950:1.66;NAC:1.82)、IL-18(MCC950:1.58;NAC:1.84)的mRNA表达水平。MCC950干预以及NAC干预有效地抑制酸刺激、胆盐刺激和LPS诱导的HEECs细胞中caspase-4(MCC950:1.51;NAC:1.61)、caspase-5(MCC950:1.38;NAC:1.64)和GSDMD(MCC950:1.41;NAC:1.54)的mRNA表达水平。蛋白电泳结果类似。结论酸、胆盐及LPS均可诱导HEECs过量表达氧化应激指标,下调抗氧化蛋白表达,进而活化NLRP-3炎症小体信号通路及细胞焦亡通路,促进细胞的炎症损伤,而MCC950对其发生具有保护作用。

人乳头状瘤病毒转染对甲基硝基亚硝基胍致人食管上皮Het-1A细胞增殖及凋亡的影响

[目的]研究转染人乳头状瘤病毒18型(HPV18)后,甲基硝基亚硝基胍(MNNG)暴露对人食管上皮Het-1A细胞周期和增殖、凋亡功能的影响。[方法]通过慢病毒介导稳定转染HPV18 E6、E7基因到人食管上皮Het-1A细胞中,荧光定量PCR检测E6和E7相对表达量后得到稳定表达株。应用MTT法观察MNNG(0、1、5、10μmol/L)染毒处理24 h后对转染组和对照组细胞增殖功能的影响。应用流式细胞术检测转染组和对照组细胞染毒后细胞周期和凋亡的变化。[结果]HPV18转染组与对照组相比,细胞增殖能力增强,G1期延长,S期缩短(P<0.05),且凋亡率下降(P<0.05)。非转染细胞中MNNG染毒各组与未染毒组相比,细胞增殖活性受到抑制,G1期延长,细胞凋亡率增加(P<0.05)。HPV18转染后MNNG暴露,可导致G2期延长;MTT检测细胞增殖结果显示HPV18转染组细胞在MNNG作用下,细胞存活率均高于同浓度MNNG单独暴露的非转染组细胞;中、低浓度MNNG暴露后HPV18转染组较未转染组相比细胞凋亡率降低(P<0.05)。[结论]Het-1A细胞转染HPV18后暴露MNNG,细胞凋亡受到一定程度抑制,促进细胞增殖。由此可能导致细胞不断积累MNNG引起的基因突变和DNA损伤。