推拿法样刺激对人骨骼肌细胞内钙离子的影响

目的：观察推拿[扌衮]法样刺激对人骨骼肌细胞内钙离子的影响.方法：采用细胞培养技术,建立人骨骼肌细胞损伤模型,将人骨骼肌正常细胞和损伤细胞各自分为空白对照组、[扌衮]法样刺激组、维拉帕米（Ca^2＋拮抗剂）组,各给予相同的[扌衮]法样刺激10min,干预后检测各组细胞内钙离子浓度、Ca^2＋-ATPase活性、DHPR mRNA.结果：空白对照组损伤细胞钙离子浓度明显高于正常细胞（P〈0.05）,[扌衮]法样刺激组损伤细胞内钙离子浓度显著低于空白对照组及维拉帕米组（P〈0.05）;[扌衮]法样刺激组正常骨骼肌细胞和损伤骨骼肌细胞Ca^2＋-ATPase活性均高于空白对照组及维拉帕米组（P〈0.05）;[扌衮]法样刺激组损伤细胞DHPR mRNA相对表达量显著高于空白对照组（P〈0.05）.结论：损伤骨骼肌细胞内外存在钙离子失衡;推拿手法通过力学作用增强骨骼肌细胞Ca^2＋-ATPase活性、DHPR mRNA表达等生物学效应,改善损伤细胞中钙超载现象,促进损伤细胞修复.

TLR4对人骨骼肌细胞炎症因子表达及胰岛素抵抗的影响

目的:研究TLR4对脂多糖(LPS)及Polymymin B(PMB)作用下的人骨骼肌细胞的炎症因子表达的影响及其在细胞胰岛素抵抗中的作用。方法:通过脂多糖(LPS)及Polymymin B(PMB)干预骨骼肌细胞24h,再用胰岛素刺激1h后,Real-time PCR检测检测骨骼肌细胞TLR4、MyD88、TNF-αmRNA的表达;Western blot检测TLR4,Myd88和CRP的表达;葡萄糖氧化酶法(GOD-POD法)检测细胞培养液中葡萄糖浓度。结果:TLR4高表达可以使炎症因子的表达增高,细胞培养液中的葡萄糖浓度增高;TLR4低表达可使炎症因子的表达降低,细胞培养液中的葡萄糖浓度没有明显变化。结论:TLR4调控了炎症因子的表达,继而可以引起胰岛素敏感性的改变,影响了胰岛素抵抗的发生。

阳离子脂质体转染人类骨骼肌原代细胞的初步研究

探讨不同脂质体介导基因转染人类骨骼肌原代细胞的转染效率和基因的表达。将含有β-半乳糖苷酶LacZ结构基因的质粒,用三种不同的阳离子脂质体导入人类骨骼肌原代细胞中,通过X-Gal染色观察不同的转染效率。结果发现,Fugene 6转染效率最高,蓝染细胞达10%,其脂质体与DNA的最佳比例为3∶2。Fugene 6可有效地将外源基因导入骨骼肌原代细胞,而且外源基因可以长效高效地表达,有望用来作为基因治疗的载体。

人骨骼肌源性血管外膜细胞对人脐血CD34^+细胞的体外造血支持作用

背景:研究显示血管外膜细胞是间充质干细胞的前体细胞,其通过细胞接触或旁分泌效应调节造血干细胞的行为并支持造血,人骨骼肌源性血管外膜细胞对造血的支持作用有待于研究。目的:从人骨骼肌中分离培养血管外膜细胞并进行生物学特性鉴定,研究其对脐血CD34^+细胞的体外支持作用。方法:①利用多参数流式细胞术从人骨骼肌中分选表型为CD146^+CD56^-CD34^-CD144^-CD45^-的血管外膜细胞,并对其进行生物学鉴定;②建立以CD146^+人骨骼肌源性血管外膜细胞为滋养层的脐血CD34^+细胞体外培养体系(实验组),以人骨髓间充质干细胞为滋养层的脐血CD34^+细胞体外培养体系为阳性对照组,共培养1,2,4周检测培养体系的细胞数量、集落形成能力及免疫表型并进行统计分析。结果与结论:①通过多参数流式细胞术分选出CD146+人骨骼肌源性血管外膜细胞,回测纯度为(91.5±1.85)%(n=5);其表达间充质干细胞表面抗原CD73、CD90、CD105、CD44,不表达造血细胞及内皮细胞表面抗原CD45、CD34、CD31;经诱导培养可向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及肌细胞分化;②实验组与阳性对照组相比,在细胞数、集落形成能力及免疫表型方面(CD45^+、CD34^+CD33^-、CD14^+、CD10^+/CD19)差异均无显著性意义(P> 0.05,n=6);无滋养层的空白对照组培养1周时细胞数量明显减少,2周时几乎无细胞存活;③结果表明,CD146^+人骨骼肌源性血管外膜细胞与人骨髓间充质干细胞一样对脐血CD34^+细胞具有体外支持作用。

人骨骼肌源性血管内皮细胞对造血干/祖细胞的体外支持

背景:人骨骼肌源性血管内皮细胞位于血管壁,共表达肌肉干细胞和血管内皮细胞的标记(CD56^+CD34^+CD144^+CD45^-)。研究显示,人肌血管内皮细胞与间充质干细胞存在相似性,表达间充质干细胞表面标记物,具有多向分化潜能。目的:建立人肌血管内皮细胞作为滋养层与人脐血CD34^+细胞体外培养体系,以培养前后CD34^+细胞数量变化、免疫表型及集落形成能力为指标,评估人肌血管内皮细胞对造血干/祖细胞的体外支持效力。方法:实验分3组:①实验组:以人肌血管内皮细胞为滋养层与人脐血CD34~+细胞体外共培养;②对照组:以人骨髓间充质干细胞为滋养层与人脐血CD34^+细胞体外共培养;③空白对照组:人脐血CD34~+细胞单独培养。共培养第1,2,4周分析人脐血CD34^+细胞数量、血细胞免疫表型和造血干/祖细胞集落形成能力等指标,第5周时因无细胞存活故不进行检测。结果与结论:①人脐血CD34^+细胞数量变化:在1,2,4周时实验组比对照组有所增加,但二者差异均无显著性意义(P>0.05);②流式细胞术分析血细胞免疫表型:只有在第2周时对照组人脐血CD34^+细胞CD34^+CD33^-表达率略高于实验组,差异有显著性意义(P<0.05),其他亚型免疫表型CD45^+、CD14^+、CD10^+/CD19^+表达两组之间比较差异无显著性意义(P>0.05);③造血干/祖细胞集落形成能力:在1,2,4周时实验组与对照组造血干/祖细胞集落数量差异无显著性意义(P>0.05);④由于空白对照组无滋养层,人脐血CD34^+细胞数量在1周时明显下降,第2周计数无存活,因此未进行血细胞免疫表型及集落分析;⑤结果表明,人肌血管内皮细胞作为滋养层细胞具有与人骨髓间充质干细胞相似的体外造血支持作用。

枸杞多糖联合人骨骼肌源性血管外膜细胞对人脐血CD34+细胞造血支持的体外研究

目的探讨枸杞多糖(LBP)对人脐血CD34^(+)造血干/祖细胞(UCB CD34^(+)HSPCs)体外扩增的效力。方法利用CCK-8法检测不同浓度LBP对CD146^(+)hMD-PCs增殖率的影响;流式细胞术检测LBP对CD146^(+)hMD-PCs细胞周期的影响;UCB CD34^(+)HSPCs的体外共培养实验分为LBP^(+)CD146^(+)hMD-PCs组、LBP组、CD146^(+)hMD-PCs组和空白对照组,于培养的1、2、4周分别对各组扩增后细胞数量、集落数量和免疫表型进行分析比较。结果CCK-8及流式细胞周期检测显示,与未添加LBP组比较,当LBP浓度为150 mg·L^(-1)时,CD146^(+)hMD-PCs细胞活力升高,G0/G1期细胞比例减少,S期、G2/M期细胞比例升高(P均<0.01)。共培养第1、2、4周后,LBP^(+)CD146^(+)hMD-PCs组细胞数量均多于CD146^(+)hMD-PCs组及LBP组,CD45^(+)、CD34^(+)CD33^(-)、CD10^(+)CD19^(+)、CD14^(+)细胞比例均高于LBP组,且LBP^(+)CD146^(+)hMD-PCs组集落形成单位数量均多于CD146^(+)hMD-PCs组(P均<0.05);与CD146^(+)hMD-PCs组相比,LBP组在共培养第1、2、4周后细胞数量均降低,CD45^(+)、CD34^(+)CD33^(-)、CD14^(+)细胞比例均降低;CD10^(+)CD19^(+)细胞比例在共培养第2、4周后均降低(P均<0.05);在共培养第2周时,LBP组细胞数量多于空白对照组(P<0.01)。结论LBP可以通过促进CD146^(+)hMD-PCs的增殖从而促进UCB CD34^(+)HSPCs的体外扩增。

高糖环境对HSkMCs细胞株线粒体融合蛋白2表达及细胞凋亡的影响

目的:探讨高糖对人骨骼肌细胞株(HSkMCs)线粒体融合蛋白2(mfn2)表达及细胞凋亡的影响。方法:体外培养HSkMCs细胞株,将细胞分别以5.55 mmol/L,11.10 mmol/L,22.20 mmol/L葡糖糖培养48 h,检测mfn2mRNA表达及细胞凋亡情况。RT-PCR法测定基因表达,流式细胞技术检测细胞凋亡。结果:以5.55 mmol/L葡萄糖组培养48 h为基础对照,11.10 mmol/L组mfn2表达较对照组下降12.3%(P<0.05);22.20 mmol/L组mfn2表达较对照组降低47.3%(P<0.05);对照组细胞凋亡率为(1.80±0.57)%,11.10 mmol/L葡萄糖组细胞凋亡率为(13.23±1.47)%,22.20 mmol/L葡萄糖组细胞凋亡率为(24.03±3.05)%,均较对照组显著增加(P<0.05)。结论:高糖可诱导HSkMCs细胞mfn2 mRNA表达下调,增加其凋亡。

细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶抑制剂4a信号通路对人骨骼肌成肌细胞衰老的诱导及对线粒体膜电位的调控

目的观察细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶抑制剂4a（INK4a）信号通路对线粒体功能的影响。方法重组慢病毒载体pLVX-p16^INK4a被构建出并感染第3代人骨骼肌成肌细胞，用实时定量反转录聚合酶链反应（RT—qPCR）法与Western blot鉴定p16^INK4a基因转录与蛋白表达，7d后，用衰老相关β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞衰老程度。同时，用JC-1染料染色和流式细胞仪分别检测线粒体膜电位水平。结果成功转染了p16^INK4a的成肌细胞出现明显衰老表型，其细胞线粒体膜电位为（-40．287±12．663）mV，较阳性对照（CV）及阴性对照（NC）组的（-9．267±1．332）mV和（-6．967±2．031）mV明显下降（P=0．000），而p16^INK4a蛋白和mRNA相对表达量分别为45．25±8．21和33．89±7．87，明显高于CV组的10．18±2．69和5．26±1．92及NC组的9．41±1．70和7．16±1．86（P=0．000）。结论INK4a信号通路的上调导致了人骨骼肌成肌细胞的衰老，INK4a通路是人骨骼肌成肌细胞衰老的直接诱因；另外，INK4a通路能对线粒体通路产生作用，使线粒体膜电位下降．激发线粒体通路．间接加速成肌细胞的衰老。