DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人食管癌细胞株Eca109的影响

目的:探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-CdR)对人食管癌细胞株Eca109增殖作用的影响。方法:应用不同浓度(10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)的特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-CdR,于不同作用时间(24～168h)处理人食管鳞癌细胞株Eca109,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定5-aza-CdR作用下Eca109细胞株的生存率,倒置显微镜观察细胞的形态学变化。结果:不同药物浓度组在同一作用时间下,细胞株生存率差异有统计学意义(P<0.05);同一药物浓度不同作用时间组之间(24～96h)的细胞生存率差异也有统计学意义(P<0.05),且96h时对人食管鳞癌细胞株Eca109生长抑制作用最明显。形态学观察显示:癌细胞体积缩小,核固缩,染色质凝聚成块。结论:5-aza-CdR有抑制人食管癌细胞株Eca109生长的作用,抑制作用呈时间依赖性及浓度依赖性;并且干预后癌细胞呈现典型的凋亡细胞形态改变。

吴茱萸碱增强Eca-109食管鳞癌细胞的放射敏感性

目的探讨吴茱萸碱(Evo)对Eca-109食管鳞癌细胞放射敏感性的影响,探索其可能机制。方法采用MTT法检测(10、20、40、60、80、100、120)μg/m L吴茱萸碱对Eca-109细胞生长的抑制作用,确定最佳处理剂量。实验分为放射组(仅给予0、2、4、6、8 Gy X线照射处理)、联合组(给予80μg/m L吴茱萸碱和0、2、4、6、8 Gy X线照射处理),克隆形成实验检测吴茱萸碱对Eca-109细胞克隆形成能力的影响,流式细胞术检测细胞周期;Western blot法检测Eca-109细胞中Ku70、Ku80、DNA激活蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)、DNA双链修复蛋白Rad51蛋白水平。结果吴茱萸碱呈剂量依赖性抑制Eca-109细胞的生长,80μg/m L吴茱萸碱的抑制作用最大。克隆形成实验结果显示80μg/m L吴茱萸碱联合放射治疗后,平均致死剂量(D0)、准域剂量(Dq)值显著小于单纯放射时的值,放射增敏比(SER)为1.86±0.06,拟合的生存曲线左移。吴茱萸碱可减少放射诱导的细胞G2/M期阻滞,可显著抑制放射诱导的Ku70、Ku80、DNA-PKcs、Rad51蛋白上调。结论吴茱萸碱具有增加食管鳞癌细胞株Eca-109放射敏感性的作用,可能与抑制细胞周期G2/M期阻滞和降低DNA损伤修复蛋白表达水平有关。

lncRNA NUP50-AS1在食管鳞癌组织中的表达及其对Eca109细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)NUP50-AS1在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell cancer, ESCC)组织及细胞株中的表达及其对人食管癌Eca109细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:选取自2015年1月至2016年12月河北医科大学第四医院生物标本库的49例ESCC手术患者的癌组织和相应癌旁组织,qRT-PCR检测ESCC癌组织、癌旁组织及5种食管癌细胞株(TE1、TE13、Eca109、Kyse150和Kyse170)中NUP50-AS1表达水平。shRNA转染NUP50-AS1后,选用sh2-NUP50-AS1进行后续功能实验。采用MTS法、克隆形成实验检测敲减NUP50-AS1表达对Eca109细胞增殖的影响,划痕实验检测敲减NUP50-AS1表达对细胞迁移的影响,Transwell小室实验检测敲减NUP50-AS1表达对细胞侵袭的影响。结果:NUP50-AS1在ESCC组织中的相对表达量显著高于癌旁组织(2.003±0.870 vs 1.000±0.000,P<0.05);NUP50-AS1在ESCC组织中的表达水平与淋巴结转移及TNM分期相关(均P<0.01),NUP50-AS1在5株食管癌细胞系中相对表达量均明显上调(P<0.05),其中Eca109细胞的NUP50-AS1表达水平最高。转染后,sh2-NUP50-AS1转染组干扰效率最高,敲低NUP50-AS1可明显抑制Eca109细胞增殖、迁移和侵袭能力。结论:ESCC组织中lncRNA NUP50-AS1表达明显高于癌旁组织,且与癌症分期和淋巴结转移有关,敲减其表达明显抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,NUP50-AS1的高表达可能与ESCC的发生发展密切相关。

LINC01140通过miR-452-5p/Wnt/β-catenin轴调控食管鳞状细胞癌Eca109细胞的增殖与侵袭

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)LINC01140在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)组织及细胞中的表达及其对Eca109细胞增殖与侵袭的影响及其分子机制。方法:选取2012年3月至2015年5月河北医科大学第四医院收治的133例ESCC患者的临床资料和GEPIA数据库中收集的182例ESCC组织及286例食管正常黏膜组织的LINC01140表达数据,以及ESCC细胞系Kyse150、Eca109和TE13。用qPCR法检测癌组织和细胞中LINC01140的表达水平,分析其表达水平与患者临床病理特征及预后的关系。分别将pcDNA3.1-LINC01140、阴性对照(pcDNA3.1-NC)或miR-452-5p mimic及阴性对照(miR-NC)转染到Eca109细胞,MTS、Transwell实验分别检测细胞的增殖与侵袭能力。用双荧光报告基因实验及TOP/FOP报告基因系统检测LINC01140与miR-452-5p的靶向结合作用及LINC01140对Wnt/β-catenin通路活化水平的影响。结果:LINC01140在ESCC组织和细胞中表达均显著下调(均P<0.01),LINC01140低表达与ESCC患者年龄、淋巴结转移、TNM分期及OS密切相关(均P<0.05)。LINC01140过表达明显抑制Eca109细胞的增殖及侵袭能力(均P<0.01)。机制研究表明,LINC01140可能通过竞争结合miR-452-5p影响Wnt/β-catenin信号通路的活化水平继而调控Eca109细胞的恶性生物学行为。结论:LINC01140通过靶向miR-452-5p/Wnt/β-catenin轴促进ESCC细胞的增殖与侵袭能力,其有望成为ESCC患者靶向治疗的潜在靶点及预后评估的标志物。

p15^(INK4B)基因转染对人食管鳞癌细胞EC109增殖的抑制作用

目的:探讨p15INK4B(p15)基因转染对食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖的影响.方法:根据转染质粒的不同和是否进行质粒转染分为3组:p15转染组,空载体转染组,未转染组.应用PCR检测外源性p15基因,Westernblot方法检测转染细胞的P15蛋白变化:流式细胞仪分析细胞周期变化,应用MTT、集落形成实验、流式细胞仪和透射电镜检测转染外源p15基因对EC109细胞增殖和凋亡的影响.结果:p15转染细胞存在外源p15基因,并有P15蛋白高表达;EC109-p15细胞生长速度低于对照细胞EC109-空载体组和未转染组,集落形成率显著低于对照细胞EC109-空载体组和未转染组(20.8±1.3%vs54.3±3.2%,56.8±2.3%,P<0.01);流式细胞仪观察到P15蛋白高表达使EC109细胞发生G1/S阻滞,G1期细胞比例显著高于空载体组和未转染组(62.4±7.1%vs38.0±5.8%,34.4±1.0%,P<0.01),S期比例显著低于空载体组和未转染组(21.1±1.3%vs35.5±2.4%,36.3±0.7%,P<0.01),并出现亚G1峰(凋亡峰).透射电镜亦发现p15转染组发生细胞凋亡.结论:p15基因转染可以抑制人食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖并能诱导其发生细胞凋亡.

食管鳞状细胞癌组织中BTG-1的表达及其对食管鳞状细胞癌细胞株EC9706凋亡的影响

目的分析食管鳞状细胞癌组织中B细胞转位基因1(BTG-1)的表达及其对食管鳞状细胞癌细胞株EC9706凋亡的影响。方法选取郑州大学第一附属医院2014年1月～2017年12月存档的164个鳞状细胞癌存档手术或内镜活检蜡块、76个癌旁正常组织手术蜡块作为研究对象,采用免疫组化法、原位杂交检测BTG1蛋白表达并分析其与病理参数的关系;建立BTG-1过量表达细胞株,Anncxin V-FITC/PI双标记流式细胞仪检测人食管鳞状细胞癌细胞株EC9706的凋亡情况。结果食管鳞状细胞癌组织BTG-1蛋白、信使核糖核酸(m RNA)阳性表达率低于癌旁正常组织(χ～2=32.718、55.729,均P<0.001);且有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、组织学分级Ⅱ～Ⅲ级标本中BTG-1蛋白、m RNA阳性表达率显著较低(χ～2=29.078、5.970、7.660、31.127、8.624、10.624,均P<0.001);且BTG-1组早期细胞凋亡率显著高于空白对照组(t=15.484,P<0.001)。结论食管鳞状细胞癌组织中BTG1的表达显著低于癌旁正常组织,且其与有无淋巴结转移、TNM分期、组织学分级的关系密切,BTG-1高表达或可促进食管鳞状细胞癌细胞凋亡。

奥曲肽对食管癌细胞株Eca9706增殖的影响

目的 研究奥曲肽对食管癌细胞株Eca970 6增殖的影响。方法 将不同浓度的奥曲肽加入食管癌细胞 ,用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法测定细胞生长抑制效应 ,3 H -胸腺嘧啶核苷 (3 H -TdR)掺入实验测定对DNA合成的影响 ,显微镜下观察细胞形态变化 ,流式细胞仪 (FCM )检测细胞周期。结果 奥曲肽对Eca970 6细胞的生长及DNA合成均有抑制作用 ,显微镜下可见明显的细胞病变 ,细胞变圆、变小、脱落 ,FCM显示奥曲肽作用后 ,G0 /G1期细胞增多 ,S期、G2 /M期细胞减少。结论 奥曲肽能明显抑制食管癌细胞株Eca970 6的DNA合成 ,并能形成G0 /G1期阻滞 ,使细胞存活率下降 ,表明奥曲肽显著抑制Eca970 6的增殖。

PTPN6基因对人食管鳞状细胞癌Eca109和Yes-2细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶6(non-receptor protein tyrosine phosphatase 6,PTPN6)基因在不同食管鳞状细胞癌细胞株中的表达及其对Eca109、Yes-2细胞恶性生物学行为的影响。方法:应用qPCR法检测不同食管鳞癌细胞株(TE1、Eca109、Kyse150、Kyse170、Yes-2)中PTPN6 m RNA的表达水平,以pcDNA3.1-PTPN6质粒分别瞬时转染食管鳞癌细胞株Eca109和Yes-2,应用qPCR和Wb法检测PTPN6 m RNA和蛋白的表达水平,并应用MTS、克隆形成实验、划痕实验和Transwell法检测过表达PTPN6基因对食管鳞癌细胞恶性生物学行为的影响。结果:PTPN6基因在5种食管鳞癌细胞侏中表达均明显下调(均P<0.05)。与转染空载体的对照组相比,经pcDNA3.1-PTPN6转染后,Eca109和Yes-2细胞均高水平表达PTPN6(P<0.05或P<0.01);过表达PTPN6基因后,Eca109和Yes-2细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显被抑制(均P<0.05)。结论:PTPN6基因高表达能抑制食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭,其可能是影响食管鳞癌细胞生物学特性的一个重要因素。

miRNA-25对人食管鳞状细胞癌细胞株TE1增殖的影响

目的:探讨过表达/沉默微小RNA-25(microRNA-25,miRNA-25)对人食管鳞状细胞癌细胞株TE1增殖能力的影响及其作用机制。方法:RT-PCR检测各临床样品组织中miRNA-25的表达水平。建立miRNA-25过表达/沉默的TE1细胞株,采用CCK-8法、Brd U实验和流式细胞术检测TE1细胞增殖能力的变化及细胞周期状态;Western blot法和RT-PCR法检测细胞周期调控因子细胞周期蛋白E1(cyclin E1)和细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)的蛋白与mRNA表达水平。结果:miRNA-25在食管黏膜组织中具有特异性表达并在TE1细胞中呈高表达。CCK-8法和Brd U实验结果显示过表达miRNA-25的TE1细胞的增殖能力显著增加(P<0.05),而沉默miRNA-25抑制TE1细胞的增殖;流式细胞术检测结果显示过表达miRNA-25可明显促进TE1细胞从G0/G1期向S期转换,沉默miRNA-25则抑制其转换。同时Western blot和RT-PCR实验结果显示过表达miRNA-25后,cyclin E1和CDK2的蛋白和mRNA表达水平均显著增加(P<0.05),沉默miRNA-25后则显著减少(P<0.05)。结论:miRNA-25能够促进人食管鳞状细胞癌细胞株TE1的增殖,其作用机制可能与促进细胞周期转换及上调cyclin E1和CDK2的表达水平有关,提示miRNA-25可作为治疗食管鳞状细胞癌的一个潜在靶点。

过表达lncRNA LINC00886抑制食管鳞状细胞癌Eca109细胞的恶性生物学行为

目的:检测lncRNA LINC00886在食管鳞状细胞癌(ESCC)组织及细胞系中的表达及其对Eca109细胞体外增殖、迁移及侵袭的影响。方法:收集2014年6月至2016年12月河北医科大学第四医院生物标本库69例ESCC手术患者的癌及对应的癌旁组织标本,以及ESCC细胞系Eca109、TE13、TE1、Kyse150、Yes-2和Kyse170,用qPCR法检测LINC00886在ESCC组织及细胞系中的表达情况。分别用pIRES2-LINC00886、p IRES2-NC转染Eca109细胞,用qPCR法检测pIRES2-LINC00886转染Eca109细胞后LINC00886的过表达效率;用MTS、克隆形成实验、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验分别检测过表达LINC00886对Eca109细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。结果:在ESCC组织中LINC00886表达水平明显低于癌旁组织(P<0.01),其表达水平与肿瘤TNM分期和淋巴结转移相关(均P<0.05)。LINC00886在ESCC细胞中的表达水平也低于对照组(均P<0.01)。转染pIRES2-LINC00886后,Eca109细胞中LINC00886的表达水平显著高于对照组(均P<0.05)。与对照组相比,过表达LINC00886明显抑制Eca109细胞的增殖、迁移和侵袭能力(均P<0.01)。结论:lncRNA LINC00886低表达可能与ESCC的发生发展相关,过表达LINC00886可抑制ESCC细胞的增殖、迁移与侵袭能力。

食管鳞癌细胞系EC109射线照射后miRNAs和DNA-PKcs的变化及相关性分析

目的探讨食管鳞癌细胞X-Ray照射后miR-126、miR-21、miR-101的表达情况及其与DNA损伤修复基因DNA-PKcs的关系。方法实时定量PCR检测不同剂量X-Ray照射EC109食管鳞癌细胞株24 h后,miR-126、miR-21、miR-101、DNA-PKcs mRNA和蛋白的表达。结果 X-Ray照射EC109后,miR-126、miR-101和DNA-PKcs mRNA表达升高(P<0.05)。放射照射后DNA-PKcs蛋白水平有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。其中miR-21与DNA-PKcs mRNA表达呈负相关。3个miRNAs表达和DNAPKcs蛋白表达无明显相关性。结论 X-Ray照射后,食管鳞癌细胞系EC109的miR-126和miR-101表达上调,DNA-PKcs mRNA表达上调,miR-21与DNA-PKcs mRNA表达呈负相关。

小干扰RNA抑制ΔNp63α表达对人食管鳞癌细胞生物学特性的影响

目的通过腺相关病毒介导的小干扰RNA(siRNA)抑制人食管鳞癌细胞Eca109中ΔNp63α的表达,观察其对食管鳞癌细胞生物学特性的影响。方法构建H1启动子驱动的表达针对ΔNp63α的siRNA重组腺相关病毒AAV-ΔNp63αshRNA并感染Eca109细胞。同时以感染空腺相关病毒AAV-Null的细胞及不加腺相关病毒的细胞分别作为对照组和空白对照组,观察siRNA干扰ΔNp63α表达在体外及体内对Eca109细胞生长、增殖、致瘤及凋亡的影响。结果与对照组和空白对照组比较,Eca109细胞感染AAV-ΔNp63αshRNA后ΔNp63α蛋白表达下降(P均<0.05),细胞生长速度减慢(P均<0.05),细胞增殖指数(proliferation index,PI)降低(P均<0.01),裸鼠瘤体质量减轻(P均<0.05),细胞凋亡增加(P均<0.05)。结论腺相关病毒介导的siRNA干扰能显著抑制Eca109细胞ΔNp63α的表达,减慢肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长。

辣椒素对食管鳞状细胞癌细胞凋亡和NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

目的:探讨辣椒素对食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)细胞凋亡和NF-κB信号通路的影响。方法:采用Westernblot法检测食管鳞癌EC9706和Eca109细胞中IκBα、磷酸化IκBα(pIκBα)、p50和p65蛋白的表达及0、50、100和200μmol/L辣椒素作用后pIκBα和Bcl-2蛋白的表达;凝胶滞留实验检测2种食管鳞癌细胞胞核中NF-κB与DNA的结合活性及0、100和200μmol/L辣椒素作用对NF-κB与DNA结合活性的影响。2种食管鳞癌细胞分别分为对照组、5-FU组、辣椒素组和联合组,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果:2种食管鳞癌细胞胞质均表达IκBα和pIκBα蛋白,胞核均表达p50和p65蛋白;随辣椒素作用浓度的增加,pIκBα和Bcl-2蛋白的表达逐渐下降,NF-κB与DNA的结合活性也逐渐下降。辣椒素可促进2种食管鳞癌细胞的凋亡,与5-FU联合使用时,凋亡细胞显著增加(EC9706:F辣椒素=2535.497,F交互=113.034,P<0.001;Eca109:F辣椒素=5984.040,F交互=5.150,P<0.05)。结论:辣椒素可能通过抑制IκBα的磷酸化阻断NF-κB信号通路,促进食管鳞癌细胞凋亡。

神经生长因子在食管鳞癌细胞中的表达及分泌

目的探讨神经生长因子(NGF)与食管鳞癌细胞分化的相关性。方法采用有限稀释法分选出圆形和梭形单细胞克隆,采用无血清悬浮培养获得细胞球细胞,贴壁的Eca109细胞分别在含血清和不含血清培养基中培养48h;分别采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术和免疫印迹法,检测NGF在食管鳞癌细胞中mRNA水平和蛋白水平的表达;免疫荧光技术检测NGF在食管鳞癌细胞中的表达定位;免疫组织化学法检测食管鳞癌组织中NGF的表达定位;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测NGF在Eca109细胞培养基中的分泌情况。结果在Eca109细胞中能检测到NGF的mRNA水平和蛋白水平的表达,其中NGF在细胞球细胞中的mRNA水平和蛋白水平的表达量最高。食管癌组织中检测到NGF表达于细胞质。Eca109细胞在无血清培养条件下能够分泌NGF,且明显高于含血清培养基中的含量。结论食管癌细胞系Eca109表达并分泌NGF,并且食管癌组织中表达NGF,NGF可能在维持食管鳞状细胞癌的干细胞特性发挥了重要作用。

芝麻酚通过AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路调控食管鳞状细胞癌Eca109细胞的自噬和凋亡

目的:探讨芝麻酚(SEM)通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子1(SIRT1)/核因子κB(NF-κB)通路影响食管鳞状细胞癌(ESCC)Eca109细胞自噬和凋亡的机制。方法:用不同浓度的SEM(0、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400μmol/L)分别处理Eca109细胞、人食管上皮细胞HEEpiC 48 h,CCK-8法检测细胞增殖率,筛选适宜的SEM浓度用于后续实验。将Eca109细胞分为对照组(CK组,0μmol/L)、低剂量SEM组(SEM-L组,25μmol/L)、中剂量SEM组(SEM-M组,50μmol/L)、高剂量SEM组(SEM-H组,100μmol/L)、高剂量SEM+Compound C(AMPK抑制剂)组(SEM-H+Compound C组,100μmol/L+10μmol/L),所有各组Eca109细胞在对应的药物浓度下处理48 h后,CCK-8法检测Eca109细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,透射电镜观察Eca109细胞内自噬小体,WB法检测Eca109细胞中微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、B淋巴细胞瘤2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)、p-AMPK、SIRT1、p-NF-κB p65的表达。结果:通过预实验选择SEM实验浓度为25、50、100μmol/L用于正式研究。在SEM处理下,与CK组比较,SEM-L组、SEM-M组、SEM-H组Eca109细胞的增殖水平(24、48 h)和Bcl2、p-NF-κB p65蛋白表达均显著降低,细胞凋亡率和自噬小体数量、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、BAX、p-AMPK、SIRT1蛋白表达显著升高,且呈剂量依赖性(均P<0.05);与SEM-H组比较,SEM-H+Compound C组Eca109细胞增殖水平(24、48 h)和Bcl2、p-NF-κB p65蛋白表达均显著升高,细胞凋亡率和自噬小体数量、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、BAX、p-AMPK、SIRT1蛋白表达均显著降低(均P<0.05)。结论:SEM可能通过激活AMPK/SIRT1信号通路而抑制NF-κB活性来促进Eca109细胞自噬与凋亡。

NFE2L2对食管鳞状细胞癌ECA109细胞生物学行为的影响

目的 探讨NFE2L2对人食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞株ECA109侵袭、迁移、增殖、凋亡等生物学行为的影响。方法 基因转染技术下调及上调ECA109细胞中NFE2L2的表达后,Transwell检测细胞侵袭能力及迁移能力,CKK-8检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果 下调ECA109细胞中NFE2L2的表达后,NFE2L2在siRNA1、siRNA2组基因(0.216±0.084、0.215±0.060)及蛋白(0.238±0.056、0.189±0.023)水平表达降低,细胞侵袭数目[(40.00±8.05)个、(23.00±6.38)个]较对照组[(152.25±27.04)个、(151.00±18.96)个]显著减少,细胞迁移数目[(76.20±20.43)个、(150.33±34.83)个]较对照组[(462.75±59.61)个、(492.40±82.97)个]显著减少,G_(0)/G_(1)期细胞百分比[(68.07±3.45)%、(74.90±4.17)%]较对照组[(54.40±3.91)%、(53.97±2.89)%]明显增加,S期细胞百分比[(30.43±0.91)%、(21.87±4.67)%]较对照组[(42.23±3.12)%、(41.97±3.70)%]明显减少,细胞凋亡率[(4.60±0.61)%、(8.13±0.55)%]较对照组[(2.23±0.74)%、(2.23±0.45)%]明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 在ECA109细胞中,沉默NFE2L2可抑制其癌细胞的侵袭、迁移及增殖,同时可增加其凋亡,NFE2L2可能在ESCC进展中起促进作用。

八聚体结合转录因子4对食管鳞状细胞癌细胞侵袭、迁移的影响

目的探讨八聚体结合转录因子4(Oct4)对食管鳞状细胞癌细胞活力、侵袭、迁移的影响及其机制。方法利用脂质体将Oct4对照和Oct4 shRNA分别转染至食管鳞状细胞癌细胞Eca109,分别记为对照组和干扰组。采用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Oct4 mRNA的表达情况,CCK-8法检测细胞活力,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell法检测细胞侵袭能力,蛋白质印迹法(Western blot)检测Eca109细胞中基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、上皮钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、Twist蛋白的表达情况。结果RT-PCR检测结果显示,转染后,干扰组Eca109细胞中Oct4 mRNA的相对表达量明显低于对照组(P﹤0.01)。CCK-8法检测结果显示,干扰组Eca109细胞的活力明显低于对照组(P﹤0.01)。细胞划痕实验结果显示,迁移24 h后,干扰组Eca109细胞的迁移速率明显低于对照组(P﹤0.01)。Transwell检测结果显示,干扰组Eca109细胞的侵袭数目明显少于对照组(P﹤0.01)。Western blot检测结果显示,干扰组Eca109细胞中MMP2、MMP9、vimentin、Twist蛋白的相对表达量均明显低于对照组,E-cadherin蛋白的相对表达量明显高于对照组(P﹤0.01)。结论下调Oct4的表达能明显抑制食管鳞状细胞癌细胞Eca109的活力及侵袭、迁移能力,以及抑制食管鳞状细胞癌细胞Eca109中MMP2、MMP9、vimentin、Twist蛋白的表达,促进E-cadherin蛋白的表达。

Rab3D对食管鳞状细胞癌细胞系增殖及细胞周期素D1表达的影响

目的探讨Rab3D对人食管鳞状细胞癌细胞系增殖及细胞周期素D1(Cyclin D1)表达的影响。方法采用Western blot法从8株人食管鳞状细胞癌细胞系KYSE410、KYSE450、TE-1、TE-7、KYSE510、KYSE150、EC9706、EC109中筛选出Rab3D表达较低的2株食管鳞状细胞癌细胞株KYSE410、KYSE450及Rab3D表达较高的2株食管鳞状细胞癌细胞株EC109、EC9706,将KYSE410、KYSE450细胞株分别分为转染Rab3D质粒的Rab3D组和转染空载体的对照组,将EC109、EC9706细胞株分别分为转染Rab3D小干扰RNA(siRNA)的Rab3D siRNA组和转染阴性对照的阴性对照组,MTT法检测Rab3D对食管鳞状细胞癌细胞的增殖及Cyclin D1表达的影响,Western blot检测Cyclin D1蛋白的表达。结果 KYSE410、KYSE450食管鳞状细胞癌细胞株转染Rab3D组细胞的吸光度与本细胞株对照组比较,在转染后12 h差异无统计学意义(P>0.05),转染后24、48、72 h均高于本细胞株对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。EC109、EC9706食管鳞状细胞癌细胞株转染siRNA组细胞的吸光度在转染后12、24 h与本细胞株阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),转染后48、72 h均低于本细胞株阴性对照组(P<0.05)。KYSE410、KYSE450细胞转染Rab3D组Cyclin D1蛋白表达水平较本细胞株对照组增高(P<0.05);EC109、EC9706细胞转染siRNA组的Cyclin D1蛋白表达水平较本细胞株阴性对照组降低(P<0.05)。结论 Rab3D促进食管鳞状细胞癌细胞的增殖,机制可能与促进Cyclin D1的表达有关。

Bufalin对食管癌ECA109细胞中FAK活化和上皮-间质转化的影响

目的探讨Bufalin对食管鳞状细胞癌ECA109细胞中FAK活化和上皮-间质转化(epithelial-mesenehymal transition,EMT)的影响。方法采用RT-PCR法检测不同浓度Bufalin对食管鳞状细胞癌ECA109细胞中FAK、E-cadherin、vimentin mRNA表达的影响。Western blot法检测不同浓度Bufalin对ECA109细胞中FAK活化水平及FAK、E-cadherin、vimentin蛋白表达的影响。采用Transwell小室实验检测不同浓度Bufalin对ECA109细胞迁移与侵袭能力的影响。结果 RT-PCR结果表明Bufalin抑制FAK、E-cadherin、vimentin的mRNA表达。Western blot结果表明Bufalin抑制E-cadherin、vimentin的表达和FAK的活化。Transwell实验结果表明Bufalin可以抑制ECA109细胞的迁移及侵袭。药物干预组(20、40、60、80、100 nmol/L Bufalin及PF562271组)与阳性对照组相比,Transwell迁移实验结果显示穿过基膜的细胞个数由107.00±8.19下降至78.67±3.06、61.67±3.06、42.67±3.512、24.33±2.517、10.33±3.215、9.00±2.65;Transwell侵袭实验结果显示穿过基膜的细胞个数由127.67±8.02下降至102.33±4.51、87.33±7.10、73.00±4.58、57.33±2.52、39.00±3.61、37.33±2.52,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 Bufalin可以抑制食管鳞状细胞癌中FAK的活化,提示Bufalin可能是通过下调FAK来抑制食管鳞状细胞癌EMT过程及食管癌的迁移及侵袭。

微小RNA-26a对食管癌Eca109细胞增殖、迁移、凋亡及细胞周期的影响

目的探讨微小RNA-26a(miR-26a)对食管癌Eca109细胞增殖、迁移、凋亡和细胞周期的影响。方法将正常培养的人食管鳞状细胞癌Eca109细胞随机分为正常对照组(正常培养的不加任何类型慢病毒的Eca109细胞)、阴性对照组(转染随机序列慢病毒)及miR-26a过表达组(转染miR-26a过表达慢病毒)。分别采用四甲基偶氮唑盐实验、细胞划痕实验、流式细胞术检测细胞增殖、迁移、细胞周期和凋亡情况。结果转染后72、96 h,miR-26a过表达组细胞增殖能力低于正常对照组和阴性对照组(P <0. 05);阴性对照组与正常对照组细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。转染后72 h,miR-26a过表达组细胞划痕愈合率低于正常对照组和阴性对照组(P <0. 05);阴性对照组与正常对照组细胞划痕愈合率比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。转染后48 h,miR-26a过表达组G_1、G_2期细胞所占比例高于正常对照组和阴性对照组,S期细胞所占比例低于正常对照组和阴性对照组(P <0. 05)。阴性对照组与正常对照组细胞G_1、S和G_2期细胞所占比例比较差异无统计意义(P> 0. 05)。结论 miR-26a可以抑制人食管鳞状细胞癌Eca109细胞增殖和迁移,阻断细胞由G_1期向S期过渡,但对细胞的凋亡无明显影响。