重组2型腺相关病毒-人骨形成蛋白7转染犬髓核细胞及其对髓核细胞表型的影响

目的:观察重组2型腺相关病毒-人骨形成蛋白7(recombinant adeno-associated virus-2expressinghuman bone morphogenetic protein-7,rAAV2-hBMP7)转染犬髓核细胞情况及其对细胞表型的影响。方法:用1岁龄Beagle犬L4/5椎间盘髓核进行髓核细胞体外培养,取第2代髓核细胞进行实验,实验组以rAAV2-hBMP7(1×105v.g/细胞)转染髓核细胞,对照组以重组2型腺相关病毒-增强型绿色荧光蛋白(recombinantadeno-associated virus-2expressing enhanced green fluorescent protein,rAAV2-EGFP)转染髓核细胞。在转染后4d、7d和14d以PCR检测髓核细胞中hBMP7的mRNA表达,在转染后7d和14d以Western blot法检测髓核细胞中hBMP7蛋白表达。在转染后4d、7d和14d采用RT-PCR法检测蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的mRNA含量,采用二甲基蓝及ELISA法分别检测蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的蛋白含量。结果:实验组髓核细胞表达hBMP7 mRNA及蛋白,并于转染后7d时表达量最高,而对照组无表达。实验组髓核细胞蛋白多糖mRNA及蛋白含量在转染后7d和14d时较4d时明显增高,14d时较7d时亦明显升高(P<0.05),对照组各时间点无统计学差异(P>0.05);4d时实验组与对照组比较无明显差异,7d和14d时较对照组明显增加(P<0.05)。同组各时间点Ⅰ型胶原mRNA及蛋白含量均无统计学差异,两组各时间点间比较无统计学差异(P>0.05)。实验组髓核细胞Ⅱ型胶原mRNA及蛋白含量在转染后7d和14d时较4d时明显增高,14d时较7d亦明显升高(P<0.05),对照组各时间点无统计学差异(P>0.05);实验组4d时与对照组比较无明显差异,7d和14d时较对照组明显增加(P<0.05)。结论:rAAV2-hBMP7转染犬髓核细胞后能表达hBMP7蛋白,并能提高其蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量。

辛伐他汀诱导促进骨形成蛋白-7基因修饰的兔间充质干细胞的成骨转化

目的:研究辛伐他汀诱导对骨形成蛋白-7(BMP-7)基因修饰的间充质干细胞(MSCs)增殖和分化表型的影响。方法:将辛伐他汀诱导和未经诱导的兔MSCs分别转导BMP-7基因后,Westernblotting检测转导后细胞BMP-7的表达;通过观察细胞生长以及碱性磷酸酶活性和测定骨钙素含量,分析辛伐他汀诱导对BMP-7基因修饰的MSCs的增殖和分化表型的影响。结果:转导后BMP-7基因在诱导组和未诱导组MSCs中均有表达,诱导组细胞BMP-7表达量、碱性磷酸酶活性和骨钙素含量均比较未诱导组明显增高。结论:转导前辛伐他汀诱导能够促进BMP-7基因修饰的MSCs的成骨转化。

人骨形成蛋白-7基因重组腺病毒的构建及其在兔骨髓间充质干细胞中的表达

目的 :克隆人骨形成蛋白 7(BMP 7)基因并构建其重组腺病毒 ,观察其在兔BMSc中的表达 .方法 :用RT PCR方法从人胎肾组织中克隆人BMP 7基因全长cDNA并测序 ;将BMP 7基因cDNA克隆到穿梭载体形成转移质粒pAd Track CMV BMP 7,经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier 1Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP 7并酶切鉴定 ,PacI酶切线性化后转染 2 93细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP 7,将AdBMP 7体外感染兔BMSc后 ,以RT PCR方法及观察AdEasy系统上的绿色荧光蛋白表达鉴定BMP 7基因的表达 .结果 :用RT PCR方法从胎肾组织中克隆出 1 2 96bp的cDNA ,测序证实为人BMP 7基因 ;酶切鉴定表明BMP 7基因已插入到 pAd Track CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒 pAdBMP 7构建成功 ;经 2 93细胞包装 3d后可观察到绿色荧光蛋白表达(GFP) ,氯化铯梯度离心法最终获得约 3× 1 0 9efu/L滴度的重组病毒 ;体外感染兔BMSc后RT PCR方法及荧光显微镜证实BMP 7基因可在兔BMSc中表达 .结论 :成功克隆人BMP 7基因并构建其重组腺病毒 ,证实了其在BMSc的表达 。

人骨形成蛋白-4和人骨形成蛋白-7在毕赤酵母中的共表达

利用人骨形成蛋白-4(hBM P 4)与人骨形成蛋白-7(hBM P 7)的成熟肽cDNA片段制备转基因毕赤酵母菌株,实现了hBM P 4与hBM P 7在巴斯德毕赤酵母细胞中的共表达.W estern-b lotting分析表明,表达产物含有hBM P 4与hBM P 7,片段大小分别为26 kD和17 kD,均为单体蛋白.

重组人骨形成蛋白牙槽嵴内诱导成骨的实验研究

目的：探讨原核表达重组人骨形成蛋白-7牙槽嵴内诱导成骨的作用效果。方法：拔除大白兔的切牙建立动物模型，以明胶海绵作为载体，将原核表达的重组人骨形成蛋白-7与之复合后植入即刻拔除牙齿的牙槽窝内进行干预治疗，通过扫描电镜观察及钙含量测定，探讨原核表达重组人骨形成蛋白-7牙槽嵴内诱导成骨的作用效果。结果：扫描电镜观察显示：实验组的骨创愈合比对照组大约提前4—6周；钙含量测定显示实验组明显高于对照组。差异有统计学意义。结论：重组人骨形成蛋白-7具有良好的诱导牙槽嵴内成骨的效果。

rhBMP-7对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的:观察重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的影响。方法:采用密度梯度离心法分离骨髓,体外培养扩增,获得小鼠骨髓间充质干细胞,贴壁培养至第3代,向培养液中加入rhBMP-7,培养5 d后进行碱性磷酸酶(ALP)染色,ALP活性与骨钙素(OC)含量检测,并用RT-PCR法分析成骨细胞标志基因骨钙素(OC)与Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)表达情况,Western blot法检测Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)蛋白的分泌量。结果:rhBMP-7诱导组的骨髓间充质干细胞的ALP染色强度、ALP活性及OC含量明显升高,OC与Col-Ⅰ的mRNA表达水平以及Col-Ⅰ的蛋白表达水平均明显提高。结论:rhBMP-7可促进体外培养的小鼠BMSCs向成骨细胞方向分化。