人骨骼肌源性血管内皮细胞对造血干/祖细胞的体外支持

背景:人骨骼肌源性血管内皮细胞位于血管壁,共表达肌肉干细胞和血管内皮细胞的标记(CD56^+CD34^+CD144^+CD45^-)。研究显示,人肌血管内皮细胞与间充质干细胞存在相似性,表达间充质干细胞表面标记物,具有多向分化潜能。目的:建立人肌血管内皮细胞作为滋养层与人脐血CD34^+细胞体外培养体系,以培养前后CD34^+细胞数量变化、免疫表型及集落形成能力为指标,评估人肌血管内皮细胞对造血干/祖细胞的体外支持效力。方法:实验分3组:①实验组:以人肌血管内皮细胞为滋养层与人脐血CD34~+细胞体外共培养;②对照组:以人骨髓间充质干细胞为滋养层与人脐血CD34^+细胞体外共培养;③空白对照组:人脐血CD34~+细胞单独培养。共培养第1,2,4周分析人脐血CD34^+细胞数量、血细胞免疫表型和造血干/祖细胞集落形成能力等指标,第5周时因无细胞存活故不进行检测。结果与结论:①人脐血CD34^+细胞数量变化:在1,2,4周时实验组比对照组有所增加,但二者差异均无显著性意义(P>0.05);②流式细胞术分析血细胞免疫表型:只有在第2周时对照组人脐血CD34^+细胞CD34^+CD33^-表达率略高于实验组,差异有显著性意义(P<0.05),其他亚型免疫表型CD45^+、CD14^+、CD10^+/CD19^+表达两组之间比较差异无显著性意义(P>0.05);③造血干/祖细胞集落形成能力:在1,2,4周时实验组与对照组造血干/祖细胞集落数量差异无显著性意义(P>0.05);④由于空白对照组无滋养层,人脐血CD34^+细胞数量在1周时明显下降,第2周计数无存活,因此未进行血细胞免疫表型及集落分析;⑤结果表明,人肌血管内皮细胞作为滋养层细胞具有与人骨髓间充质干细胞相似的体外造血支持作用。

多参数流式细胞术分选人骨骼肌源性血管内皮细胞和血管外膜细胞的方法

背景:目前分离骨骼肌源性干细胞广泛应用的方法是差速贴壁培养法,而运用多参数流式细胞术分选人骨骼肌源性干细胞的研究较为少见。目的:探索利用多参数流式细胞分选术从人体骨骼肌组织中分选高纯度肌源性血管内皮细胞和血管外膜细胞的方法。方法:收集人体骨骼肌组织,用胶原酶(Ⅰ型和Ⅳ型)及分散酶消化、获得单个核细胞,通过多参数流式细胞分选术分选表型为CD56^+CD34^+CD144^+CD45^-的肌血管内皮细胞和表型为CD146^+CD45^-CD34^-CD144^-CD56^-的肌血管外膜细胞。结果与结论:(1)利用多参数流式细胞分选术分选肌血管内皮细胞和肌血管外膜细胞各14例,肌血管内皮细胞在人骨骼肌单个核细胞中占(0.04±0.01)%,肌血管外膜细胞在人骨骼肌单个核细胞中占(0.30±0.07)%;(2)将新分选的细胞经过流式细胞仪回测后,肌血管内皮细胞纯度达到(96.8±1.16)%,肌血管外膜细胞纯度达到(92.50±0.50)%,锥虫蓝染色检测肌血管内皮细胞存活率达到(95.58±1.10)%,肌血管外膜细胞存活率达到(95.15±0.67)%;(3)肌血管内皮细胞和肌血管外膜细胞均能在体外诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,表明二者具有良好的多向分化能力;(4)实验建立了利用多参数流式细胞分选术分选肌血管内皮细胞和肌血管外膜细胞的有效方法,经过分选所得的肌血管内皮细胞和肌血管外膜细胞纯度高、活性良好。

黑枸杞花青素联合人脂肪源性血管外膜细胞支持脐血造血干/祖细胞的增殖

背景:黑枸杞花青素(Anthocyanins in Lycium ruthenicum Murr,ALRM)是黑枸杞中重要的活性成分之一,具有抗氧化、免疫调节等功效。人脂肪源性血管外膜细胞(CD146^(+)hAD-PCs)是骨髓间充质干细胞的前体细胞,在体外具有促进造血干/祖细胞增殖与分化的功能。ALRM联合CD146^(+)hAD-PCs对脐血造血干/组细胞的体外支持作用有待于研究。目的:探讨ALRM联合CD146^(+)hAD-PCs对脐血CD34^(+)造血干/祖细胞体外扩增的支持作用。方法:CCK-8法检测不同质量浓度ALRM(0,200,400,600,800,1000 mg/L)对CD146^(+)hAD-PCs增殖的影响;流式细胞术检测ALRM对CD146^(+)hAD-PCs细胞周期的影响。共培养实验分为空白组、ALRM组、CD146^(+)hAD-PCs组、ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组,分析ALRM联合CD146^(+)hAD-PCs对脐血CD34^(+)造血干/祖细胞的体外支持作用。共培养1,2,4周,比较扩增后细胞数量、集落形成单位数量,流式细胞仪检测细胞免疫表型,ELISA检测细胞因子水平。结果与结论:(1)ALRM质量浓度为200 mg/L时,CD146^(+)hAD-PCs活力最高,CD146^(+)hAD-PCs的G_(0)/G_(1)期细胞比例下降,S期、G_(2)/M期细胞比例上升(P<0.01)。(2)脐血CD34^(+)造血干/祖细胞数量变化:在共培养1,2,4周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组高于ALRM组(P均<0.05),在共培养2,4周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组高于CD146^(+)hAD-PCs组(P均<0.05),ALRM组与空白组随着共培养时间延长细胞数量逐渐减少。(3)集落形成能力及免疫表型分析:在共培养1,2周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组的集落形成单位数量高于CD146^(+)hAD-PCs组和ALRM组(P均<0.05);在共培养1,2,4周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组CD45^(+)、CD34^(+)CD33^(-)细胞比例高于CD146^(+)hAD-PCs组(P均<0.01)。(4)细胞因子变化:在共培养4周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组的白细胞介素2水平高于ALRM组、CD146^(+)hAD-PCs组(P<0.05);在共培养2,4周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组白细胞介素3水平高于CD146^(+)hAD-PCs组(P<0.05);在共培养1周时ALRM+CD146^(+)h AD-PCs组的粒细胞集落刺激因子水平高于CD146^(+)hAD-PCs组,在共培养2周时高于ALRM组、CD146^(+)hAD-PCs组(P<0.01);在共培养1,2,4周时ALRM组、ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组的干扰素γ水平低于CD146^(+)hAD-PCs组(P<0.05)。(5)由于空白组无基质细胞,脐血CD34^(+)造血干/祖细胞在共培养1周之后就无法计数,未进行免疫表型、集落分析和细胞因子检测。(6)结果表明:ALRM可以通过促进CD146^(+)hAD-PCs增殖和细胞周期转化进而促进脐血CD34^(+)造血干/祖细胞的体外扩增,在造血干细胞移植研究方面具有重要价值。

高良姜素通过下调lncRNA H19的表达抑制ox-LDL诱导的人源 正常主动脉内皮细胞血管生成活性

目的探索高良姜素对ox-LDL诱导的人源正常主动脉内皮细胞(HAECs)的影响及其机制。方法使用不同浓度(0、10、20、40、80μmol/L)的高良姜素孵育HAECs24h后,通过MTT检测细胞活性。以5mg/mLox-LDL诱导的HAECs为模型,使用20、40μmol/L高良姜素孵育24h。为观察高良姜素的作用机制,在HAECs中过表达lncRNAH19,使用40μmol/L高良姜素孵育24 h。通过qRT-PCR检测lncRNAH19的水平,划痕实验和血管形成实验用于观察迁移和管形成能力,使用流式细胞术检测ROS水平。通过Western blot检测VEGFA、MMP-2、MMP-9的蛋白水平。结果低浓度(0、10、20、40μmol/L)的高良姜素对细胞无明显毒性(P>0.05),而80μmol/L高良姜素会抑制HAECs细胞的活性(P<0.01)。ox-LDL诱导的HAECs中lncRNAH19的表达水平增加,高良姜素能降低ox-LDL诱导的HAECs的lncRNAH19的表达水平、迁移能力和血管形成能力,ROS水平以及VEGFA、MMP-2、MMP-9的蛋白水平(P<0.01)。但是,高良姜素的这些生物学作用均能被过表达lncRNAH19逆转(P<0.01)。结论高良姜素可能通过抑制lncRNAH19的表达以降低ox-LDL诱导的HAECs的迁移、氧化应激和血管形成能力来发挥治疗动脉粥样硬化的潜力。

碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子在糖尿病骨骼肌病变中的变化及意义

目的探讨糖尿病骨骼肌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化及其在糖尿病骨骼肌病变中的作用。方法选用Wistar大鼠,随机分成4组:正常对照组、单纯后肢缺血组、糖尿病组和糖尿病后肢缺血组。以四氧嘧啶50mg/kg尾静脉注射制造糖尿病模型。糖尿病造模后2周结扎右股动脉制造缺血模型。10周后,观察腓肠肌病理形态学改变,同时采用免疫组化方法检测bFGF和VEGF蛋白表达情况。结果糖尿病组骨骼肌表现为普遍性肌萎缩,肌纤维变性坏死。单纯缺血组和糖尿病组bFGF蛋白表达减弱(表达阳性率分别为53.66%和35.51%),糖尿病后肢缺血组bFGF的阳性率为25.42%,下降明显穴P<0.01雪。糖尿病缺血组VEGF表达阳性率为20.68%,低于单纯缺血组(54.04%,P<0.01)。结论高血糖和缺血引起肌肉中bFGF及VEGF等生长因子的变化可能是糖尿病骨骼肌萎缩的重要原因之一。

人骨骼肌源性血管外膜细胞对人脐血CD34^+细胞的体外造血支持作用

背景:研究显示血管外膜细胞是间充质干细胞的前体细胞,其通过细胞接触或旁分泌效应调节造血干细胞的行为并支持造血,人骨骼肌源性血管外膜细胞对造血的支持作用有待于研究。目的:从人骨骼肌中分离培养血管外膜细胞并进行生物学特性鉴定,研究其对脐血CD34^+细胞的体外支持作用。方法:①利用多参数流式细胞术从人骨骼肌中分选表型为CD146^+CD56^-CD34^-CD144^-CD45^-的血管外膜细胞,并对其进行生物学鉴定;②建立以CD146^+人骨骼肌源性血管外膜细胞为滋养层的脐血CD34^+细胞体外培养体系(实验组),以人骨髓间充质干细胞为滋养层的脐血CD34^+细胞体外培养体系为阳性对照组,共培养1,2,4周检测培养体系的细胞数量、集落形成能力及免疫表型并进行统计分析。结果与结论:①通过多参数流式细胞术分选出CD146+人骨骼肌源性血管外膜细胞,回测纯度为(91.5±1.85)%(n=5);其表达间充质干细胞表面抗原CD73、CD90、CD105、CD44,不表达造血细胞及内皮细胞表面抗原CD45、CD34、CD31;经诱导培养可向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及肌细胞分化;②实验组与阳性对照组相比,在细胞数、集落形成能力及免疫表型方面(CD45^+、CD34^+CD33^-、CD14^+、CD10^+/CD19)差异均无显著性意义(P> 0.05,n=6);无滋养层的空白对照组培养1周时细胞数量明显减少,2周时几乎无细胞存活;③结果表明,CD146^+人骨骼肌源性血管外膜细胞与人骨髓间充质干细胞一样对脐血CD34^+细胞具有体外支持作用。

枸杞多糖联合人骨骼肌源性血管外膜细胞对人脐血CD34+细胞造血支持的体外研究

目的探讨枸杞多糖(LBP)对人脐血CD34^(+)造血干/祖细胞(UCB CD34^(+)HSPCs)体外扩增的效力。方法利用CCK-8法检测不同浓度LBP对CD146^(+)hMD-PCs增殖率的影响;流式细胞术检测LBP对CD146^(+)hMD-PCs细胞周期的影响;UCB CD34^(+)HSPCs的体外共培养实验分为LBP^(+)CD146^(+)hMD-PCs组、LBP组、CD146^(+)hMD-PCs组和空白对照组,于培养的1、2、4周分别对各组扩增后细胞数量、集落数量和免疫表型进行分析比较。结果CCK-8及流式细胞周期检测显示,与未添加LBP组比较,当LBP浓度为150 mg·L^(-1)时,CD146^(+)hMD-PCs细胞活力升高,G0/G1期细胞比例减少,S期、G2/M期细胞比例升高(P均<0.01)。共培养第1、2、4周后,LBP^(+)CD146^(+)hMD-PCs组细胞数量均多于CD146^(+)hMD-PCs组及LBP组,CD45^(+)、CD34^(+)CD33^(-)、CD10^(+)CD19^(+)、CD14^(+)细胞比例均高于LBP组,且LBP^(+)CD146^(+)hMD-PCs组集落形成单位数量均多于CD146^(+)hMD-PCs组(P均<0.05);与CD146^(+)hMD-PCs组相比,LBP组在共培养第1、2、4周后细胞数量均降低,CD45^(+)、CD34^(+)CD33^(-)、CD14^(+)细胞比例均降低;CD10^(+)CD19^(+)细胞比例在共培养第2、4周后均降低(P均<0.05);在共培养第2周时,LBP组细胞数量多于空白对照组(P<0.01)。结论LBP可以通过促进CD146^(+)hMD-PCs的增殖从而促进UCB CD34^(+)HSPCs的体外扩增。

牙源性干细胞促血管化与组织再生的研究进展

牙源性干细胞具有间充质干细胞特性,通过与内皮细胞相互作用或分泌多种血管生成相关细胞因子促进血管再生。目前已分离并鉴定出的牙源性干细胞主要包括牙髓干细胞、脱落乳牙干细胞、牙周膜干细胞、根尖牙乳头干细胞、牙龈间充质干细胞和牙囊干细胞。本文通过整理分析近年文献资料,对上述牙源性干细胞促血管生成与组织再生的相关研究进展进行综述。

伴嗜酸性粒细胞增多性血管淋巴样增生一例并文献复习

伴嗜酸性粒细胞增多性血管淋巴样增生是一种少见的良性肿瘤,临床上易误诊。本文报告1例,患者,女,55岁,左侧枕部头皮赘生物偶伴瘙痒半年余。皮损组织病理检查:表皮角化过度伴角化不全;真皮血管内皮细胞增生,细胞核凸向管腔,呈“墓碑状”;管周淋巴细胞等炎细胞浸润,未发现嗜酸性粒细胞。予以手术切除。

血小板源性生长因子和血小板源性内皮细胞生长因子在内皮细胞和血管平滑肌细胞中的作用研究

目的通过体外转染血小板源性生长因子(PDGF)和血小板源性内皮细胞生长因子(PD-ECGF)质粒,观察两种生长因子对人脐静脉内皮细胞EAHY926和主动脉血管平滑肌细胞T/G HA-VSMC的影响,评估两种生长因子对血管损伤治疗的可行性。方法构建人pc DNA 3.1(+)空载(空载组)、pc DNA 3.1(+)-PDGF-透明质酸(HA)(PPH组)和pc DNA 3.1(+)-PD-ECGF-HA(PPEH组)质粒,分别转染入EAHY926和T/G HA-VSMC中,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测内源性PD-ECGF和外源性PD-ECGF对EAHY926和T/G HA-VSMC细胞增殖的影响;细胞伤痕实验观察内源性PD-ECGF和外源性PD-ECGF对EAHY926和T/G HA-VSMC细胞迁移速度的影响。结果 MTT法检测3组EAHY926吸光度值比较,差异有统计学意义(F=235.18,P<0.001),其中PPH组高于空载组和PPEH组(P<0.05);空载组与PPEH组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。MTT法检测3组T/G HA-VSMC吸光度值比较,差异有统计学意义(F=82.89,P<0.001),其中PPH组高于空载组(P<0.05);PPEH组低于空载组(P<0.05)。MTT法检测转染PPEH质粒的培养基(L-PPEH)对PPH诱导的EAHY926和T/G HA-VSMC增殖的影响,空载组、PPH组、PPH+L-PPEH组EAHY926吸光度值比较,差异无统计学意义(F=512.89,P=0.183)。空载组、PPH组、PPH+L-PPEH组T/G HA-VSMC吸光度值比较,差异有统计学意义(F=317.40,P<0.001);其中PPH组高于空载组和PPH+L-PPEH组(P<0.05)。细胞伤痕实验证实,转染PPEH质粒的EAHY926、T/G HA-VSMC细胞迁移能力增强;PPEH组EAHY926平均细胞迁移距离百分比(56.1%±2.2%)较空载组(27.8%±3.4%)升高(t=-15.08,P<0.001);PPEH组T/G HA-VSMC平均细胞迁移距离百分比(69.1%±2.3%)较空载组(43.6%±5.8%)升高(t=-33.64,P<0.001)。用转染PPEH质粒的培养基培养EAHY926、T/G HA-VSMC发现,外源性PD-ECGF处理的EAHY926、T/G HA-VSMC细胞迁移能力亦明显增强。结论通过转染PDGF质粒,模拟血管损伤后内皮细胞和平滑肌细胞受到PDGF和/或PD-ECGF刺激,发现PDGF能明显上调内皮细胞和血管平滑肌的增殖和迁移。PD-ECGF对血管内皮细胞增殖的效果不明显,但能上调血管内皮细胞和血管平滑肌的迁移速度;同时PD-ECGF能抑制血管内皮细胞的增殖。两种因子同时使用能抑制平滑肌细胞的过度增殖,促进内皮细胞和平滑肌细胞的迁移。两者联合使用可能成为促进经皮冠状动脉介入术(PCI)后损伤血管恢复及预防血管再狭窄的新策略。

丹参阻抑慢性肺源性心脏病肺血管内皮细胞损伤的效应与途径

目的:探讨丹参注射液治疗慢性肺源性心脏病(简称肺心病)时对肺血管内皮细胞损伤的保护作用,以及对血管内皮细胞分泌功能的影响。方法:选择1999-02/08吉林大学第四医院呼吸内科收治的慢性肺心病急性发作期患者44例。随机分为丹参组和对照组,各22例。对照组给予一般常规治疗,丹参组在一般常规治疗同时加用丹参注射液静脉滴注,50g/L葡萄糖注射液250mL中加丹参注射液20mL,1次/d,连用14d。两组治疗前后均采血测定静脉血循环内皮细胞、血浆内皮素-1。采用ABL-520型血液气体酸碱分析仪检测动脉血酸碱度、动脉血氧分压、动脉血二氧化碳分压。结果:纳入患者44例,均进入结果分析。①循环内皮细胞:丹参组治疗后较治疗前下降明显[(0.87±0.23),(1.27±0.26)×107L-1,t=7.99,P=0.000];对照组治疗后较治疗前下降不明显[(1.09±0.28),(1.19±0.26)×107L-1,t=2.00,P=0.059];治疗后丹参组与对照组比较下降明显(t=4.03,P=0.000)。②内皮素-1:丹参组治疗后较治疗前下降明显[(70±14),(105±26)ng/L,t=8.64,P=0.000];对照组治疗后较治疗前下降不明显[(88±23),(99±24)ng/L,t=2.00,P=0.059];治疗后丹参组与对照组比较下降明显(t=3.99,P=0.000)。③直线相关分析:循环内皮细胞与内皮素-1呈显著正相关(r=0.733,P<0.01);与动脉血氧分压呈显著负相关(r=-0.751,P<0.01);而与动脉血酸碱度、动脉血二氧化碳无明显相关性(r=-0.115,0.237,P>0.05)。结论:丹参对于慢性肺心病患者的肺血管内皮细胞具有保护作用,使其免受损伤和对抗内皮素-1,使内皮素-1合成减少,或同时使内皮素-1灭活增加,从而达到阻抑或减轻肺血管内皮细胞损伤而带来的一系列病理反应。

脂肪来源干细胞联合胶原蛋白生物工程支架移植干预大鼠慢性难愈合性创面血管内皮生长因子的表达

背景:生物工程支架是临床治疗慢性难愈合性创面的常用方法,具有一定的疗效,但也存在一些问题。脂肪来源干细胞作为新兴的治疗慢性难愈合性创面的方法具有其独特的疗效和优势。但是,脂肪来源干细胞和生物工程支架联合应用治疗慢性难愈合性创面的疗效和机制尚不清楚。目的:研究脂肪来源干细胞联合胶原蛋白生物工程支架移植对慢性难愈性创面血管内皮生长因子表达的影响。方法:实验共选取31只SD大鼠,购自上海斯莱克实验动物责任有限公司。取1只大鼠腹股沟处脂肪,分离培养原代脂肪来源干细胞。将另外30只SD大鼠随机分为对照组、模型组、支架组、脂肪来源干细胞组和联合组。对照组制备全层皮肤缺损创面(在大鼠腰椎正中偏上部两侧分别制备1处全层皮肤缺损伤口),术后每日常规换药;其余各组制备2处慢性难愈合性创面(同对照组制备全层皮肤缺损伤口,创面局部注射醋酸氢化可的松);模型组术后每日给予常规换药;支架组术后给予生物蛋白工程支架覆盖创面;脂肪来源干细胞组给予自体自体脂肪干细胞移植;联合组在脂肪来源干细胞移植后给予生物工程支架覆盖创面。干预7d后取材,观察创面情况,测量创面面积大小;采用免疫组化法检测血管内皮生长因子表达,采用Westernblot检测血管内皮生长因子蛋白表达量,采用qP CR检测血管内皮生长因子mR NA表达情况。结果与结论:(1)对照组创面面积显著小于其他组创面面积(P <0.05);联合组创面面积显著小于模型组、支架组和脂肪来源干细胞组(P<0.05);(2)对照组血管内皮生长因子表达水平最高,血管内皮生长因子蛋白和mR NA表达水平均显著高于其他组(P <0.05);联合组血管内皮生长因子表达较高,血管内皮生长因子蛋白和mR NA表达水平显著多于模型组、支架组和脂肪来源干细胞组(P <0.05);(3)结果提示,脂肪来源干细胞联合胶原蛋白生物工程支架移植上调难愈合性创面血管内皮生长因子表达,促进创面愈合。

外源性bFGF对深度烫伤大鼠创面血管内皮细胞增殖与迁移的影响

目的 观察大鼠深 度烫伤创面敷用 b FGF后肉芽组织中血管增殖与迁移情况 ,以及相关信号蛋白的表达情况。 方法 Wistar大鼠 133只随机分为正常对照 A组 (n=7)、单纯烫伤 B组 (n=4 2 )、b FGF治疗 C组 (n=4 2 )、c- fos抗体 D组 (n=4 2 )。利用大鼠 30 %深 度烫伤模型 ,于伤后 3、6小时 ,1、3、7、 14和 2 1天取创面皮肤标本 ,运用免疫组织化学染色 ,检测真皮内血管形成的情况 ,原位杂交和免疫组织化学技术观察血管内皮细胞增殖细胞核抗原 (proliferation cell nuclear antigen,PCNA)、黏着斑蛋白激酶 (focal adhesion kinase,FAK)及 c- fos的表达情况。免疫荧光手段观察细胞外信号调节激酶 (extracellularsignal- regulated kinase,ERK)在血管形成中的激活情况。 结果 B、C组于伤后 7天血管内皮细胞增殖明显 ,14天后 FAK的表达也显著增加。损伤后 3～ 6小时 ERK的表达增强 ,随后 1～ 3天 ,c- fos亦发生相对应的变化。各时间点 D组血管内皮细胞 PCNA和 FAK的表达均减弱 ,肉芽组织中微血管的数量低于 B组。敷用外源性的 b FGF后 ,血管内皮细胞的增殖与前者变化不显著 ,但 FAK的表达较 A组增强明显 ,ERK的表达也显著增加 ,特别是 c- fos也在伤后 1～ 3天呈增强趋势。 结论 使用外源性 b

大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞的体外培养与鉴定

目的：目前内皮祖细胞主要从骨髓、脐带血和外周血获取,但其分离培养方法尚不成熟,外周血来源因损伤小、易获取而被普遍使用,但得到的内皮祖细胞纯度较低。实验拟探讨大鼠骨髓来源内皮祖细胞体外培养、诱导扩增和生物学特性鉴定方法。方法：实验于2006-08/2007-08在南昌大学第一附属医院泌外研究所完成。①实验材料：2周龄SD大鼠由南昌大学医学院动科部提供,雌雄不拘,清洁级,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：应用梯度离心法采集大鼠骨髓单个核细胞,贴壁筛选法分离内皮祖细胞,置于添加了血管内皮细胞生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子的M199培养液中扩增培养,对培养2周的细胞采用免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体-2、CD34、CD133,采用RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因表达。结果：①培养4d,光电显微镜下可见细胞集落形成,梭形贴壁细胞从集落中央以放射状向外周生长。培养7-10d,细胞集落相互连接,呈典型的＂鹅卵石＂样外观。2周左右可见细胞排列成条索状结构并可呈“微血管样”排列生长。②贴壁细胞免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、FLK-1、CD34、CD133阳性,RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因阳性表达。结论：采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞,经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养和体外扩增。

成年大鼠骨骼肌肌源性干细胞向神经细胞的分化

目的研究成体骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)向神经细胞分化的潜能。方法从成年SD大鼠骨骼肌组织中培养出肌源性干细胞,采用bFGF、EGF诱导出神经球样细胞团,并检测nestin表达。再在贴壁培养条件下,用RA、BDGF诱导分化,并检测NSE、GFAP的表达。结果MDSCs能被诱导出神经球样细胞团,并表达nestin。这些细胞进一步诱导,部分细胞表现出神经元样或胶质细胞样形态,并表达NSE或GFAP。结论MDSCs能向神经细胞样细胞分化,有望用于神经系统疾病的治疗。

重组人血小板源性生长因子对人视网膜血管内皮细胞生物学行为的促进作用及其机制

目的探讨重组人血小板源性生长因子-BB（rhPDGF-BB）对人视网膜血管内皮细胞（hRVECs）增生和迁移的影响及其作用机制。方法采用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液培养hRVECs，分别将10、50和200 ng/ml rhPDGF-BB加入对数生长期hRVECs的培养液，未添加rhPDGF-BB者作为正常对照组。采用细胞计数试剂盒-8（CCK8）法检测各组细胞的增生情况；采用细胞划痕法检测细胞相对迁移面积（迁移后无细胞区面积/划痕初期无细胞区面积）；采用逆转录PCR法检测hRVECs中rhPDGF-BB受体（rhPDGF-BBR）mRNA的相对表达量；采用实时荧光定量PCR法检测hRVECs中VEGF mRNA和整合素mRNA相对表达量。结果培养的hRVECs生长良好，用rhPDGF-BBR引物能扩增出与引物设计长度相符的表达条带。正常对照组及10、50和200 ng/ml rhPDGF-BB组培养细胞后24 h细胞增生值（A）分别为1.01±0.05、1.09±0.04、1.10±0.02和1.13±0.05，10、50和200 ng/ml rhPDGF-BB组A值明显高于正常对照组，差异均有统计学意义（t＝2.504、3.430、3.483，均P〈0.05）；细胞划痕试验后24 h，正常对照组及10、50和200 ng/ml rhPDGF-BB组细胞相对迁移面积分别为0.42±0.10、0.38±0.09、0.55±0.06和0.61±0.05，划痕试验后48 h细胞相对迁移面积分别为0.75±0.06、0.81±0.02、0.87±0.02和0.98±0.02，总体比较差异均有统计学意义（F分组＝16.283，P＝0.000；F时间＝209.129，P＝0.000），随着rhPDGF-BB剂量增加和作用时间延长，细胞相对迁移面积均明显增加；实时荧光定量PCR法检测显示正常对照组及10、50和200 ng/ml rhPDGF-BB组hRVECs中整合素mRNA相对表达量分别为1.06±0.02、1.30±0.10、1.20±0.16和1.27±0.08，VEGF mRNA相对表达量分别为0.97±0.05、1.06±0.16、1.58±0.18和1.66±0.21，其中50 ng/ml和200 ng/ml rhPDGF-BB组细胞中整合素mRNA及VEGF mRNA相对表达量均明显高于正常对照组，差异均有统计学意义（整合素mRNA：t＝3.900、4.014，均P〈0.05；VEGF mRNA：t＝6.940、7.210，均P〈0.05）。结论rhPDGF-BBR促进hRVECs的增生和迁移，其作用呈剂量和时间依赖性，其可能与上调VEGF和整合素在细胞中的表达有关。

髓源性抑制细胞对脂多糖诱导的血管内皮细胞凋亡的保护作用

目的探讨髓源性抑制细胞(MDSCs)对LPS诱导的内皮细胞凋亡是否有保护作用。方法采用流式分选技术从脓毒症患者外周血中分离MDSCs,将其与LPS预处理过的人脐带静脉内皮细胞(HUVECs)共培养设为实验组,HUVECs未经任何处理设为空白组,HUVECs经LPS刺激设为对照组。通过Hoechst染色观察各组细胞形态学上的变化,通过CCK-8以及流式测凋亡检测各组内皮细胞增殖、凋亡的情况。结果选择用浓度为10μg/mL的LPS刺激HUVEC 6 h构建脓毒症细胞模型。实验组内皮细胞增殖活性优于对照组(OD值:1.018 vs. 0.852,P=0.008),低于空白组(OD值:1.018 vs. 1.214,P=0.002);实验组凋亡率低于对照组(凋亡率:12.90%vs. 18.65%,P <0.001),高于空白组(凋亡率:12.90%vs.18.65%,P <0.001)。结论 MDSCs能促进LPS诱导的内皮细胞增殖、减少其凋亡,对内皮细胞的损伤及凋亡具有保护作用。

碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对骨骼肌源性干细胞的促增殖效应

目的观察碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)和表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)单独及联合应用对骨骼肌源性干细胞(musclederivedstemcells,MDSCs)生长的影响。方法取出生24h内的昆明小鼠15只,采用连续预贴壁法从小鼠后肢肌分离培养MDSCs,用含2%胎牛血清的DMEM培养基促进其向骨骼肌细胞分化。取原代MDSCs及MDSCs分化细胞,采用免疫细胞化学染色检测干细胞标志Sca-1和骨骼肌细胞标志α-Sarcomeric肌动蛋白的表达。HE染色观察细胞肌管形成。MTT比色法检测不同浓度(6.25、12.50、25.00、50.00、100.00ng/ml)的bFGF和EGF单独应用96h对MDSCs增殖的影响以及二者(100.00ng/ml)联合作用24、48、72和96h对MDSCs增殖的影响。结果从新生小鼠后肢肌成功分离培养MDSCs,免疫细胞化学染色90%以上的MDSCs呈Sca-1阳性,分化形成的肌管呈α-Sarcomeric肌动蛋白阳性。HE染色可见肌管形成。bFGF、EGF对MDSCs的促增殖效应随浓度的增加而增加。与阴性对照组比较,bFGF于12.50ng/ml出现促增殖效应(P<0.05);25.00ng/ml组与12.50ng/ml组比较,作用提高(P<0.01);50.00、100.00ng/ml组较25.00ng/ml组无明显提升(P>0.05);EGF的作用与bFGF类似,但于50.00ng/ml时趋于饱和。与阴性对照组比较,EGF于72h、bFGF于96h表现促增殖效应(P<0.01),而二者联合应用于24h即表现促增殖效应(P<0.01),并于48、72和96h增殖效应均较单独应用显著提高(P<0.05)。结论bFGF和EGF都能促进MDSCs的增殖,联合作用更快、更强。

大鼠自体骨骼肌卫星细胞移植治疗心肌梗死后血清血管内皮生长因子的改变及其意义

目的:了解自体骨骼肌卫星细胞移植治疗大鼠心肌梗死后血清血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的改变及临床意义。方法:30只Wistar大鼠随机分为移植组(n=15)及对照组(n=15),所有大鼠经结扎冠状动脉前降支建立心肌梗死模型。将体外培养2周的大鼠自体卫星细胞以注射的方式移植到梗死区周围,4周后病理观察移植细胞的生长、增殖情况及缺血心肌毛细血管密度的改变,并测定血清VEGF浓度及血流变参数的改变。结果:卫星细胞在梗死区中可增殖分化为横纹肌纤维,与对照组相比,移植组的缺血心肌毛细血管密度犤(523.42±82.14)和(430.73±65.04)/mm2,t=2.98,P<0.01犦、血清VEGF质量浓度明显增高犤(320.05±39.29)和(271.14±37.52)μg/L,t=2.37,P<0.05犦,而某些血液流变参数明显改善犤低切全血黏度:(11.09±1.52)和(13.02±1.56)mPa·s,t=2.22,P<0.05;红细胞聚集指数:7.59±0.81和8.56±0.59,t=3.25,P<0.01;卡松黏度:(1.64±0.41)和(2.26±0.41)mPa·s,t=3.66,P<0.01;卡松屈服应力:(11.23±1.54)和(12.69±1.59)Pa,t=2.23,P<0.05犦。结论:卫星细胞在心肌梗死区中可增殖分化为横纹肌样细胞,并通过自分泌和旁分泌的形式提高血清VEGF浓度,由此改善血流变参数及缺血心肌毛细血管密度。

ANCA相关性血管炎存在血管内皮细胞血栓调节蛋白以及内皮源性一氧化氮合酶弥漫性丢失

目的探索ANCA相关性血管炎(antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis,AAV)微小动脉和静脉的血管内皮细胞膜结合性血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)、内皮源性一氧化氮合酶(endothelial-nitricoxide synthase,eNOS)的表达规律。方法 12例经过临床、血清免疫学检查证实的AAV患者,2例Wegerner肉芽肿、5例显微镜下多血管炎和5例Churg-Strause综合征。Birmingham血管炎活动评分提示疾病处于活动期。均进行腓肠神经活检标本的常规组织学染色以及以抗CD68、CD3、CD20、血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)、eNOS以及第八因子(von Willebrand factor,vWF)抗体为第一抗体的免疫组织化学染色,以正常血管为对照。结果 12例患者的腓肠神经病理检查发现9例活动性血管炎,可见大量CD68阳性单核细胞和CD3阳性淋巴细胞浸润。和对照组相比,所有患者微小动脉和毛细血管内皮细胞eNOS和TM减低或消失,包括无炎细胞浸润血管,其中eNOS的下降程度较TM更明显。Churg-Strause综合征的血管内皮细胞eNOS和TM下降最显著。结论 AAV外周血管存在血管内皮细胞TM和eNOS弥漫性下降,两者下降程度在AAV不同亚型之间存在差异。