重组人骨形态发生蛋白9和2体外诱导成骨的活性分析

利用PCR扩增hBMP-9全长序列构建真核表达载体pcDNA4/His Max-BMP-9,与质粒pSV2-dhfr共转染CHO-dhfr-细胞,以含有100μg/ml博来霉素的IMDM进行选择性培养,筛选抗性克隆,并用MTX扩增,提高rhBMP-9的表达量。经过细胞分离培养,得到稳定表达rhBMP-9的6株单克隆细胞株,ELISA法检测rhBMP-9表达水平,最高可达1.13μg/24h/106cells。收集最高表达蛋白的单克隆株培养基上清,经His标签的蛋白纯化柱纯化,冻干法浓缩得到100μg/ml的rhBMP-9。用浓度100μg/ml的rhBMP-9和rhBMP-2分别刺激培养C3H10,各项成骨指标显示rhBMP-9具有一定的体外诱导成骨能力,但不及rhBMP-2。

重组pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体的构建与鉴定

背景:腺病毒临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。目的:将人骨形态发生蛋白9的cDNA构建于pcDNA4 His/Max,得到重组真核表达载体pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9。方法:将已有的Padtrack-cmv-人骨形态发生蛋白9进行PCR扩增,电泳回收人骨形态发生蛋白9片段,将pcDNA4 His/Max用NotⅠ和KpnⅠ双酶切,得到pcDNA4His/Max酶切片段,连接人骨形态发生蛋白9和pcDNA4 His/Max片段得到重组质粒pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9,将该载体用DH5α转化,阳性克隆扩增及纯化、序列分析鉴定。结果与结论:通过PCR及序列分析证明pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体的人骨形态发生蛋白9基因长度为1.3kb,与报道的人骨形态发生蛋白9全长序列一致,无突变。结果证实,实验成功构建了pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体。

重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白9与骨形态发生蛋白2复合纳米羟基磷灰石/聚酰胺多孔支架修复桡骨缺损的比较

背景:课题组采用新的重组腺病毒介导的基因表达手段,与传统方法比较具有高效、方便、安全等优点,可作为进入临床基因治疗应用的潜在有力手段。目的:比较腺病毒介导的人骨形态发生蛋白9(Adv-h BMP-9)与腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2(Adv-h BMP-2)分别复合纳米羟基磷灰石/聚酰胺多孔支架材料修复重建桡骨缺损的效果。方法:新西兰白兔36只,随机分成3组,制成双侧桡骨中段13mm骨缺损模型。分别植入Adv-h BMP-9+纳米羟基磷灰石/聚酰胺骨、Adv-h BMP-2+纳米羟基磷灰石/聚酰胺骨、Adv-GFP+羟基磷灰石/聚酰胺骨。植入后进行大体观察、X射线摄片、组织学检测。结果与结论:BMP-9组骨缺损完全修复,BMP-2组骨缺损部分修复,而GFP对照组骨缺损修复明显欠佳。提示重组腺病毒介导的BMP-9对桡骨骨缺损后的成骨修复作用强于BMP-2。

重组人骨形态发生蛋白-9对人牙周膜成纤维细胞成骨分化的影响

目的:研究重组人骨形态发生蛋白-9(recombinant human bone morphogenetic protein-9,rhBMP-9)对体外人牙周膜成纤维细胞成骨细胞分化的影响。方法:体外培养人牙周膜成纤维细胞,成骨分化培养基(osteogenic differentiation medium,ODM)诱导成骨分化,加入不同浓度rhBMP-9或p38和胞外信号调节激酶1/2(extracellular signalregulated kinase1/2,ERK1/2)抑制剂SB203580和U0126处理。采用LabAssayTM碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒检测ALP活性。提取总RNA,实时荧光定量聚合酶链反应(Real time fluorescence quantitative PCR,qPCR)检测RUNT相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)、分化抑制因子1(inhibitor of differentiation factor 1,ID1)、骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达情况。结果:rhBMP-9可以显著增加人牙周膜成纤维细胞ALP活性,且呈浓度和时间依赖性。成骨分化相关转录因子RUNX2和ID1以及晚期成骨标志物BSP和OPN的表达在rhBMP-9的刺激下也显著升高。与rhBMP-9单独刺激组比较,加入SB203580和U0126共刺激后可完全抑制rhBMP-9促人牙周膜成纤维细胞成骨分化的作用。结论:rhBMP-9能够显著诱导人牙周膜成纤维细胞向成骨细胞样细胞分化,且其可能机制为调节p38和ERK1/2通路。

真核表达重组骨形态发生蛋白9的纯化及生物骨诱导活性分析

本文主要探讨通过生物技术重组纯化的骨形态发生蛋白9(BMP-9)的体外诱导成骨活性。用PCR技术扩增人骨形态发生蛋白9(hBMP-9)全长序列,构建真核表达载体pcDNA4/His.Max-hBMP-9,与质粒pSV2-dhfr共同转染CHO-dhfr-细胞,用含有100μg/mL博来霉素的IMDM进行筛选和MTX系统扩大目的基因的整合,从而获得高表达重组人骨形态发生蛋白9(rhBMP-9)的抗性单克隆株。收集最高表达蛋白的单克隆株培养基上清,经His标签的蛋白纯化柱纯化,Western blot和SDS-PAGE检测显示有分子量分别约32kD和50kD的条带。用浓度分别为20、50和100μg/mL的rhBMP-9刺激培养C3H10T1/2,培养7d和20d后分别检测碱性磷酸酶和骨钙素、骨桥蛋白的表达。各项早晚期成骨指标显示,rhBMP-9具有较强的体外诱导成骨能力,且与浓度成正相关。本研究表明,通过生物医学技术构建的rhBMP-9具有较强的骨诱导性,为进一步体内试验以及临床应用奠定了基础。