稳定表达人骨形成蛋白-2基因的成纤维细胞体内诱导成骨作用

目的 探讨稳定表达人骨形成蛋白 - 2 (h BMP- 2 )基因的成纤维细胞是否具有体内诱导成骨能力。 方法 构建重组真核表达载体 pc DNA3- h BMP- 2 ,在脂质体介导下 ,将其导入 NIH3T3细胞 ,通过 G4 18筛选获得阳性克隆 ,并继续培养 4周 ,用细胞原位杂交和免疫组织化学方法观察 h BMP- 2基因在 NIH3T3细胞内的稳定表达 ,并观察了稳定表达 h BMP- 2的成纤维细胞碱性磷酸酶 (AL P)活性的变化 ,将稳定表达 h BMP- 2的成纤维细胞植入裸鼠肌袋内观察其体内诱导成骨作用。 结果 成功构建重组真核表达载体 pc DNA3- h BMP- 2 ,经细胞原位杂交和免疫组织化学证实 ,转染 pc DNA3- h BMP- 2后的 NIH3T3细胞内有大量 h BMP- 2 m RNA的转录及其蛋白的稳定表达 ,稳定表达 h BMP- 2的成纤维细胞 AL P活性显著上升 ,植入裸鼠肌袋内 4周有大量软骨形成。 结论 稳定表达 h BMP- 2的成纤维细胞具有体内诱导成骨能力。

人骨形成蛋白-2基因腺病毒表达载体构建方法的优化

目的:探索采用体外连接技术替代同源重组方法构建Ad—BMP-2,优化腺病毒载体构建方法。方法:将:BMP-2基因连接到辅助载体pShuttle2后,以限制性内切酶PI—Sce Ⅰ及Ⅰ—Ceu Ⅰ酶切,获得含启动子Pcmvie的BMP-2基因片段,然后将其连接到经同样双酶切的Adeno-X载体上,获得含BMP-2基因的重组腺病毒载体Ad—BMP-2。将其以限制性内切酶Pac Ⅰ酶切线性化后,转染HEK293细胞,包装重组腺病毒颗粒,并采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果:重组载体pShut—tle2-BMP-2及Adneo-BMP-2均采用酶法切及PCR鉴定,鉴定结果均与理论相符。将包装后的重组腺病毒以PCR鉴定,以1％琼脂糖电泳见1.2 kb及287 bp有带,与MBP-2及腺病毒扩增片段大小相符。结论:与传统的同源重组方法相比,体外连接技术方法简单、快捷,并且此方法不需噬斑纯化、筛选方法简便,提高了腺病毒载体构建的效率;同时,Ad—BMP.2的构建成功为后续进行BMP-2基因的治疗研究奠定了坚实的基础。

重组人骨形成蛋白-2基因工程菌株的构建及蛋白复性纯化

目的构建一株高效表达人骨形成蛋白2(hBMP-2)的基因工程菌株,并通过复性、纯化获得有生物活性的rhBMP-2。方法采用基因工程法将hBMP-2基因片段与pET-28a(+)质粒载体相连,构建大肠杆菌表达系统。工程菌发酵后,超声破碎收集包涵体,包涵体经裂解后通过稀释复性法进行复性,SDS-PAGE检测复性情况,并采用HiTrapHeparinHP纯化,C2C12细胞检测活性。结果rhBMP-2在大肠杆菌中以无活性的包涵体形式表达,1L发酵罐高密度发酵rhBMP-2包涵体湿重可达20g/L。采用稀释法复性,蛋白复性率大于40%,亲和层析纯化后,二聚体蛋白纯度达95%以上,且能诱导C2C12细胞碱性磷酸酶的表达,具有同市售产品相同的细胞活性。结论成功构建了高效表达rhBMP-2的基因工程菌株,复性方法简单且无需对包涵体进行纯化,蛋白复性浓度高,纯化方法简便,大大降低了工业化生产成本。

骨形成蛋白-2基因转染人骨髓间质干细胞诱导异位成骨的实验研究

目的 评价腺病毒介导的人骨形成蛋白 - 2基因 (Adv- h BMP- 2 )转染人骨髓间质干细胞 (MSCs)的诱导成骨能力。方法 从人骨髓中分离培养获取 MSCs,分为三组 :1Adv- h BMP- 2转染细胞组 ;2 Adv- βgal转染细胞组 ;3未转染细胞组。分别于体外行 Western immunoblot试验、碱性磷酸酶 (AL P)和 Von Kossa染色、AL P定量测定 ,以及裸鼠肌内诱导成骨试验。共 9只裸鼠 ,双侧股后肌群内注射 ,每组 6侧。结果 Adv- h BMP- 2组 MSCs可分泌 BMP- 2蛋白 ;转染后第 9天 AL P染色多数细胞为阳性 ,其它两组 AL P染色阳性细胞少见 ;AL P活性第 3天开始升高 ,12天达高峰为 14 .76单位 ,与其它两组比较有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ;于第 2 1天后出现钙结节 ,而其它两组未见。裸鼠肌内注射后 4周 Adv- h BMP- 2组 X线片均有异位成骨 ,Adv- βgal转染细胞组未见明显成骨 ,未转染细胞组仅有少量骨形成。组织学检查发现 :Adv- h BMP- 2组也可见典型的板层骨和骨髓腔形成 ,Adv- βgal组主要为纤维组织 ,未转染组也可见散在骨小梁形成。结论 Adv- h BMP- 2基因转染可诱导人骨髓间质干细胞成骨。

复合基因重组人骨形成蛋白-2异种骨的研制及成骨活性研究

目的 研制新型具有诱导成骨活性的异种骨植骨材料。方法 在重组合异种骨 (RBX)基础上 ,以基因重组人骨形成蛋白 - 2 (rh BMP- 2 )取代从牛皮质骨中提取的牛 BMP,与去抗原牛松质骨载体 (BCB)复合 ,制成复合 rh BMP- 2的异种骨 (rh BMP- 2 / BCB) ;将 4周龄雄性 BAL B/ C小鼠 6 0只 ,随机分为实验组和对照组 ,于实验组小鼠左股部肌袋植入 rh BMP- 2 / BCB骨粒 ,对照组小鼠左股部肌袋植入 BCB骨粒 ,术后 7、14及 2 1天取材 ,通过组织学、骨计量学方法检测 rh BMP- 2 / BCB的诱导成骨活性。结果 1实验组术后 7天在小鼠肌袋可诱导软骨生成 ,14天形成编织骨 ,2 1天改建成板层骨并形成大量骨髓 ;对照组于术后各时间点均未见有软骨及骨形成。 2实验组的碱性磷酸酶活性和钙含量均高于对照组 ,具有统计学意义 (P<0 .0 1)。结论 rh BMP- 2 / BCB具有较好的骨诱导能力 。

骨形成蛋白-2基因促进犬牙周组织再生的体内研究

目的:观察重组入骨形成蛋白-2(rhBMP-2)质粒对犬牙周骨缺损再生作用的影响。方法:选用6只成年bea犬,将其下颌两侧的第2、3、4前磨牙(P2、P3、P4)作为实验牙。在每颗实验牙的近中根颊侧制作“U”型骨缺损,并随设计为3组,即pIRES-rhBMP-2组、rhBMP-2组(阳性对照组)和PBS组(空白对照组)。术后第4与第8周分别处动物。光镜下观察组织学变化,采用Image-Pro-Express系统测量新生牙槽骨和牙骨质的高度、新生结缔组织的附量。测量结果以SAS 6．12软件包进行Newman-Keuls q检验。结果:实验第8周时,组织学观察可见2个实验组新牙槽骨接近于正常骨结构,新生牙周纤维稠密,富含血管;空白对照组胶原纤维稀疏,排列不规则。新生组织测量果显示:2个实验组新生牙槽骨和牙骨质的高度、新生结缔组织的附着量较空白对照组显著增加(P<0．05,P<0．01) 2个实验组间相比无显著性差异(P>0．05)。结论:pIRES-rhBMP-2有较强的骨诱导活性,能有效促进犬牙周骨缺的组织再生。

骨形成蛋白-2基因修饰的β磷酸三钙/胶原复合材料修复颅骨缺损

目的构建骨形成蛋白2(Bone morphogenetic proteins2,BMP-2)基因修饰的β磷酸三钙(βtricalcium phosphate,β-TCP)/胶原复合支架材料,探讨其体内修复大鼠临界颅骨缺损的效果,评价其作为骨缺损修复材料的性能。方法制备纳米级多孔β-TCP/胶原支架,并负载100μg BMP-2质粒DNA形成基因修饰的支架材料。将24只成年雄性SD大鼠随机分为BMP-2基因修饰的β-TCP/胶原支架组(n=8),β-TCP/胶原支架组(n=8),空白组(n=8)。在大鼠颅骨顶部建立两个直径5mm的临界性骨缺损,植入材料后6周、12周取样本大体观察,组织学观察,免疫组织化学检测,并进行骨组织测量分析。结果组织学观察可见12周时,材料已完全降解。BMP-2基因修饰支架组6周时,骨缺损区成骨活跃形成编织骨;12周时,骨缺损已基本愈合,新生骨组织逐渐成熟呈板层状,与宿主骨形成骨性连接。而单纯支架组6周时,骨缺损中心区为少量岛状骨组织;12周时,新生骨组织连接呈片状,骨缺损未完全愈合。免疫组化检测显示:6周和12周时,BMP-2基因修饰支架组中BMP-2表达均强于单纯支架组和空白组。骨组织形态计量分析显示BMP-2基因修饰支架组成骨质量和成骨效率明显高于单纯支架组和空白组(P<0.05)。结论 BMP-2基因修饰的β-TCP/胶原复合材料具有良好的生物相容性,骨诱导和骨传导性佳,是很有潜力的新型骨缺损修复材料。

基因重组人骨形成蛋白-2和牛骨形成蛋白异位诱导成骨的比较

目的 :观察基因重组人骨形成蛋白 2 (rhBMP 2 )和牛骨形成蛋白 (bBMP)分别与珊瑚 /聚乳酸形成复合人工骨的异位诱导成骨活性 ,同时比较两种骨形成蛋白的成骨效率。方法 :把rhBMP 2和bBMP分别与珊瑚 /聚乳酸形成复合人工骨 ,进行小鼠肌内种植 1、3、6周后 ,组织学观察和组织形态测量 ,比较其异位诱导成骨活性。结果 :rhBMP 2和bBMP存在骨诱导差异 ,rhBMP 2诱导成骨量相对较少但血管、骨髓含量丰富 ,bBMP则相反。结论 :两种BMP都具有良好的诱骨活性 ,但在成骨量和血管。

基因重组人骨形成蛋白-2对培养骨髓细胞的生物学效应

目的：骨髓是机体重要的造血器官，其中的单个核细胞主要是单核细胞和巨噬细胞，骨髓组织在骨损伤修复过程中也发挥重要的作用．为提高骨形成蛋白（BMP）修复骨缺损的能力，方法：本实验观察了基因重组人骨形成蛋白-2（re－combinanthumanBoneMorphogeneticProtein－2，rhBMP2）对培养骨髓细胞生物学活性的影响．结果：低浓度的rhBMP2（＜0．16mg／L）对培养骨髓细胞的碱性磷酸酶活性、蛋白质含量均有明显的促进作用，且呈剂量依赖性，高浓度的rhBMP2（＞0．16mg／L）对培养骨髓细胞的增殖也有一定促进作用结论：本研究的结果进一步证实，骨髓细胞也是BMP重要的靶细胞，BMP不仅促进骨髓细胞向成骨细胞的表型转化，而且可以促进骨髓细胞的增殖，因此在使用复合BMP的植骨材料进行骨缺损修复时，如能辅以骨髓细胞植入，将会大大提高骨缺损的修复效果．

基因重组人骨形成蛋白-2和聚乳酸复合异位诱导成骨的实验研究

目的 :观察基因重组人骨形成蛋白 - 2 (recombinanthumanBoneMorphofeneticprotein - 2 ,rhBMP - 2 )和聚乳酸(Polylacticacid ,PLA)复合形成的活性涂层种植体的异位诱导成骨活性。方法 :将rhBMP - 2与聚乳酸复合 ,构建活性涂层种植体 ,植入兔肌内 ,于 1,4 ,8周后进行X线、大体观察及组织学观察 ,检测异位成骨活性。结果 :rhBMP - 2 PLA活性复合涂层种植体具有骨诱导能力 ,PLA为rhBMP - 2的良好控释载体。结论 :rhBMP - 2 PLA涂层具有良好的生物相容性和骨诱导活性 。

基因重组人骨形成蛋白-2与珊瑚/聚乳酸复合修复骨质缺损的实验研究

目的 观察生物珊瑚、聚乳酸和rhBMP_2合成人工骨 (复合骨 )修复兔颅骨缺损后复合骨的变化情况。方法 选择 2 4只新西兰兔 ,随机分成 2组 ,每组 12只 ,建立兔颅骨缺损标准模型。植入复合骨 ,用珊瑚 聚乳酸作为对照。术后 4、8、12周每组各处死 4只动物 ,取出植入体进行扫描电镜观察和机械强度测定。结果 复合骨在植入缺损后 ,不仅在植入体周边部有骨组织长入 ,而且在整个植入体内均有新骨形成 ,即出现多中心成骨。复合骨在同一时间点的成骨量明显多于对照组 ,随时间推移 ,成骨量递增。在植入前 ,两材料间的抗压强度无明显差异 ;在植入后 ,两植入体的抗压强度则差异显著 ,复合骨明显高于同期的对照组。结论 生物珊瑚、聚乳酸和rhBMP_2合成人工骨在体内以传导成骨和诱导成骨双重机制完成骨修复 ,且有良好的机械强度 ,作为植骨材料具有良好的应用前景。

骨形成蛋白-2基因转染对成纤维细胞表型影响的实验研究

目的探讨腺病毒载体介导的骨形成蛋白-2(Ad-BMP-2)基因转染人胚肺成纤维细胞(HELFs)后,对HELFs的表型特别是矿化能力的影响。方法原代培养HELFs,并用Ad-BMP-2进行转染。观察转染前后HELFs的形态学变化;用四唑盐比色法、碱性磷酸酶染色、蛋白印迹以及体外矿化实验,检测转染BMP-2基因后HELFs增殖活性、碱性磷酸酶活性、BMP-2蛋白表达和矿化能力的变化。结果HELFs经Ad-BMP-2转染后,胞体变大,由单一细长梭形转变为多种形态,由单层生长变为复层生长;转染后HELFs增殖受到明显抑制;碱性磷酸酶染色见大部分细胞呈现阳性反应;蛋白印迹检测到明显的BMP-2蛋白条带;细胞经茜素红S染色后出现桔红色的矿化结节。结论经Ad-BMP-2转染后,HELFs向成骨细胞表型转变,具有了矿化能力。

基因重组人骨形成蛋白-2

为了给临床骨缺损提供理想的修复材料，人们积极研究利用基因工程技术在原核细胞或真核细胞中表达基因重组人骨形成蛋白－２（ｒｈＢＭＰ－２）。ｒｈＢＭＰ－２与牛骨中提取的骨形成蛋白（ＢＭＰ）具有相似的生物学活性，均能在异位诱导骨、软骨形成，但两者在诱导形成的骨组织结构上有一定差异。ｒｈＢＭＰ－２可以与胶原、珊瑚／胶原、无活性脱矿骨基质或聚乳酸／聚乙醇酸共聚物等载体材料合成ｒｈＢＭＰ－２复合人工骨，共同用于骨缺损的修复。但在其广泛应用于临床之前，尚有一些问题有待于进一步研究解决。

辛伐他汀对体外培养鼠骨形成蛋白BMP-2基因的调控

目的研究辛伐他汀对鼠骨形成蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)及其m RNA表达的影响,验证辛伐他汀是否能够促进鼠成骨细胞的骨形成.方法将兔子分为假手术组,模型组和辛伐他汀组3个小组,每组6只.在辛伐他汀组用药1月、2月和4月时,收集各组兔子的耳中央动脉血清,将上述血清加入鼠MC3T3-E1细胞培养4d后提取总RNA,逆转录出骨形成蛋白BMP-2的cDNA后进行实时荧光定量PCR,对产物进行检测.结果用药1个月,辛伐他汀组BMP-2表达量较假手术组高2.79倍(P=0.0004),较模型组高2.66(P=0.001);用药2个月,辛伐他汀组BMP-2表达量较假手术组高1.88倍,较模型组高1.75倍(P=0.001);用药4个月,辛伐他汀组BMP-2表达量较假手术组高0.86倍(P=1.000),较模型组高1.04倍.结论辛伐他汀对骨形成有正效应.

人基因重组骨形成蛋白-2对牙周韧带细胞群成纤维表型的影响

目的:探讨人基因重组骨形成蛋白-2(rhBMP-2)对牙周韧带细胞群(PDLC)成纤维表型的影响.方法:PDLC在含不同浓度的rhBMP-2的培养液中培养,采用免疫细胞化学技术做表皮生长因子受体(EGFR)的检测,并用图像分析软件分析EGFR表达的强弱.结果:rhBMP-2作用下,PDLC的EGFR的表达有变化(P<0.05),25～100 μg/L组EGFR的表达减弱,100 μg/L组最弱,随rhBMP-2浓度上升,EGFR的表达又有增强的趋势.结论:rhBMP-2对PDLC的成纤维表型产生了影响,合理剂量的rhBMP-2应用可以保证PDLC成纤维表型的较高表达,使种植体周牙周韧带的构建成为可能.

骨形成蛋白-2基因转染对辐射后成骨细胞增殖活性的影响

目的:探讨经过不同剂量X线照射成骨细胞后,感染复数(multiply of infection,MOI)值为100的腺病毒载体介导的骨形成蛋白-2(Ad-hBMP-2)基因转染对成骨细胞增殖能力的影响。方法:通过酶消化法,从Wistar大鼠乳鼠颅骨中获取成骨细胞并传代培养,分别进行0、100、300、500、700、900cGy的X线辐射。更换培养液后,加入Ad-hBMP-2进行转染。常规培养6d后,首先在倒置显微镜下观察不同辐射剂量条件下转染组与未转染组细胞的形态区别,采用MTT法检测各组细胞的增殖活力,并应用SPSS13.0统计软件包对数据进行t检验。结果:X射线剂量为100cGy时,细胞的增殖活性无明显变化;剂量增至300cGy时,细胞的增殖活性下降;转染Ad-hBMP-2后,增殖活性提高(P<0.05),经转染后细胞的增殖活性可提高至接近未接受放射线组细胞的水平;放射线剂量增至500cGy时,Ad-hBMP-2可以在一定程度上提高细胞的增殖活性(P<0.05);当剂量增至700cGy以上时,Ad-hBMP-2对细胞的增殖活性无显著影响(P>0.05)。结论:转染Ad-hBMP-2可以提高低剂量放射线照射后成骨样细胞的增殖能力,但在高剂量放射线条件下,细胞受到损伤,Ad-hBMP-2对细胞生长无影响,增殖能力无法恢复至正常水平。

骨形成蛋白-2基因转染NIH3T3细胞诱导成骨的实验研究

目的 探讨骨形成蛋白 - 2 (bonemorphogeneticprotein - 2 ,BMP - 2 )基因转染NIH3T3细胞体内诱导新骨的能力。方法 用脂质体转染法将BMP - 2基因转染至NIH3T3细胞 ,将转染细胞悬液注入裸鼠股四头肌内 ,第 6周取材 ,观察肌肉组织内诱导新骨生成情况。结果 基因转染实验组裸鼠肌肉组织中有类骨组织形成 ,部分区域伴有钙盐沉着 ,未见明显炎症反应。结论 骨形成蛋白 -

基因重组人骨形成蛋白-2胶原膜复合物防止大鼠矢状缝扩张后复发的作用

目的 研究基因重组人骨形成蛋白 2 (rhBMP 2 )胶原膜复合物对大鼠顶骨矢状缝扩张后复发的影响。方法 10周龄SD雄性大鼠 32只 ,随机分为空白对照组、单纯扩张组、扩张加胶原膜植入组、扩张加rhBMP 2胶原膜复合物植入组 ,每组 8只。大鼠左右顶骨钻孔 ,建立矢状缝扩张模型 ,第 2 1天时取出扩张装置 ,第 2 8天时处死动物 ;用游标卡尺测量相应时间点骨孔间的距离并计算扩张复发率。动物处死后完整取下顶骨 ,去除表面的软组织 ,采用组织学方法观察各组大鼠矢状缝处组织改建情况 ,用原子吸收分光光度计检测该处的钙含量。结果 施加扩张力后 ,矢状缝中新骨形成活跃 ,rhBMP 2胶原膜复合物植入组形成特有的骨质桥连接 ,钙含量显著高于其他组 (P <0 .0 1) ,扩张复发率则明显降低 (P <0 .0 1)。结论 rhBMP 2胶原膜复合物可以降低扩张力作用下大鼠顶骨矢状缝的扩张复发率 ,为临床上降低扩弓复发率提供新的思路。

颌骨肿瘤中骨形成蛋白-2基因扩增的RT-PCR研究

目的探讨颌骨肿瘤中骨形成蛋白(BMP)-2基因的扩增与颌骨肿瘤的发生、发展及生物学行为之间的关系。方法采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测9类87例新鲜颌骨肿瘤标本中BMP-2基因扩增结果。结果含肿瘤性硬组织的全部42例颌骨肿瘤(骨肉瘤、软骨肉瘤、牙源性纤维瘤、骨化性纤维瘤、化牙骨质纤维瘤)和部分颌骨成釉细胞瘤(27/31)均显示人BMP-2特异性扩增条带,而不含肿瘤性硬组织的其他颌骨肿瘤(牙源性钙化上皮瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤)均未见特异性扩增条带。结论颌骨肿瘤中BMP-2基因扩增存在差异,BMP-2基因扩增与肿瘤性硬组织的形成有关,与某些颌骨肿瘤的发生、发展及生物学行为之间存在一定关系。

新的基因工程药物骨形成蛋白-2的研究应用进展

综述骨形成蛋白类 (BMPs)基因工程药物的发展、分类 ,骨形成蛋白 2 (BMP 2 )的基因表达及蛋白纯化、生物作用和药效学研究以及其在骨科和口腔科许多病种治疗上的应用进展。