重组人骨形态发生蛋白7基因腺相关病毒载体的构建及其体外生物学活性

目的构建带有绿色荧光蛋白(GFP)标记并携带人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因的无致病性重组的腺相关病毒(AAV),以其作为基因载体感染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),体外检测病毒生物学活性及功能。方法从含有hBMP-7基因的pBluescript KS-hBMP7质粒中扩增出hBMP-7片段,构建重组骨架质粒pAAV-hBMP7-IRES-GFP。将此质粒和AAV包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hBMP7-IRES-GFP。感染AAV-HT1080测定病毒滴度,应用该重组病毒感染体外培养的兔BMSCs,荧光细胞计数法检测病毒最佳感染复数,Western blot法检测BMP-7基因的体外表达,成骨诱导实验检测BMP-7的体外生物学活性。结果重组腺相关病毒表达质粒经酶切、测序验证正确。重组腺相关病毒感染滴度约为3.6×1011v.p./mL。重组病毒感染兔BMSCs的最佳感染复数为5×104v.p/细胞。Western blot结果显示重组病毒rAAV-hBMP7-IRES-GFP转染组BMSCs细胞内有BMP表达。成骨诱导实验证实rAAV-hBMP7-IRES-GFP表达的BMP体外具有良好的成骨活性。结论成功制备了rAAV-hBMP7-IRES-GFP病毒,实验获得的病毒载体滴度高、感染性好,可以满足骨组织工程的需要,为进一步体内和体外研究基因治疗促进骨愈合提供了有利的工具。

兔椎间盘成骨作用中的转基因人骨形态发生蛋白7

背景:对于骨形态发生蛋白的生物活性分析中发现,极其微量的骨形态发生蛋白在成年个体中被分泌和储存在骨基质和成骨、成软骨等细胞中,当骨折时这些骨形态发生蛋白在骨折区域释放,诱导周围的间充质细胞发生化学趋化、聚集、分化并形成软骨,从而最终形成成熟的骨结构。目的:验证转基因人骨形态发生蛋白7在兔椎间盘组织中的成骨作用。方法:健康成年新西兰大白兔随机分成4组。分别于不同的腰椎间盘注入骨形态发生蛋白7溶液,生理盐水,或使用金属手术器械行腰椎间盘单纯破坏,并设立未干预的腰椎间盘作为空白对照。术后第6周应用组织学观察注射区内新骨的形成情况。结果与结论:各组动物注射生理盐水的椎间盘和空白椎间盘均为阴性结果。注射骨形态发生蛋白组的新生骨的面积显著大于单纯破坏组(P<0.05)。注射骨形态发生蛋白组新生骨面积组内差异在放大40倍和100倍时,差异无显著性意义(P>0.05)。结果证实转基因人骨形态发生蛋白7能将家兔的椎间盘转化为新生软骨组织。

腺相关病毒介导人骨形态发生蛋白7基因体外转染脂肪源性干细胞的研究

目的构建人骨形态发生蛋白7(hBMP7)基因重组腺相关病毒载体并观察其在脂肪源性干细胞(ADAS cells)中的表达,为骨组织工程探索新的基因治疗方法和细胞来源。方法以pcDNA1．1／Amp-hBMP7质粒为模板扩增,将回收的PCR产物片段克隆入pUC18载体,获得重组质粒pUC18-hBMP7。双酶切质粒pUC18-hBMP7、pSNAV,回收的两片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV-hBMP7。用重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc／△UL2感染BHK-21细胞,裂解细胞收获病毒液。采用“氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提”三个步骤分离浓缩和纯化,测定病毒滴度。培养大鼠ADAS cells,并检测细胞表面标记物。在体外分别转染rAAV2-hBMP7和rAAV2-GFP,流式细胞仪、Western-blot方法检测转染基因的表达。结果PCR、酶切鉴定以及测序分析表明,BMP7基因成功克隆入质粒pSNAV-hBMP7载体中,并在BHK21细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7。早期对ADAS cells的转染效率可达90％, Western-Blot方法检测到第1周与第8周的转染组细胞均有蛋白水平的表达。结论成功构建了hBMP7基因重组腺相关病毒载体和培养出大鼠ADAS cells,rAAV2-hBMP7载体在体外可高效转染大鼠ADAS cells。

表达重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的:研究表达重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的发酵和表达产物的纯化工艺。方法:利用16L发酵罐发酵培养工程菌,设定了溶氧、搅拌速度、诱导时机、补料和培养基pH值等发酵条件;通过包涵体洗涤、离子交换层析法纯化目的蛋白。结果:工程菌目的蛋白质表达量占菌体总蛋白质的30%以上,纯化后目的蛋白的纯度可达98%。结论:建立了大肠杆菌高效表达人骨形态发生蛋白-7的发酵及纯化工艺。

重组人骨形态发生蛋白7成熟蛋白在悬浮CHO-S细胞中的稳定表达

目的在悬浮CHO-S细胞中稳定表达重组人骨形态发生蛋白7(recombinant human bone morphgenetic protein7,rhBMP7)成熟蛋白。方法应用RT-PCR技术从BALB/c乳鼠股骨组织扩增mbmp7基因,克隆至质粒pMD18-T,通过定点突变3个氨基酸编码序列(G266S、S287N、D359E),得到重组克隆质粒pMD18-mbmp7m3;将mbmp7m3克隆至表达载体pCHO1.0,构建重组表达质粒pCHO-mbmp7m3,转染CHO-S细胞,利用嘌呤霉素和甲氨蝶呤进行两轮加压筛选,有限稀释法筛选单克隆细胞,ELISA法检测rhBMP7成熟蛋白的表达。结果从乳鼠股骨组织扩增的cDNA经测序与GenBank中登录的序列完全一致,点突变后测序与设计完全一致。获得了稳定表达rhBMP7成熟蛋白的单克隆细胞株,最高表达量为202 ng/mL。结论成功利用改造的mbmp7基因在CHO-S细胞中表达了rhBMP7成熟蛋白,为后续该制品工艺开发及产业化奠定了基础。

重组人骨形态发生蛋白-7的研究与应用

1965年，Urist在研究中发现，把脱钙的皮质骨植人动物的肌肉中，1～2周后会有新骨形成。他的结论是，植入的骨虽是死的，但其中可能含有某种物质在诱导新骨的形成。Urist从皮质骨中提取物获得了对成骨至关重要的骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP），在全世界范围内掀起了成骨诱导研究的热潮。

明胶海绵复合重组人骨形态发生蛋白-7植入物的体内异位成骨实验

目的:考察以明胶海绵为载体的重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)在小鼠体内异位成骨能力,评价大肠杆菌表达的rhBMP-7生物学活性。方法:昆明种小鼠随机分为两组,将复合rh-BMP-7的明胶海绵植入小鼠肌间隙作为实验组,对照组植入明胶海绵,分别于术后1、2、3、4周取出埋植材料,HE染色进行组织学观察,测定蛋白含量、钙含量与碱性磷酸酶(ALP)活性。结果:复合rhBMP-7的明胶海绵组在术后2、3、4周有骨细胞类似细胞和钙化灶的形成,术后2、3、4周蛋白含量、ALP活性和钙含量均明显高于明胶海绵对照组。结论:明胶海绵复合rhBMP-7植入小鼠体内有较强的异位成骨能力,是良好的生物载体,可用于rhBMP-7体内活性检测。

重组人骨形态发生蛋白-7与脱钙骨基质复合物双重骨诱导作用的生物学评价

将不同剂量的重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)与脱钙骨基质(DBM)分别复合后,植入小鼠股部内侧肌间隙,三周后取材,通过组织学检查、碱性磷酸酶(ALP)及钙含量的测定比较各组的骨诱导活性。结果显示,三组复合物均有骨组织生成,中、高剂量组可见骨小梁、板层骨和原始骨髓腔,血管和骨髓丰富;低剂量组的成骨量明显少于中、高剂量组,且新骨的成熟度低于其他两组,DBM少部分吸收;单独植入rhBMP-7组有编织骨形成;而DBM组可见成骨细胞的聚集。rhBMP-7/DBM复合组在ALP和Ca含量水平上与同等剂量的两对照组相比均有显著性差异(P<0.01),而rhBMP-7三种剂量之间均有显著性差异(P<0.01)。这充分说明DBM作为rhBMP-7的合适载体,具有缓释作用,且二者复合可起到双重骨诱导活性;而且rhBMP-7的骨诱导活性具有一定的剂量依赖性。

血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白7在细胞分化中的协同作用

目的:研究rhVEGF和rhBMP-7对成骨细胞分化能力的影响。方法:取大鼠颅盖骨组织块,采用改良组织块混合酶消化法培养成骨细胞,将不同浓度的rhVEGF和rhBMP-7加入第四代成骨细胞的培养基继续进行细胞培养,用碱性磷酸酶试剂盒检测定细胞在第1、3、5天的磷酸酶的活性,分析不同浓度的rhVEGF和rhBMP-7对成骨细胞分化的影响。结果:rhVEGF和rhBMP-7能促进成骨细胞的分化,其中,3.125ng/ml rhVEGF和50.000ng/ml rhBMP-7单独或者两者联合作用并于第3天时,对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响最明显。结论:一定剂量的rhVEGF和rhBMP-7可明显促进成骨细胞的分化。

重组人骨形态发生蛋白-7体内外生物学活性研究

采用体外、体内两种方法同时测定原核表达重组人BMP 7(rhBMP 7)的生物学活性 ,建立rhBMP 7活性测定的标准并为推广其临床应用提供依据。在体外 ,PNPP底物比色法和MTT比色法结果表明 ,10倍、10 0倍稀释上清组与细胞共同培养 72h后碱性磷酸酶 (ALP)水平和活细胞增殖数明显高于阴性对照组 (P <0 .0 5 ) ,而与标准品无显著性差异 (P >0 .0 5 )。在体内 ,将rhBMP 7植入小鼠肌间隙后 3周 ,见软骨岛和编织骨生成 ;而将rhBMP 7与胶原载体复合后植入 ,可见大量骨小梁、骨髓腔和板层骨 ,血管和骨髓丰富 ;成骨率均为8/ 8。ALP水平和钙含量 ,rhBMP 7组与标准品组相比 ,无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;复合组则明显高于单独植入rhBMP 7和胶原两组 (P <0 .0 5 )。

重组人骨形态发生蛋白-7腺病毒载体表达系统的研究

重组人骨形态发生蛋白-7（rhBMP-7）腺病毒载体表达系统具有宿主范围广泛、转染效率高、表达时间长、相对安全性高等特点．在基因治疗领域得到了广泛应用。本文主要从rhBMP-7腺病毒载体的构建及其在宿主细胞中的表达两方面进行了综述。

重组人血管内皮生长因子和重组人骨形态发生蛋白-7对大鼠成骨细胞增殖能力的影响

目的研究重组人血管内皮生长因子(recombinant human vascular endothelial growth factor,rhVEGF)和重组人骨形态发生蛋白-7(recombinant human bone morphogenetic protein-7,rhBMP-7)对成骨细胞增殖能力的影响。方法取大鼠颅盖骨组织块,采用改良组织块混合酶消化法培养成骨细胞,分成4组,第1组、第2组、第3组分别加3.125 ng/mL不含血清的rhVEGF培养液、50.000 ng/mL不含血清的rhBMP-7培养液、3.125 ng/mL不含血清的rhVEGF和50.000 ng/mL不含血清的rhBMP-7培养液,第4组加不含血清的培养液作为对照组,采用细胞培养技术,应用光镜、四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法,分析不同浓度的rhVEGF和rhBMP-7对成骨细胞增殖的影响。结果与对照组相比,3.125 ng/mL rhVEGF和50.000 ng/mL rhBMP-7单独或者联合作用,在1、3、5 d均有促进细胞增殖的作用,与对照组的差异均有统计学意义(P<0.05),各组间比较差异也有统计学意义(P<0.05)。其中,3.125ng/mL rhVEGF和50.000ng/mL rhBMP-7单独或者两者联合作用于第3天时,成骨细胞增殖最显著。结论一定剂量的rhVEGF和rhBMP-7可明显促进成骨细胞的增殖。

离子交换色谱法对大肠杆菌表达的人重组骨形态发生蛋白-7的纯化

重组大肠杆菌高量表达重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7),每升培养液约得到湿菌体3g,其中目的蛋白约占菌体总蛋白量的40%。裂解离心,用低浓度变性剂洗涤初步纯化包涵体,上清中无目的蛋白损失;将包涵体溶解于高浓度变性剂溶液中,目的蛋白纯度提高到60%;然后在不同条件下用离子交换色谱法对变性状态下的蛋白质进行纯化,绝大部分杂蛋白被除去,目的蛋白纯度达95%以上;改变条件,可以减少rhBMP-7损失;用Westernblot对目的蛋白进行特异性鉴定。

真核细胞表达人骨形态发生蛋白-7的研究进展

针对目前生物系统表达的人骨形态发生蛋白-7(h BMP-7)产量不能满足市场需求量、活性低、成本高的现状,对目前h BMP-7在酵母表达系统、昆虫、哺乳动物组织细胞的表达状况进行综述,分析其各自的优势和局限性,并对h BMP-7真核系统表达进行展望,指出h BMP-7是一种有重要价值的生长因子,具有强烈的骨诱导活性,临床上可用于治疗骨折、骨不愈合,未来的研究重点应是h BMP-7表达量的问题。

人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达

背景:研究表明LIM矿化蛋白1在体内和体外都可促使骨发生。目的:应用Adeasy-1腺病毒系统构建含人LIM矿化蛋白1基因的腺病毒重组体,并感染犬骨髓间充质干细胞,检测其体外表达及诱导成骨作用。方法:构建重组腺病毒质粒pAd-LMP-1,经人胚胎肾293细胞包装、扩增后得到复制缺陷重组腺病毒Ad-LMP-1,以最佳感染复数值体外感染犬骨髓间充质干细胞,行RT-PCR及Western Blot检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白7基因的表达。重组Ad-LMP-1和(或)外源性重组人骨形态发生蛋白7处理犬骨髓间充质干细胞,21d后行矿化(钙)结节茜素红染色分析LIM矿化蛋白1基因的诱导成骨作用。结果与结论:①将Ad-LMP-1以感染复数值100感染犬骨髓间充质干细胞可获得最佳感染效率,感染后骨髓间充质干细胞能在基因和蛋白水平表达LIM矿化蛋白1,未引起骨形态发生蛋白7基因的表达。②Ad-LMP-1或重组人骨形态发生蛋白7均不能单独促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,两者联合可促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。③实验成功构建重组腺病毒载体Ad-LMP-1,并实现其在犬骨髓间充质干细胞中表达,证实了LIM矿化蛋白1在诱导成骨作用中表现为与外源性重组人骨形态发生蛋白7的协同效应。

构建过表达hBMP-7基因重组腺病毒及体外转染犬骨髓基质细胞的研究

目的:构建携带人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因的重组腺病毒载体,体外转染犬骨髓基质干细胞(dMSCs),检测hBMP-7的表达。方法:利用AdEasy腺病毒表达系统,体外构建高效表达hBMP-7重组腺病毒载体,酶切电泳鉴定后体外转染dMSCs,检测转染情况及目的基因的表达。结果:酶切鉴定表明pAd-hBMP-7已成功构建,体外可高效转染dMSCs,RT-PCR方法及免疫细胞化学检测表明hBMP-7可在dMSCs中表达。结论:成功克隆hBMP-7基因并构建重组腺病毒表达载体,证实了其在dMSCs中的表达,为火器伤致颌骨缺损的早期局部基因治疗打下基础。

重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体的构建及转染兔骨髓基质干细胞的实验研究

[目的]构建人骨形态发生蛋白-7(human bone morphogenetic protein-7,hBMP-7)基因真核表达载体,评价其转染兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的诱导成骨能力。[方法]从人类胎盘组织中克隆出hBMP-7基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,成功构建了重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体;从兔骨髓中分离培养BMSCs,分为3组:A pcDNA3.1-hBMP-7转染组;B空载体pcDNA3.1转染组;C未转染组。使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在BMSCs中的表达。检测各组细胞碱性磷酸酶,胶原,骨钙蛋白合成情况。[结果]RT-PCR、免疫组织化学检测显示经hBMP-7转染的BMSCs中有BMP-7表达。经hBMP-7转染BMSCs的碱性磷酸酶于转染后第2 d显著增高,到第8 d达到最高;经hBMP-7转染的BMSCs合成胶原、骨钙蛋白能力也显著提高,与转染空载体、未转染的BMSCs相比有显著性差异(P<0.05)。[结论]成功构建了pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体;外源的hBMP-7基因可在兔BMSCs中充分、高效的表达,并且这种外源性hBMP-7基因具备了促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力,这为hBMP-7的基因治疗提供了坚实的理论基础。

hBMP-7基因修饰犬骨髓基质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石修复下颌骨缺损

目的:构建携带人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因的重组腺病毒载体,体外转染犬骨髓基质干细胞(dMSCs)复合珊瑚羟基磷灰石(coral hydroxyapatite,CHA),观察其修复下颌骨缺损的效果。方法:利用AdEasy腺病毒表达系统,体外构建高效表达hBMP-7重组腺病毒载体,转染dMSCs与珊瑚羟基磷灰石支架材料复合,再分别植入取材动物的自体下颌骨缺损区,分别于4周和8周取材观察成骨情况。结果:大体观察、X线检查及组织学观察均发现构建组织工程骨在祼鼠皮下及骨缺损处均有明显新骨组织形成。结论:构建携带人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因的重组腺病毒载体,体外转染dMSCs后复合珊瑚羟基磷灰石有较多量骨组织形成,可有效修复下颌骨缺损。

rhBMP-7对大鼠成骨细胞增殖及分化能力的影响

目的研究重组人骨形态发生蛋白-7(recombinant human bone morphogenetic proteins,rhBMP-7)对大鼠成骨细胞增殖和分化能力的影响。方法从SD大鼠取材进行原代培养,经碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和矿化结节检测鉴定为成骨细胞后传代至第3代,接种至96孔培养板。分为A、B、C、D、E、F共6组,每组3个复孔,rhBMP-7浓度分别为0.000、0.500、1.000、5.000、10.000、50.000mg/L。应用四甲基偶氮唑盐(meth-yl thiazolyl tetrazolium,MTT)法及PNPP偶氮法,分析不同浓度rhBMP-7作用72h后对大鼠成骨细胞增殖和ALP活性的影响,应用单因素方差分析和LSD法统计数据。结果作用72h后,6种浓度rhBMP-7对大鼠成骨细胞ALP活性促进作用的差异有统计学意义(F=11.840,P=0.000),B组成骨细胞ALP活性高于A组,但差异无统计学意义(P=0.078),C、D、E、F组大鼠成骨细胞ALP活性均高于A组(P值均为0.000),rhBMP-7浓度为50.000mg/L时对ALP活性的影响最明显(P=0.000)。作用72h后6种浓度rhBMP-7对大鼠成骨细胞增殖影响的差异有统计学意义(F=2.726,P=0.026);rhBMP-7能促进大鼠成骨细胞的增殖和分化,同A组(rhBMP-7浓度为0.000mg/L)相比,当rhBMP-7浓度为50.000mg/L时并作用至第3天时,大鼠成骨细胞增殖最显著(P=0.000)。结论一定剂量的rhBMP-7明显促进了大鼠成骨细胞的增殖和分化。

VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白在复发脑胶质瘤术后的表达及分析

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)、重组人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、重组人骨形态发生蛋白-7(BMP-7)在原发和复发脑胶质瘤患者术后瘤组织中的表达及临床意义.方法回顾性分析笔者医院神经外科2012年1月~ 2015年1月72例脑胶质瘤患者首次手术及复发后再手术的完整临床资料和瘤组织标本,采用免疫组化法检测所有患者原发及复发标本蜡块中VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白阳性表达水平,分析其与性别、年龄、WHO病理分级、脑胶质瘤原发或复发等临床病理资料的关系.结果对复发脑胶质瘤患者临床病理资料采用Spearman等级相关分析结果显示,VEGF蛋白表达与WHO病理分级(rVEGF=0.375)及原发、复发情况相关(rVEGF=0.319),BMP-2、BMP-7蛋白表达与原发、复发情况相关(rBMP-2=0.492,rBMP-7=0.381),差异有统计学意义(P<0.05).VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白在原发脑胶质瘤中的阳性表达率为52.8%(38/72)、61.1%(44/72)、59.7%(43/72),在复发脑胶质瘤中的阳性表达率为68.1%(49/72)、70.8%(51/72)、69.4%(50/72),复发脑胶质瘤中VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白表达高于原发,差异有统计学意义(P<0.05).结论脑胶质瘤复发与VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白表达水平呈正相关,是判断脑胶质瘤生物学行为的重要指标,VEGF、BMP-2、BMP-7蛋白可作为脑胶质瘤分子标志物及治疗靶点.