颌骨来源骨髓间充质干细胞成骨分化的特点、优势与应用

背景:颌面部骨组织缺损修复是目前研究的热点与难点,而种子细胞的选择是关键。颌骨来源骨髓间充质干细胞是存在于颌骨内的成体间充质干细胞,在颌面部组织再生方面的应用更具优势。目的:综述颌骨来源骨髓间充质干细胞的生物学特性和成骨分化优势以及药物、体内环境、微小RNA对其成骨分化影响的相关研究进展。方法:利用计算机在PubMed和中国知网进行文献检索。中文检索词为“口腔,骨组织工程,干细胞”,英文检索词为“oral,bone tissue engineering,stem cells”。共检索下载文章405篇,根据纳入与排除标准对文章进行筛选,最终纳入70篇文献进行综述。结果与结论:颌骨来源骨髓间充质干细胞是口腔骨组织工程的优良种子细胞,与长骨骨髓间充质干细胞相比,颌骨来源骨髓间充质干细胞具有更强的增殖能力和成骨分化能力。药物、体内环境、微小RNA均可以调控颌骨来源骨髓间充质干细胞的成骨分化,但目前对颌骨来源骨髓间充质干细胞的研究尚处于初始阶段,因此需要更多论证力较强的研究来证实其在颌面部骨组织再生领域的应用更具优势。

骨粘连蛋白促骨髓来源间充质干细胞成骨分化在青少年特发性脊柱侧凸中的作用

目的探究骨骼肌分泌的骨粘连蛋白(Osteonectin)促骨髓来源间充质干细胞(BMSC)成骨分化在青少年特发性脊柱侧凸(AIS)中的作用。方法纳入30例AIS患者,根据X射线片测量的Cobb角,将其分为轻度AIS组和重度AIS组。比较2组患者腰椎和骨骼肌骨密度(BMD)。收集2组患者BMSC,通过流式细胞术检测CD73和CD90蛋白表达,qRT-PCR检测Runx2、Osterix和Osteocalcin mRNAs表达水平,ELISA检测碱性磷酸酶(ALP)活性。收集2组患者骨骼肌,检测Osteonectin mRNA和蛋白表达水平。ELISA检测2组患者血清中Osteonectin水平。体外培养BMSC,分为BMSC组(无特殊处理)和BMSC+Osteonectin组(添加Osteonectin),检测Runx2、Osterix和Osteocalcin mRNAs表达水平及ALP活性。结果与轻度AIS组比较,重度AIS组患者腰椎和骨骼肌BMD降低(P<0.05),BMSC中Runx2、Osterix和Osteocalcin mRNAs表达水平降低(P<0.05),ALP活性降低(P<0.05);骨骼肌中Osteonectin mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05);血清中Osteonectin水平降低(P<0.05)。与BMSC组比较,BMSC+Osteonectin组细胞Runx2、Osterix和Osteocalcin mRNAs表达水平升高(P<0.05),ALP活性升高(P<0.05)。结论AIS患者骨骼肌分泌Osteonectin减少,BMSC的成骨分化能力降低。外源性补充Osteonectin可改善BMSC的成骨分化能力,可能有助于AIS病情的恢复。

Osteonectin促进骨髓来源间充质干细胞成骨分化的机制及其与青少年特发性脊柱侧凸的相关性研究

目的 探究Osteonectin在促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的分子机制,以及Osteonectin在青少年特发性脊柱侧凸(AIS)中的作用。方法 将2020年5月—2022年5月就诊的20例AIS及健康体检20例分别作为AIS组和健康组。使用qRT-PCR技术测定2组BMSCs中Osteonectin、BMP2以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因(Tcf7、Lef1)和成骨分化相关基因(Runx2、Osteocalcin)的表达水平。通过X线检测AIS患者的Cobb角度,并分析上述基因表达水平与Cobb角度的相关性。在BMSCs中,加入Osteonectin和BMP2抑制剂Noggin,并分为对照组、Osteonectin组和Osteonectin+Noggin组。通过qRT-PCR检测BMSCs中BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平。采用ChIP-qPCR检测β-catenin在Runx2和Osteocalcin基因转录起始位(TSS)的富集水平。结果 与健康组比较,AIS组BMSCs中Osteonectin、BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平均降低(P<0.05);Osteonectin、BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平与AIS患者Cobb角度呈负相关(r=-0.466 3、-0.369 1、-0.272 7、-0.543 4、-0.606 5、-0.343 3,P<0.05,P<0.01)。与对照组比较,Osteonectin组BMSCs中BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平升高,且β-catenin在Runx2和Osteocalcin mRNA TSS富集水平增加(P<0.05)。相比Osteonectin组,Osteonectin+Noggin组BMSCs中Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平降低,β-catenin在Runx2和Osteocalcin mRNA TSS富集水平降低(P<0.05)。结论 在AIS患者中,BMSCs中Osteonectin、BMP2-Wnt/β-catenin的表达以及成骨分化水平与AIS疾病的发展呈负相关。Osteonectin通过激活BMP2-Wnt/β-catenin信号通路,促使β-catenin转录激活成骨分化相关基因,从而促进BMSCs的成骨分化。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤的修复作用研究

目的:分析骨髓间充质干细胞来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤的修复作用。方法:选择2013年10月—2014年3月河南省洛阳正骨医院实验室试验的78例大鼠为研究对象,应用随机抛球法将大鼠分为手术组(n=26)、对照组(n=26)、外泌体组(n=26)。通过脊髓法建立大鼠脊髓损伤模型后,对照组不作处理,手术组在对照组的基础上实施切开减压术,而外泌体组在对照组的基础上实施全骨髓培养法培养大鼠BMSCs,收集P2代细胞上清,应用ExoQuickPrecipitation提取法分离并纯化外泌体,通过透射电镜观察鉴定外泌体形态,采用Westernblot鉴定外泌体表面标志蛋白CD9、CD63,在造模1 h后尾静脉给予外泌体移植500μL。分别采用BBB评分、斜板实验在术后1、3、7、14、21、28 d评价大鼠的运动功能恢复情况,并于术后28 d处死试验大鼠,采用苏木精-伊红(HE)染色、髓鞘(LFB)染色观察各组脊髓组织形态学改变,尼氏(Nissl)染色观察神经元存活数目。结果:术后各时间点手术组大鼠BBB评分高于对照组和外泌体组,术后7、14、21、28 d外泌体组大鼠BBB评分高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。手术组术后各时间点斜板评分高于对照组及外泌体组,差异有统计学意义(P<0.05)。造模后28 d,手术组的脊髓组织HE染色体等均正常,神经元数目减少。结论:BMSCs外泌体静脉移植对脊髓损伤有明显的改善作用,可以提高患者的运动能力,减轻脊髓损伤,加速脊髓损伤的恢复。

光固化水凝胶负载骨髓间充质干细胞修复大鼠颅骨缺损

目的探讨新型甲基丙烯酸酐化明胶(gelatin methacryloyl,GelMA)/骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)复合水凝胶应用于大鼠颅骨缺损区的成骨性能,为骨再生生物材料的应用提供实验依据。方法本研究经南京大学动物伦理委员会批准。通过组合光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂[lthium phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate,LAP]、GelMA、BMSCs构建光固化复合生物水凝胶GelMA/BMSCs,扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)和能量色散X射线光谱仪(energy disper-sive X-ray spectroscopy,EDX)检测GelMA凝胶表面微观形态及元素构成,电子万能试验机测试凝胶压缩强度。将GelMA/BMSCs水凝胶在体外培养1、2、5 d后,通过CCK-8检测水凝胶包封的BMSCs细胞增殖活性,利用共聚焦显微成像技术观察其存活情况和细胞形态;在大鼠颅骨制备5 mm临界骨缺模型,经复合水凝胶治疗的为GelMA/BMSCs组,不做任何处理的为对照组。分别于术后第4、8周拍摄Micro-CT测算骨缺损面积和新生骨指标,第8周处死大鼠取缺损区颅骨样本进行H&E染色、Van Gieson染色和Goldner染色评价新生骨的质量。结果SEM观察到固化的GelMA内部呈现3D海绵状大孔凝胶网络,大孔形貌均匀,孔隙率为73.41%,孔径为(28.75±7.13)μm;EDX结果显示C和O均匀分布在水凝胶的网状大孔结构上;水凝胶压缩强度为152 kPa,GelMA/BMSCs培养第5天,镜下细胞形态铺展,从卵圆形变为梭形,CCK-8检测结果显示细胞增殖159.4%。术后第4周,Micro-CT三维重建图像显示对照组的骨缺损范围未见明显缩小,GelMA/BMSCs组骨缺损内部可见大量新骨生成;术后第8周,对照组骨缺损仍无明显变化,仅可见少量新生骨,GelMA/BMSCs组颅骨缺损基本愈合;第4周与第8周的定量分析发现,GelMA/BMSCs组大鼠颅骨缺损处新生骨量(new bone vol-ume,BV)、骨体积分数(new bone volume/total bone volume,BV/TV)、骨表面积(bone surface,BS)、骨表面积组织体积比(bone surface/total bone volume,BS/TV)均优于对照组(P<0.05)。第8周组织学染色结果显示GelMA/BMSCs组骨缺损处形成连续且致密的骨组织,而对照组仅在缺损边缘可见少量不连续新骨生成,缺损处主要为纤维结缔组织。结论光固化水凝胶的干细胞疗法具有良好生物安全性,在诱导大鼠颅骨缺损区新骨形成的同时促进骨成熟,具有潜在的临床转化前景。

骨髓间充质干细胞来源外泌体对大鼠脊髓损伤的改善作用及对脊髓组织胞浆型磷脂酶A2、水通道蛋白4和水通道蛋白9的影响实验研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源外泌体对大鼠脊髓损伤(SCI)的改善作用及对脊髓组织胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)、水通道蛋白4(AQP4)和AQP9的影响。方法:培养BMSCs,提取外泌体并进行鉴定。选择成年雄性SD大鼠30只,分为假手术组、模型组和外泌体组,各10只。采用Allen法制作大鼠脊髓损伤模型,外泌体组经尾静脉注射外泌体,假手术组和模型组大鼠尾静脉注射等体积PBS缓冲液。各组大鼠每隔2 d注射1次,共注射3次。采用脊髓损伤行为学(BBB)评分评估干预前后各组大鼠四肢运动功能。采用HE染色观察脊髓组织结构。采用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)检测神经细胞凋亡情况。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测脊髓组织PLA2、AQP4、AQP9 mRNA及蛋白表达。结果:BMSCs生长状态良好,外泌体表面标志蛋白CD63、Alix呈阳性表达。干预后3、7 d,外泌体组BBB评分高于模型组(均P<0.05)。假手术组脊髓组织无损伤坏死及出血,结构完整,灰质白质边界清晰,细胞排列有序,细胞核形态正常;模型组大鼠脊髓结构紊乱,大量炎性细胞浸润,伴有囊性腔和空泡,神经元和细胞水肿,神经元数量明显减少;外泌体组脊髓损伤区组织结构紊乱、炎性细胞浸润减轻,脊髓空洞小,损伤恢复较好。假手术组脊髓组织中凋亡细胞较少。模型组细胞凋亡率高于假手术组,而外泌体组细胞凋亡率低于模型组(均P<0.05)。模型组脊髓组织cPLA2、AQP4、AQP9 mRNA及蛋白表达高于假手术组,而外泌体组脊髓组织cPLA2、AQP4、AQP9 mRNA及蛋白表达低于模型组(均P<0.05)。结论:BMSCs来源外泌体对脊髓损伤有一定改善作用,可下调cPLA2、AQP4、AQP9 mRNA及蛋白的表达。

不同静电纺丝膜上骨髓间充质干细胞的黏附、增殖与成血管平滑肌分化

背景:临床上迫切需要小口径人工血管来治疗冠状动脉和外周动脉疾病,目前,血管组织工程已成为制备小口径人工血管的主要方法,选择合适的生物材料和细胞来源是小口径组织工程血管构建成功的关键因素。目的:观察4种静电纺丝膜材料对骨髓间充质干细胞增殖、黏附及分化为血管平滑肌细胞的影响。方法:分离提取SD大鼠骨髓间充质干细胞。将骨髓间充质干细胞分别接种于聚己内酯(PCL)、聚己内酯-透明质酸(PCL-HA)、聚己内酯-丝素蛋白(PCL-SF)、聚己内酯-明胶(PCL-GEL)静电纺丝膜材料上,培养1,3,7 d后,扫描电镜下观察材料上的细胞排布,鬼笔环肽染色观察材料上的细胞增殖与黏附,qRT-PCR检测材料上细胞分泌的CD90、Meflin、转化生长因子βmRNA表达;向血管平滑肌细胞诱导分化7 d后,qRT-PCR检测材料上细胞ɑ-平滑肌肌动蛋白mRNA表达。结果与结论:①扫描电镜下可见骨髓间充质干细胞在4种静电纺丝膜上均沿着静电纺丝膜的纤维走向排列;②鬼笔环肽染色显示,骨髓间充质干细胞在4种静电纺丝膜上分布规律,均沿着纤维走向呈现平行分布,并且PCL-HA、PCL-SF、PCL-GEL静电纺丝膜较PCL静电纺丝膜更有利于骨髓间充质干细胞的增殖、黏附,PCL-SF静电纺丝膜相较于PCL-HA、PCL-GEL静电纺丝膜更有利于骨髓间充质干细胞的增殖、黏附;③qRT-PCR检测显示,4种静电纺丝膜材料均可维持骨髓间充质干细胞CD90和Meflin的mRNA表达,组间比较差异无显著性意义(P>0.05);PCL-HA、PCL-SF、PCL-GEL组培养1,7 d的转化生长因子βmRNA表达高于PCL组(P<0.05),PCL-SF组培养3,7 d的转化生长因子βmRNA表达高于其他3组(P<0.05),PCL-HA组培养7 d的转化生长因子βmRNA表达高于PCL-GEL组(P<0.05);④qRT-PCR检测显示,PCL-SF组ɑ-平滑肌肌动蛋白mRNA表达高于其他3组(P<0.05),PCL-HA组ɑ-平滑肌肌动蛋白mRNA表达高于PCL组(P<0.05);⑤结果表明:相较于PCL、PCL-HA、PCL-GEL静电纺丝膜,PCL-SF静电纺丝膜与骨髓间充质干细胞结合更适合制备小口径组织工程血管。

TGF-β信号通路对牙源性黏液瘤来源的间充质干细胞成骨分化的影响分析

目的探究转化生长因子-β(TGF-β)信号通路对牙源性黏液瘤(OM)来源的间充质干细胞(OMMSC)成骨分化的影响。方法选择2018年至2020年南京大学医学院附属口腔医院收治的OM患者2例,经手术取部分病灶标本进行OMMSC分离培养。另外选择于该院接受牙种植治疗的年轻患者5例,抽取颌骨骨髓进行颌骨骨髓来源的间充质干细胞(JBMSC)分离培养。通过细胞增殖实验、流式细胞术检测、茜素红S染色进行细胞鉴定。成骨培养7 d后通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β信号通路以及成骨相关基因的表达情况。观察小分子药物SB431542及TGF-β1干预对OMMSC、JBMSC成骨分化能力的影响。结果经分离获得的OMMSC、JBMSC具有梭形形态,表达间充质干细胞表面标志物,并具有成骨分化能力,符合间充质干细胞的特征。与JBMSC相比,OMMSC具有更强的增殖能力。RT-PCR检测结果显示,TGF-β/Smad信号相关因子在OMMSC中呈高表达(P<0.05),成骨相关因子骨桥蛋白(OPN)表达降低(P<0.05)。茜素红S染色结果显示SB431542可显著促进OMMSC成骨分化,而TGF-β1对OMMSC成骨分化有抑制作用。结论该研究成功对OMMSC进行了分离,发现TGF-β信号相关因子在OMMSC中呈高表达,抑制TGF-β信号转导通路可增强OMMSC的成骨能力,为改善OM患者骨缺陷提供参考。

连接蛋白43介导骨髓间充质干细胞的力响应

目的骨骼是一种动态组织,不断响应力环境变化。失重作为一种极端的力学环境,会破坏骨稳态、引起在轨航天员严重的骨丢失。骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为骨形成重要的前体细胞,其力响应机制一直是亟待解决的关键科学问题。连接蛋白(Cx)43是骨组织中含量最丰富的力负荷敏感蛋白,然而其在BMSCs力学响应中的作用仍不清楚。方法利用BMSCs特异性Cx43敲除小鼠(c KO)构建后肢力学去负荷模型;通过Micro CT、HE染色等观察骨形态结构;取后肢中非造血系细胞进行单细胞RNA测序,利用高通量技术在单个细胞水平上对BMSCs基因组、转录组及表观基因组水平进行测序分析。结果力学去负荷导致对照小鼠BMSCs中Cx43表达量显著升高;力学去负荷条件下小鼠骨质流失、髓内脂肪增加,且c KO小鼠骨质流失相比对照组小鼠更加严重;此外,本研究前期研究表明,抑制Cx43后BMSCs成骨分化及成脂分化能力显著降低。结论Cx43参与了BMSCs对力学去负荷的响应,本研究为失重性骨质流失的机制探索提供了一定理论基础。

骨髓间充质干细胞成骨分化在口腔医学中的应用

来源于中胚层的骨髓间充质干细胞(BMSCs),能够进行自我更新,从而实现多种不同的发育方式。由于其易于体外扩增和外源基因导入等优点,在骨缺损修复中具有广阔的应用前景。近年来,随着组织工程学理论和技术的不断进步,将BMSCs应用于颌骨缺损修复中取得了卓越的成果,改善了颌骨缺损的治愈效果。基于此,本文对骨髓间充质干细胞在口腔医学领域的应用和疗效作一综述,以期为临床医生提供更加科学的理论依据。Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) deriving from the mesoderm can self-renew and achieve a variety of different development modes. Because of its advantages of easy in vitro expansion and foreign gene introduction, it has a broad application prospect in bone defect repair. In recent years, with the continuous progress of tissue engineering theory and technology, the application of BMSCs in jaw defect repair has achieved excellent results and improved the healing effect of jaw defect. Based on this, this paper reviews the application and efficacy of bone marrow mesenchymal stem cells in stomatology, in order to provide more scientific theoretical basis for clinicians.

年轻和老年小鼠脂肪来源干细胞生物学特性对比

背景:脂肪来源干细胞具有抗衰老的作用,但来自不同年龄供者的脂肪来源干细胞是否有区别,还需深入研究。目的:对比老年和年轻小鼠脂肪来源干细胞的生物学特性。方法:分别从8周龄、14周龄C57BL小鼠脂肪组织中提取脂肪来源干细胞,对比分析老年和年轻小鼠脂肪来源干细胞的细胞周期、凋亡、增殖能力的差异,定量PCR和Western blot检测老年和年轻小鼠脂肪来源干细胞衰老相关P21、P27基因和蛋白的表达。结果与结论:与老年小鼠脂肪来源干细胞相比,年轻小鼠脂肪来源干细胞更有活力,形态更规则,凋亡更少,增殖更快,衰老相关P21、P27基因和蛋白表达量更低,说明年轻小鼠脂肪来源干细胞具有更好的抗衰老作用。

骨髓间充质干细胞来源的内皮细胞构建组织工程瓣膜及其抗血栓作用

目的:分析骨髓间充质干细胞来源的内皮细胞构建组织工程瓣膜的可行性,评价其抗血栓功能。方法:实验于2005-08/2006-04在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成。①人骨髓来源为中山医院胸外科手术摘除的一段肋骨(患者知情同意);取健康志愿者静脉血进行血小板黏附观察;新鲜猪心瓣膜取自上海复新屠宰场。②利用胰酶-乙二胺四乙酸、核酸酶处理猪心瓣膜制备脱细胞支架。将摘除的一段肋骨无菌条件下用含肝素的磷酸盐缓冲液充分冲洗骨髓腔,进行骨髓间充质干细胞的分离培养及体外诱导分化。③经体外诱导成的内皮细胞后,种植于瓣膜支架,构建组织工程瓣膜。体外培养1周后,取组织工程瓣膜及未种细胞的空支架做血小板黏附试验。以CD31、vWF对细胞进行鉴定,采用苏木精-伊红染色、免疫荧光及扫描电镜对组织工程瓣膜进行评价。结果:①骨髓间充质干细胞定向诱导为内皮细胞及其性质鉴定:骨髓间充质干细胞定向诱导为内皮细胞后,CD31及vWF染色由阴性转为阳性,呈现出“铺路石”样形态。②瓣膜组织形态观察结果:猪心瓣膜的细胞成分完全去除,胞外基质保存良好,组织工程瓣膜表面形成一连续的内皮细胞单层。③血小板黏附情况:扫描电镜显示空支架表面有大量血小板聚集和黏附,而组织工程瓣膜表面无此现象,显示了良好的抗血栓性能。结论:骨髓间充质干细胞来源的内皮细胞可以用来构建具有良好的抗血栓性能组织工程瓣膜。

骨髓基质干细胞-组织工程瓣膜的新细胞来源

目的:比较人骨髓基质干细胞与人瓣膜间质细胞抗原表达和分泌基质的特点,探讨人骨髓基质干细胞用于构建组织工程瓣膜的可行性。方法:体外培养、扩增人骨髓基质干细胞和人瓣膜间质细胞,比较形态学和生长特性,免疫荧光和流式细胞仪检测比较两者的抗原表达,免疫组织化学检测两者的细胞外基质分泌。扫描电镜观察MSC在瓣膜支架上的附着。结果:骨髓基质干细胞具有肌成纤维细胞的形态,细胞型分析显示α平滑肌肌动蛋白和波形蛋白阳性,平均荧光强度比分别为4.9和3.8,表达量与瓣膜间质细胞(2.4和3.1)接近。MSC分泌Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白,组织学和扫描电镜可见骨髓基质干细胞在瓣膜表面生长旺盛,具有正常的分泌功能和形态。结论:骨髓基质干细胞易于从体内分离、扩增,具有和瓣膜间质细胞相似的形态、抗原表达和功能,可以在去细胞猪主动脉瓣膜附着和扩增,形成组织,显示MSC是一种有前途的细胞,可以作为瓣膜组织工程的种子细胞来源。

大鼠骨髓间充质干细胞及大隐静脉来源细胞向组织工程化韧带种子细胞诱导的比较

背景:关节病中韧带损伤难以治愈,且传统的韧带替代物有很多不足。利用组织工程方法治疗关节病,需要选择适合的种子细胞。目的:观察诱导分化SD大鼠骨髓间充质干细胞及大隐静脉来源细胞作为韧带组织工程种子细胞的可行性。方法:胰酶-去垢剂法制备去细胞韧带组织;密度梯度离心和贴壁细胞培养相结合的方法体外分离扩增大鼠骨髓间充质干细胞,成纤维细胞生长因子诱导其分化为成纤维细胞,设大隐静脉间质细胞为对照,比较2种细胞形态学、增殖能力、胶原合成以及在韧带上的生长情况方面的异同。结果与结论:大鼠骨髓间充质干细胞及大隐静脉来源细胞均为贴壁生长,形态为梭形或多角型,两者的冻存和复苏率、合成胶原能力方面无显著差异,都能种植在韧带组织上并在其上面生长。骨髓间充质干细胞诱导分化的成纤维细胞与静脉来源的间质细胞之间无显著差异。

镁基合金支架负载兔源性骨髓间充质干细胞构建组织工程化骨复合支架

背景:随着组织工程学的深入研究与快速发展,组织工程支架为骨组织修复提供了新的契机。目的:探讨骨髓间充质干细胞与镁基合金支架共培养后的细胞增殖情况,为组织工程化骨支架构建提供新思路,进而为组织工程支架临床应用提供依据。方法:无菌条件下抽取兔骨髓液,使用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,进行流式细胞学鉴定和成骨分化能力检测。将第3代骨髓间充质干细胞分别接种于镁基合金支架和壳聚糖-聚己内酯-磷酸三钙支架,第3,10天进行激光共聚焦扫描观察细胞生长情况,第1,4,7,10,14天行MTT检测细胞增殖情况。结果与结论:(1)分离培养的细胞高表达CD44和CD90,几乎不表达CD34;(2)经成骨诱导后,细胞形态逐渐变为多角形,Von Kossa染色可见细胞之间钙结节染成黑色,碱性磷酸酶活性较未诱导对照组升高(P<0.05);(3)镁基合金与骨髓间充质干细胞共培养后,共聚焦显微镜扫描显示细胞可在支架上黏附并呈团块状生长,随着时间延长,镁基合金支架较壳聚糖-聚己内酯-磷酸三钙支架上负载的细胞增殖活跃,细胞数量明显增多,MTT检测显示两种材料与骨髓间充质干细胞共培养至10 d时,细胞生长达峰值;(4)结果表明,兔源性骨髓间充质干细胞具有良好的成骨潜能,与镁基合金支架共培养后,细胞在支架表面生长良好,成功构建了组织工程化镁基种植体。

颌骨与不同部位来源骨髓间充质干细胞应用潜能的比较

骨髓间充质干细胞(BMSCs)的骨组织工程技术是目前治疗骨缺损的前沿方法。目前BMSCs的研究多聚焦于躯干骨(如髂骨)和附肢骨(如长骨)来源的BMSCs,而大量研究显示颅颌面骨(如颌骨)来源的BMSCs相较于其他部位来源的BMSCs在表型和功能上存在差异。本文对颌骨与其他部位来源BMSCs的比较研究作一综述,从而推测颌骨来源的BMSCs具有更强的应用潜能,更适合作为骨组织工程(尤其是颅颌面骨缺损修复)的种子细胞。

骨髓间质干细胞向大鼠损伤心肌组织的迁移(英文)

实验旨在动态观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向不同微环境下心肌组织的迁移特点,明确组织 损伤在干细胞迁移中的作用,为提高干细胞治疗的靶向性和高效性奠定初步试验基础。分离纯化雄性Sprague-Dawley(SD)大 鼠的骨髓MSCs,输注入雌性SD大鼠。实验分为4组:正常大鼠+MSCs移植组,假手术+MSCs移植组,心肌缺血+MSCs 移植组,心肌缺血对照组(心肌缺血+培养基移植)。结扎冠状动脉前降支制造心肌缺血模型,将相等数量的雄性MSCs经尾 静脉注射移植入前3组雌性大鼠体内,对照组注射等体积培养基,分别于移植后1周及8周取心脏组织标本,采用荧光原位 杂交方法(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测大鼠Y染色体雄性鉴别基因sry片段的表达,用透射电镜观察大鼠心肌组 织超微结构改变。结果发现,移植后1周和8周,正常大鼠移植组和对照组大鼠的心肌组织中均未见sry基因的表达,但假 手术移植组和心肌缺血移植组的心肌组织中均可见sry基因的表达,心肌缺血移植组的Y染色体sry基因阳性细胞数量在两个 时间点均显著高于假手术移植组(P<0．01)。分别比较心肌缺血移植组和假手术组在移植后1周和8周的Y染色体sry基因阳性细 胞的数量,两个时间点无明显差异。心肌组织的超微结构观察发现心肌缺血移植组大鼠的心肌梗死周边区域可见一些细胞, 其形态类似于体外培养的MSCs。研究结果提示MSCs具有向损伤心肌组织迁移的特性,迁移的高峰期可能在组织损伤1周左 右,组织损伤及其程度在干细胞迁移中起重要作用。

BrdU标记家兔脂肪组织来源干细胞的体外研究

目的通过采用BrdU标记连续培养的家兔脂肪组织来源干细胞(adipose-derived stromal stem cells,ADSCs),检测其最佳标记时间、标记剂量及毒性作用,探讨其作为干细胞标记示踪方法的可行性。方法8～12周龄健康新西兰大白兔6只,雌雄不限,体重1.5～2.0kg。切取腹股沟皮下1～2mL脂肪组织,采用贴壁法体外分离培养ADSCs,并进行鉴定。取第3代细胞以终浓度分别为5、10、15和20μg/mL的BrdU进行标记,分别记为A、B、C及D组;另1孔不含BrdU,作为空白对照(E组)。标记12、24、48和72h后,采用免疫组织化学检测各组细胞阳性率,苔盼蓝排染法行细胞计数观察标记后细胞活性。结果原代培养的ADSCs形态主要为宽大、扁平、短梭形细胞;传代后细胞形态主要为长梭形;第3代ADSCs经诱导均能向成骨细胞和脂肪细胞分化。免疫组织化学观察:第3代ADSCs经BrdU标记后,在荧光显微镜下胞核呈绿色荧光。孵育12h,A、B、C、D组细胞标记阳性率逐渐增高,分别为30.6%±2.3%、32.4%±1.9%、45.8%±1.8%、50.8%±3.1%,C、D组与A组比较,差异有统计学意义(P<0.01);24h,A、B、C及D组标记率分别为45.9%±2.0%、87.9%±3.3%、90.6%±2.9%及91.7%±3.2%;48h和72h,A、B、C、D组标记情况与24h相似;E组各时间点细胞标记阳性率为0。孵育24、48及72h,B、C及D组细胞阳性率与A组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。孵育12、24、48及72h细胞计数,各组细胞活性均在90%以上,A、B、C、D组与E组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论BrdU标记ADSCs的最佳时间为48h,最佳浓度为10μg/mL;BrdU对细胞标记率及安全性高。

骨髓间充质干细胞在脑缺血模型大鼠脑组织中的迁徙、定居及组织修复作用

目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)移植后,在缺血性脑损伤大鼠脑组织中的迁徙、定居及组织修复作用。方法体外分离、纯化及培养MSCs。线栓法制备Wester大鼠脑缺血模型,经颈动脉移植DAPI标记的MSCs,通过激光共聚焦显微镜,分别在24h、5d及10d观察MSCs在脑组织内的迁徙及定居。采用三苯四氮唑活组织脑片染色方法,观察MSCs治疗对脑组织损伤的修复作用。结果MSCs经颈动脉移植后,在24h即出现在脑损伤区域血管内,第5天在血管周围组织内开始弥散,第10天在损伤区域可见广泛弥散。MSCs治疗20d后,脑片染色显示坏死区域减少。结论动脉移植MSCs后,MSCs首先出现在大鼠缺血性脑损伤区域血管内,然后在周围组织弥散,并可能参与损伤区血管及组织的修复。

人骨髓间质干细胞作为骨、软骨组织工程种子细胞的实验研究

目的 :探讨经体外扩增、诱导分化的人骨髓间质干细胞(humanbonemarrowmesenchymalstemcells,hMSC)作为组织工程化骨、软骨种子细胞的可行性。方法 :体外分离、培养、扩增hMSC ,以流式细胞仪检测hMSC的表面抗原。诱导hMSC向成骨细胞、软骨细胞分化。以倒置显微镜和电子显微镜观察细胞的形态 ;以组织化学、免疫组织化学和RT PCR ,检测成骨细胞、软骨细胞的特异性标志物。结果 :分离得到的细胞可表达hMSC的特异抗原 ,在体外扩增 15代以上 ,其形态及表面抗原保持不变。成骨诱导培养的细胞上清液中ALP的含量高于对照组 (P <0 .0 5 )。成骨及成软骨诱导的细胞形态均由成纤维样梭形向多边形转变。透射电镜观察可见大量扩张的粗面内质网、高尔基体及线粒体。扫描电镜观察可见经成骨诱导后的细胞表面有钙盐沉积 ,成软骨诱导的细胞表面有胶原样突起。成骨诱导培养后 ,可见碱性磷酸酶 (ALP)染色、Ca结节染色、胶原 Ⅰ (COL Ⅰ )及骨钙素 (osteocalcin ,OC)免疫组化染色阳性 ,同时RT PCR检测COL Ⅰ、OCmRNA表达阳性。成软骨诱导后 ,甲苯胺蓝染色见细胞周围有大量的异染性基质 ,免疫组化和RT PCR检测COL Ⅱ表达阳性。结论 :hMSC在体外可大量扩增。在特定培养液诱导下 ,可向成骨细胞及软骨细胞转化 ,可作为骨。