miR-122-5p靶向调控人骨髓间充质干细胞诱导成骨分化的分子机制研究

目的:研究miR-122-5p对人骨髓间充质干细胞hBMSCs细胞成骨分化诱导的作用分子机制。方法:运用茜素红S、碱性磷酸酶活性ALP染色试剂盒检测hBMSCs成骨分化的钙结节与成骨活性;使用双荧光素酶报告基因实验验证miR-122-5p与BRCC3之间的靶向关系;运用qRT-PCR分别检测Runx2、Osterix、wnt3a、β-catenin、GSK3-β、miR-122-5以及BRCC3基因的表达情况;Western印迹检测β-catenin蛋白的表达量。结果:过表达miR-122-5p对人骨髓间充质干细胞hBMSCs细胞成骨分化诱导21天后的钙结节与干细胞成骨活性均有明显促进作用,对成骨分化中wnt/β-catenin信号通路主要转录因子Runx2、Os‐terix及wnt3a、β-catenin、GSK3-β主要基因均激活作用,过表达BRCC3对干细胞成骨分化中wnt/β-catenin信号通路主要转录因子Runx2、Osterix及wnt3a、β-catenin、GSK3-β主要基因有抑制作用;并且通过双荧光素酶报告基因与回复性实验确定miR122-5p与BRCC3之间的靶向关系,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-122-5p靶向抑制BRCC3的表达诱导hBMSCs细胞通过wnt/β-catenin通路进行成骨分化诱导。

骨痹通消颗粒对激素型股骨头坏死人骨髓间充质干细胞成骨与成脂分化的影响

目的 探究骨痹通消颗粒对激素性股骨头坏死人骨髓间充质干细胞(h BMMSC)成骨与成脂分化的影响。方法 取激素性股骨头坏死患者骨髓,体外进行h BMMSC的培养,通过细胞形态学观察、成骨及成脂分化潜能来鉴定h BMMSC。以完培组(基础培养基+10%的胎牛血清)作为对照,采用CCK-8法测定1%、2%、5%、8%、10%体积分数的骨痹通消含药血清A组作用24 h后对细胞增殖的影响。细胞在96孔板的培养过程中,每孔加入地塞米松溶液0.52μl,以完培组(基础培养基+10%的胎牛血清)和损伤组(基础培养组+10%的胎牛血清+0.52μl地塞米松溶液)作为对照,采用CCK-8法测定2%、5%、8%体积分数的骨痹通消含药血清B组对激素环境中细胞活力的影响。以无激素诱导细胞作为对照组(基础培养基+10%的胎牛血清),将体外激素诱导的h BMMSC细胞分为模型组(基础培养基+10%的胎牛血清+10-5mol/L地塞米松溶液)、实验组(基础培养基+5%的骨痹通消含药血清+10-5mol/L地塞米松溶液)。茜素红染色试剂盒测定各组成骨分化后矿化结节的形成;油红O染色试剂盒测定各组成脂分化后脂滴的形成;RT-q PCR测定成脂相关标志基因PPARγ、C/EBP-α与Fabp4中m RNA的表达,Western blot检测成骨相关蛋白BMP-2、Runx2及β-catenin的蛋白表达含量。结果 原代细胞培养7 d后,可见梭形、纺锤形或多角形的贴壁细胞。第三代细胞生长均匀,平行排列,透光率好。成骨诱导21 d,细胞发生改变,局部细胞聚集,并有矿化结节产生,茜素红染色呈阳性;成脂诱导21 d,脂滴与油红O染液结合变为红色,油红O染色呈阳性。与完培组比较,10%体积分数的含药血清A组细胞活力下降(P<0.05)。与完培组比较,损伤组细胞活力下降(P<0.05);与损伤组比较,2%、5%、8%体积分数的含药血清B组细胞活力升高(P<0.05)。与对照组比较,模型组染色面积降低(P<0.05);与模型组比较,实验组中矿化结节与沉积升高,染色范围也更广(P<0.05)。与对照组比较,模型组细胞内脂质积累增多(P<0.05);与模型组比较,实验组较细胞内脂质积累降低(P<0.05)。与对照组比较,模型组PPARγ、C/EBP-α和Fabp4的表达量升高(P<0.01),与模型组比较,实验组PPARγ、C/EBP-α和Fabp4的表达量降低(P<0.05)。与对照组比较,模型组BMP-2、Runx2及β-catenin蛋白表达含量升高(P<0.01),与模型组比较,实验组BMP-2、Runx2及β-catenin蛋白表达含量降低(P<0.05)。结论 骨痹通消颗粒能够促进激素性股骨头坏死h BMMSC的增殖及其向成骨分化的能力,抑制成脂分化,为临床上防治激素性股骨头坏死提供了理论基础。

人骨髓间充质干细胞及其外泌体在肝移植术后肝缺血再灌注损伤中潜在治疗作用的研究进展

肝缺血再灌注损伤(HIRI)是传统肝移植术中不可避免的病理生理过程,其严重程度受到来自供体和受体的多方面因素影响,最严重者可导致术后早期移植肝无功能。人骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其外泌体已在临床试验中被证实具有促进组织修复与免疫调节的能力,这一治疗作用在HIRI的防治中具有较好的应用前景。该文旨在综述BMSCs及其外泌体在移植肝HIRI防治中潜在作用机制的研究进展及未来研究方向。

慢病毒沉默Piezo1蛋白与人骨髓间充质干细胞成骨分化及TAZ的表达

背景:Piezo1作为机械敏感蛋白与成骨分化密切相关,TAZ也被证明参与调节成骨分化,但Piezo1调控人骨髓间充质干细胞成骨分化时TAZ是否参与其中目前尚不明确,故研究其具体机制对防治股骨头坏死具有重要意义。目的:探讨Piezo1对人骨髓间充质干细胞成骨分化及TAZ表达的影响。方法:构建靶向Piezo1的siRNA,转染至293T细胞,通过RT-qPCR检测其沉默效率并筛选出Piezo1-Homo-2337进行包装,使用荧光染色检测其最佳感染复数值。Piezo1沉默重组慢病毒进一步被转染至人骨髓间充质干细胞中,通过RT-qPCR、Western blot检测其沉默效果;通过茜素红染色、碱性磷酸酶活性分析、免疫荧光染色、RT-qPCR及Western blot检测分析沉默Piezo1对人骨髓间充质干细胞成骨分化能力及TAZ表达的影响。结果与结论:①与正常组、阴性对照组比较,转染si-Piezo1后人骨髓间充质干细胞中Piezo1的mRNA及蛋白水平明显降低;②与阴性对照组比较,si-Piezo1组碱性磷酸酶活性明显降低,钙沉积明显减少;③与阴性对照组比较,si-Piezo1组成骨相关基因Runx2、OPN、DLX5、osteocalcin、β-catenin及TAZ的mRNA水平明显降低。si-Piezo1组TAZ、β-catenin的蛋白表达明显降低;相反,si-Piezo1组p-TAZ、p-β-catenin的蛋白表达明显增加;④与阴性对照组比较,免疫荧光染色结果提示si-Piezo1组人骨髓间充质干细胞中TAZ、β-catenin的表达较少;⑤结果表明Piezo1可促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化,沉默Piezo1后人骨髓间充质干细胞的成骨能力明显降低,同时TAZ的表达也同样降低。

PPARγ基因沉默的人骨髓基质细胞对骨髓抑制小鼠造血功能的影响

目的 观察过氧化物酶体增殖激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor-gamma, PPARγ)基因沉默的人骨髓基质细胞HS-5对骨髓抑制小鼠造血功能的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法 用X射线进行全身照射构建骨髓抑制小鼠模型,造模后2 h,将小鼠随机分为3组,分别为实验组(尾静脉注射PPARγ RNAi干扰的HS-5细胞)、对照组(尾静脉注射未行PPARγ RNAi干扰的HS-5细胞)、空白组(尾静脉注射等量的生理盐水),每组5只。各组于放疗前、放疗后24 h、放疗后1周、放疗后2周进行外周血常规检测。对HS-5细胞在体外进行成骨、成脂诱导,分为实验组(PPARγ RNAi干扰的HS-5细胞)、对照组(未干扰PPARγ的HS-5细胞)、空白组(未行成骨/成脂诱导分化的HS-5细胞),观察成骨/成脂染色情况。采用CCK-8实验检测PPARγ基因沉默的HS-5细胞对小鼠骨髓造血干细胞(hemopoietic stem cell, HSC)增殖的影响,分为实验组(PPARγ RNAi干扰的HS-5细胞经成骨诱导分化3 d后,与小鼠HSC共培养)、阳性对照组(50μmol/L PPARγ抑制剂处理的HS-5细胞经成骨诱导分化3 d后,与小鼠HSC共培养)、阴性对照组(未干扰PPARγ的HS-5细胞经成骨诱导分化3 d后,与小鼠HSC共培养)、空白组(小鼠HSC单独培养,不与HS-5细胞共培养)。结果 放疗后,各组小鼠血常规指标均呈先降低后升高趋势,放疗后1周,三组小鼠血小板、白细胞水平差异显著,且实验组>对照组>空白组(均P<0.05);放疗后2周,三组小鼠脂肪空泡面积百分比差异显著,且实验组<对照组<空白组(均P<0.05),经Pearson相关分析显示,血常规各指标与血清PPARγ表达水平呈负相关(均P<0.05),与脂肪空泡面积百分比呈负相关(均P<0.05)。在体外成骨/成脂诱导分化后,实验组与对照组相比,橙红色的细胞比例明显降低,红色钙结节比例明显增高;成骨分化诱导3 d后,实验组、阳性对照组、阴性对照组人骨髓基质细胞均与小鼠HSC细胞进行共培养,空白组则单纯培养HSC细胞,结果显示共培养24、48、72 h后,实验组、阳性对照组小鼠HSC细胞增殖水平均高于阴性对照组和空白组(均P<0.05)。结论 PPARγ基因沉默的HS-5植入骨髓抑制小鼠后有助于小鼠造血功能增强。PPARγ基因被干扰沉默后,可增强HS-5细胞的成骨分化能力,减弱HS-5细胞的成脂分化能力,而成骨分化诱导的HS-5细胞能进一步增强小鼠HSC的增殖能力。

不同个体来源和低氧条件对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的研究6株不同个体(男:M1、M2、M3;女:F1、F2、F3)来源人骨髓间充质干细胞(BM-MSC)在不同低氧条件下生物学特性的差异。方法流式及诱导分化实验鉴定间充质干细胞的标志物表达及三系分化能力。Transwell法检测迁移能力。CCK8法检测5%及1%氧气下细胞活力差异。结果6株BM-MSC阳性标志物表达均高于99%,阴性标志物总表达均低于2%,且均具有三系分化能力。不同个体来源BM-MSC成骨、成脂分化效率和细胞活力具有差异,性别分层统计显示成脂分化差异可能与性别相关;不同低氧条件下BM-MSC的细胞活力和细胞迁移能力具有差异,5%氧气条件显著优于1%氧气条件。同时考虑氧气和性别因素时,发现不同低氧条件下男性来源的BM-MSC活力相对女性均具有较高的趋势,而迁移能力则是女性来源的BM-MSC相对更强。结论提示应根据人骨髓间充质干细胞的应用目的所需特性对供者个体和扩增环境设立特定标准。

异位高表达OCT4的人骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞功能的影响

目的:探讨异位高表达OCT4的人骨髓间充质干细胞(MSC)在体外对T细胞增殖、活化及分泌功能的影响。方法:分离健康儿童外周血单个核细胞,使用Anti-CD3/CD28单克隆抗体体外激活T淋巴细胞,白介素(IL)2体外刺激培养的T细胞1周。建立异位高表达OCT4的MSC(MSC-OCT4)与活化T细胞的体外共培养体系,收集共培养1周后的上清液,流式细胞仪测定Th1/Th2细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α、γ干扰素)水平。收集共培养1周后的淋巴细胞,通过Countstar软件进行计数,用流式细胞仪测定T细胞及活化T细胞亚群的比例后,计算出绝对值,以均数±标准差表示。结果:与对照单独T细胞培养组相比,MSC及MSC-OCT4均能显著抑制CD3^(+)T细胞、CD3^(+)CD4^(+)T细胞和CD3^(+)CD8^(+)T细胞增殖。与MSC相比,MSC-OCT4能更好地抑制CD3^(+)CD8^(+)T细胞增殖(P=0.049),且主要抑制早期T细胞活化。与对照单独T细胞培养组相比,MSC及MSC-OCT4均能显著下调细胞因子IL-2和γ干扰素水平。与T细胞共培养1周后,MSC与MSC-OCT4组细胞因子IL-6水平显著增加。与对照MSC组相比,MSC-OCT4组在共培养1周后活细胞数更高(P=0.019),且能耐受更高浓度丝裂霉素C的抑制增殖作用。结论:MSC及MSC-OCT4在体外均能抑制IL-2刺激的T细胞增殖及活化,过表达OCT4后MSC能更强地抑制CD3^(+)CD8^(+)T细胞增殖,且具有更好的体外增殖能力,可能具有更好更持久地调节Th1/Th2造血因子平衡的作用。

LncRNA FGD5-AS1调节miR-93-5p/BMP2轴促进人骨髓间充质干细胞成骨分化

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)FGD5-AS1调节微小RNA miR-93-5p/骨形态发生蛋白-2(BMP2)轴对人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)成骨分化的影响。方法取对数增殖期的hBM-MSCs,分别检测成骨分化前、后lncRNA FGD5-AS1、miR-93-5p、BMP2 mRNA表达水平;将细胞分别转染或共转染pcDNA FGD5-AS1、miR-93-5p inhibitor、miR-93-5p mimics及相应阴性对照,分组为pcDNA NC组、pcDNA FGD5-AS1组、inhibitor NC组、miR-93-5p inhibitor组、pcDNA FGD5-AS1+mimics NC组、pcDNA FGD5-AS1+miR-93-5p mimics组,取未转染细胞作为空白组;CCK-8法检测细胞增殖;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测其活性;茜素红染色鉴定细胞矿化结节形成;Western blot检测BMP2及成骨相关标志物--骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、成骨相关转录因子(OSX)水平;双荧光素酶报告基因实验分别验证miR-93-5p与FGD5-AS1、BMP2的靶向关系。结果miR-93-5p分别与FGD5-AS1、BMP2存在靶向关系。与分化前相比,hBM-MSCs成骨分化后lncRNA FGD5-AS1、BMP2 mRNA表达显著增加,miR-93-5p表达显著下降(P<0.05);与pcDNA NC组相比,pcDNA FGD5-AS1组FGD5-AS1表达显著增加(P<0.05),表明转染成功。后续实验发现矿化结节产生、细胞增殖、ALP活性及BMP2、OCN、OPN、OSX表达均显著增加(P<0.05);与inhibitor NC组相比,miR-93-5p inhibitor组miR-93-5p表达降低,表明转染成功。后续实验发现矿化结节产生、细胞增殖、ALP活性及BMP2、OCN、OPN、OSX表达均显著增加(P<0.05);miR-93-5p过表达可抑制FGD5-AS1对细胞成骨分化的促进作用(P<0.05)。结论上调FGD5-AS1可以促进细胞成骨分化,可能与miR-93-5p/BMP2轴有关。

滋肾健骨方含药血清对人骨髓间充质干细胞成骨分化中TGF-β_(1)/Smads信号通路的影响

目的 探讨滋肾健骨方含药血清对老年骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响及其作用机制。方法 取SD大鼠制备低、中、高剂量滋肾健骨方含药血清和空白血清。将培养第3代的老年骨质疏松症患者hBMSCs分为6组,空白组常规培养;模型组进行成骨诱导;空白血清组进行成骨诱导+空白血清培养;低剂量滋肾健骨含药血清组进行成骨诱导+低剂量滋肾健骨方含药血清培养;中剂量滋肾健骨含药血清组进行成骨诱导+中剂量滋肾健骨方含药血清培养;高剂量滋肾健骨含药血清组进行成骨诱导+高剂量滋肾健骨方含药血清培养。CKK-8法检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶(ALP)染色观察细胞分化情况,Western blot法检测细胞中转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达情况。结果 与模型组和空白血清组比较,各剂量滋肾健骨含药血清组细胞增殖活性和ALP活性均明显增强(P均<0.05),且中、高剂量滋肾健骨含药血清组均明显强于低剂量滋肾健骨含药血清组(P均<0.05);与模型组和空白血清组比较,各剂量滋肾健骨含药血清组细胞中TGF-β_(1)、Smad2、Smad3、Smad4蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),且高剂量滋肾健骨含药血清组均明显高于低剂量滋肾健骨含药血清组(P均<0.05)。结论 滋肾健骨方含药血清可能通过调控TGF-β_(1)/Smads信号通路促进老年骨质疏松症患者hBMSCs的成骨增殖及分化。

LncRNA MCF2L-AS1靶向调控miR-138-5p对人骨髓间充质干细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)MCF2L-AS1靶向调控miR-138-5p对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖、凋亡和成骨分化的影响。方法收集青海省第五人民医院手术切除的正常骨组织和骨质疏松(OP)患者的骨组织各25例,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p表达水平;hBMSCs分为si-MCF2L-AS1组、si-NC组、miR-138-5p组、miR-NC组、pcDNA-MCF2L-AS1组、pcDNA-NC组、si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC组和si-MCF2L-AS1+anti-miR-138-5p组;将hBMSCs进行成骨诱导分化培养,用RT-qPCR检测成骨诱导0、1、3、7、14 d及各组细胞LncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p及成骨相关因子碱性磷酸酶(ALP)、Run相关基因(RUNX)2、骨钙素(OCN)的表达水平;CCK-8检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋;双荧光素酶报告实验检测LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p靶向关系。结果OP患者骨组织中LncRNA MCF2L-AS1表达明显低于正常骨组织,miR-138-5p表达明显高于正常骨组织(P<0.001);在成骨诱导分化中,LncRNA MCF2L-AS1表达水平明显升高,miR-138-5p表达水平明显降低,ALP、RUNX2、OCN表达水平明显升高(P<0.05)。低表达LncRNA MCF2L-AS1或高表达miR-138-5p,ALP、RUNX2、OCN表达水平、细胞增殖率降低,凋亡率明显升高(P<0.05)。LncRNA MCF2L-AS1靶向调控miR-138-5p,低表达miR-138-5p部分回复MCF2L-AS1低表达对hBMSCs增殖、凋亡和成骨分化的作用。结论LncRNA MCF2L-AS1可靶向负调控miR-138-5p抑制hBMSCs增殖和成骨分化,促进凋亡。

人骨髓间充质干细胞定向内皮分化前后miRNA的表达差异分析

目的探讨人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cell,hBMSC)定向内皮分化前后miRNA的表达差异分析,为进一步研究其调控hBMSC内皮分化的分子机制奠定理论基础。方法根据hBMSC定向血管内皮诱导分化培养方法培养细胞,应用电子显微镜观察细胞分化前后形态的变化,应用细胞免疫荧光法检测内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的蛋白质表达情况,应用高通量测序分析检测细胞分化前后miRNA表达谱的改变,应用qRT-PCR验证两组中表达差异明显的miRNA分子。结果与未分化组hBMSC比较,分化后的细胞形态发生类内皮细胞样改变;eNOS蛋白的表达明显增加;分化后hBMSC共筛选41个差异性表达的miRNA,其中表达上调的有27个,表达下调的有14个;分化组细胞miR-31-5p上调近21倍,miR-200a-3p下调近15倍。结论hBMSC定向内皮分化前后miRNA表达发生差异性改变,其改变可能影响干细胞的分化程度,可为进一步研究干细胞在血管内皮功能异常所致的血管性疾病异常机制提供研究方向和理论支持。

人骨髓间充质干细胞抗砷性的获得

目的低剂量NaAsO2诱导骨髓MSCs,获得抗御细胞以探讨抗砷机制。方法用1滋molNaAsO2对骨髓MSCs进行低剂量慢性诱导,利用MTT计算细胞生存率及半数致死量(LC50),反映细胞抗砷性是否产生。结果NaAsO2诱导18周后,人骨髓MSCs产生稳定抗砷性,砷诱导组细胞LC50为25.8滋mol,同步对照组细胞LC50为11.4滋mol,砷诱导组细胞LC50是同步对照组细胞LG50的2.2倍。结论低剂量NaAsO2长期诱导人骨髓MSCs,可使细胞获得抗砷性。

人骨髓间充质干细胞的培养及研究

目的 了解间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的培养条件、生物特性及分化能力。方法 抽取健康成人骨髓,利用密度梯度离心分离培养人MSC,并用流式细胞仪检测细胞表面标记,体外诱导MSC向成骨细胞分化。结果 成功地进行了人MSC的原代和传代培养;MSC CD34、CD45、HLA DR、CD62p等为阴性,CD29、CD44、CD166、CD90 等为阳性;MSC能够分化为成骨细胞。结论 人骨髓MSC在体外有较强的扩增能力,并能够向成骨细胞分化。

人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞及其鉴定

目的 探讨将成人骨髓间充质干细胞 (MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的方法 ,并对所诱导细胞的成骨特性进行鉴定。 方法 分离人骨髓 ,梯度离心并结合全骨髓法进行培养 ,培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠及抗坏血酸。贴壁细胞传代 ,取第 3代细胞鉴定其成骨特性 ;在倒置相差显微镜下观察细胞形态 ,钙 -钴法染色检测碱性磷酸酶 (AL P)表达 ,免疫组织化学检测 型胶原表达 ,原位杂交检测骨连接素 (ON)、骨桥素 (OP)表达 ,Von Kos-sa染色检测钙结节形成。 结果 第 3代人 MSCs呈典型的成骨细胞形态 ,可连续传代 10次 ;AL P染色阳性率达 85 % ; 型胶原、ON和 OP表达阳性 ;Von Kossa染色可见钙结节形成。 结论 成功地将人 MSCs诱导分化为成骨细胞 ,所诱导的细胞具有典型的成骨细胞特性。

骨碎补各种提取成分对人骨髓间充质干细胞的影响

目的初步探讨骨碎补水提液、醇提液以及骨碎补的有效成分柚皮甙对人骨髓间充质干细胞(hu-manbonemarrowmesenchymalstemcells,hMSCs)增殖、分化的影响。方法将骨碎补水提液、醇提液和骨碎补的有效成分柚皮甙与hMSCs共同体外培养,倒置显微镜观察描述细胞生长情况、CCK-8法检测每组药液对细胞的毒性和增殖作用、碱性磷酸酶(ALP)活性测定,图文报告分析系统检测VonKossa染色的钙结节,统计学处理所得数据。结果与空白对照组比较,1mg/L骨碎补水提液、50μg/L骨碎补醇提液与50μg/L柚皮甙能促进hMSCs增加(P<0.05),50μg/L骨碎补醇提液与50μg/L柚皮甙能促进其向成骨细胞分化(P<0.05)。结论骨碎补水提液、醇提液与柚皮甙对hMSCs有保护作用并能分别促进其增殖、分化。

人骨髓间充质干细胞表达多种造血细胞因子

为了研究培养的人骨髓间充质干细胞在造血中的生物作用 ,采用RT PCR方法在mRNA水平上分析体外培养的人骨髓间充质干细胞 (BM MSC)造血因子的表达 ,以及氢化考的松对BM MSC表达造血细胞因子的影响。结果显示 ,体外传代培养的正常人、白血病和淋巴瘤等血液病人BM MSC均能表达SCF ,Flt3 ligandTPO ,LIF ,IL 6和IL 11等重要的造血细胞因子 ,但不表达G CSF ,GM CSF和IL 3。不同代数的BM MSC细胞 ,造血细胞因子的表达相同。BM MSC经氢化考的松作用 7- 2 1天后 ,可诱导G CSFmRNA表达 ,但不诱导GM CSF的表达 ,细胞在形态学上也未发生明显改变。结论 :体外培养的正常人和本组血液病病人BM

人骨髓间质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究

目的 分离纯化人骨髓间质干细胞 (MSC) ,研究其基本生物学特性。方法 用比密 1 .0 73Ficoll淋巴细胞分离液分离成人骨髓MSC ,体外扩增 ,观察细胞生长特性 ,流式细胞仪检测骨髓MSC表面抗原表达及细胞周期 ,染色体技术分析骨髓MSC遗传特性。结果 成人骨髓MSC培养 3d后有散在呈针尖状的贴壁细胞 ,7～ 1 0d后形成集落或融合呈纤维状 ;体外扩增原代可获得 (4～ 6 )× 1 0 5个细胞 ,1 0代可获得 (1～ 5 )× 1 0 1 0 个细胞 ,5～ 6代以后的细胞增殖能力下降 ;流式细胞仪检测结果显示 :CD1 3、CD2 9、CD4 4、CD71表达阳性 ,CD3、CDl4、CD33、CD34、CD38、CD4 5、HLA DR不表达 ;染色体核型正常 ;细胞周期分析显示 ,G0 /G1 期 :79.4 8% ,G2 /M期 :6 .1 0 % ,S期 :1 4 .4 2 %。结论 人骨髓MSC体外具有较好的增殖更新能力 ,3～

体外模拟心肌微环境中人骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

目的:研究在体外模拟心肌微环境中人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向心肌细胞(CM)的分化。方法:体外分离培养扩增hMSCs,进行流式细胞仪分析鉴定其免疫学表型CD34、CD44和CD45,以未加一抗只加二抗的hMSCs作为平行对照组;同时原代培养SD乳鼠的CM以模拟体外心肌微环境。选用生长良好、纯度达到95%的第5代hMSCs,与乳鼠原代培养的CM共培养,并进行心肌特异性标志cTnI的免疫组化鉴定。结果:体外分离纯化培养扩增出的hMSCs,不表达CD34及CD45,高表达CD44,其CD44阳性率平均为(93.26±2.48)%,与平行对照组[(3.42±1.09)%]比较差异有显著性(P<0.01)。hMSCs与CM共培养后,其形态逐渐向CM形态过渡,并表达心肌特异性抗体cTnI。结论:hMSCs在体外模拟的心肌微环境中可分化为CM,干细胞的分化具有环境依赖性。

鹿茸多肽对人骨髓间充质干细胞BMP-2和Runx2表达的影响

目的:探讨鹿茸多肽(VAP)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)中骨形态发生蛋白2(BMP-2)和骨特异性转录因子2(Runx2)基因和蛋白表达的影响,阐明其对骨合成及hBMSCs向成骨细胞方向分化的作用机制。方法:体外培养的hBMSCs分为对照组和5、10、15、20g·L-1 VAP组,通过检测各组hBMSCs中碱性磷酸酶(ALP)活性,确定体外用药最佳药物浓度;CCK-8法检测对照组和10g·L-1 VAP组hBMSCs增殖情况;荧光定量PCR法与Western blotting法测定对照组和10g·L-1 VAP组hBMSCs中BMP-2和Runx2基因与蛋白的表达。结果:VAP各组细胞中ALP活性均高于对照组,其中以10g·L-1 VAP组细胞中ALP活性最高(P<0.01);CCK-8法,10g·L-1 VAP组hBMSCs增殖率明显高于对照组(P<0.05),VAP诱导培养第9天hBMSCs增殖率最高,且进入平台期,之后hBMSCs的增殖率开始下降;荧光定量PCR和Western blotting检测,10g·L-1 VAP组hBMSCs中BMP-2和Runx2基因及蛋白表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:VAP能够提高hBMSCs中ALP活性,促进hBMSCs增殖分化,上调hBMSCs中BMP-2及其下游Runx2基因和蛋白的表达,这可能是VAP对hBMSCs骨形成及骨代谢影响的分子调控机制之一。

尿酸对人骨髓间充质干细胞成骨分化中Cbfα1/Runx2表达的影响

目的观察不同浓度尿酸对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化过程中核心结合因子α1(Cbfα1/Runx2)表达变化的影响。方法以体外培养的健康成年hBMSCs为研究对象,分为5个组,分别为对照组(完全培养基组)和加入不同浓度尿酸(0 mmol/l、0.2 mmol/l、0.4 mmol/l、0.8mmol/l)的成骨诱导组,通过倒置显微镜观察细胞形态,碱性磷酸酶染色和茜素红染色鉴定细胞。在干预诱导第7天和第14天行RT-PCR检测Cbfα1/Runx2的表达。结果碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果均阳性,表示诱导后细胞为成骨细胞。RT-PCR结果表明,对照组各时间点均无Cbfα1/Runx2表达,尿酸培养组随尿酸浓度增加和时间的延长,Cbfα1/Runx2表达逐渐增强,呈现时间依赖性和浓度依赖性。结论尿酸可能通过促进Cbfα1/Runx2的表达,从而促进hBMSCs向成骨细胞分化。