TGF-β1通过组蛋白修饰酶调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的表观基因学研究

目的研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化过程中转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)/Smad信号通路与组蛋白甲基化酶和去甲基化酶的相关性。方法BMSCs成骨诱导培养,用TGF-β1、SB431542和TGF-β1+SB431542干预。分为4组:BMSCsCtrl-3d组(A组),BMSCs-Ctrl-ost3d组(B组),BMSCs-TGF-β1-ost3d组(C组),BMSCs-TGF-β1-SB1UMost3d组(D组)。用qRT-PCR方法检测各组甲基化酶和去甲基化酶mRNA表达量。结果(1)与A组比较,B组DM3B、KDM4A、KDM4B、KDM4C、KDM4D、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM6A、KDM6B、EZH1的mRNA表达明显增强(P<0.05)。(2)与B组比较,C组KDM3B、KDM4A、KDM4C、KDM4D、KDM5C、EZH1的mRNA表达明显降低(P<0.05);KDM5B、KDM6A、KDM6B的mRNA表达明显增强(P<0.05);而KDM4B、KDM5A表达无明显改变(P>0.05)。(3)与C组比较,D组KDM3B、KDM6A、KDM6B的mRNA表达发生明显改变(P<0.05);KDM4C、KDM4D、KDM5C和EZH1的mRNA改变不显著(P>0.05),KDM4A的mRNA发生非特异性改变(P<0.05)。结论TGF-β1通过TGF-β1/Smad信号通路和TGF-β1/非Smad信号调控部分相关组蛋白甲基化转移酶/去甲化酶的表达,从而促进了BMSCs成骨分化。

慢病毒沉默Piezo1蛋白与人骨髓间充质干细胞成骨分化及TAZ的表达

背景:Piezo1作为机械敏感蛋白与成骨分化密切相关,TAZ也被证明参与调节成骨分化,但Piezo1调控人骨髓间充质干细胞成骨分化时TAZ是否参与其中目前尚不明确,故研究其具体机制对防治股骨头坏死具有重要意义。目的:探讨Piezo1对人骨髓间充质干细胞成骨分化及TAZ表达的影响。方法:构建靶向Piezo1的siRNA,转染至293T细胞,通过RT-qPCR检测其沉默效率并筛选出Piezo1-Homo-2337进行包装,使用荧光染色检测其最佳感染复数值。Piezo1沉默重组慢病毒进一步被转染至人骨髓间充质干细胞中,通过RT-qPCR、Western blot检测其沉默效果;通过茜素红染色、碱性磷酸酶活性分析、免疫荧光染色、RT-qPCR及Western blot检测分析沉默Piezo1对人骨髓间充质干细胞成骨分化能力及TAZ表达的影响。结果与结论:①与正常组、阴性对照组比较,转染si-Piezo1后人骨髓间充质干细胞中Piezo1的mRNA及蛋白水平明显降低;②与阴性对照组比较,si-Piezo1组碱性磷酸酶活性明显降低,钙沉积明显减少;③与阴性对照组比较,si-Piezo1组成骨相关基因Runx2、OPN、DLX5、osteocalcin、β-catenin及TAZ的mRNA水平明显降低。si-Piezo1组TAZ、β-catenin的蛋白表达明显降低;相反,si-Piezo1组p-TAZ、p-β-catenin的蛋白表达明显增加;④与阴性对照组比较,免疫荧光染色结果提示si-Piezo1组人骨髓间充质干细胞中TAZ、β-catenin的表达较少;⑤结果表明Piezo1可促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化,沉默Piezo1后人骨髓间充质干细胞的成骨能力明显降低,同时TAZ的表达也同样降低。

miR-338-3p通过靶向RUNX2负调控人骨髓间充质干细胞成骨分化且促进骨质疏松

目的:探讨miRNA-338-3p在骨质疏松症进展中的作用及其对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响。方法:选择60例骨质疏松症患者为研究对象,另选同期60名非骨质疏松者作为对照组。检测两组血清miR-338-3p表达水平。采用RT-qPCR检测miR-338-3p、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)和I型胶原蛋白(collagen I)水平。Western blot检测miR-338-3p对RUNX2蛋白表达的影响;采用碱性磷酸酶(ALP)测定法和茜素红染色评估miR-338-3p和RUNX2对成骨分化和矿化能力的影响;采用生物信息学和荧光素酶报告基因检测验证miR-338-3p和RUNX2之间的关系。结果:骨质疏松患者血清miR-338-3p水平相比对照组表达量明显上升(P<0.05),且其表达随着成骨诱导时间的延长而逐渐降低(P<0.05)。与对照组比较,miR-338-3p表达情况影响OCN、OPN和Collagen I mRNA的水平(P<0.05)。与对照组相比,miR-338-3p过表达削弱了hBMSCs矿化能力和ALP活性(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测证实,RUNX2是miR-338-3p的直接靶点,miR-338-3p过表达降低了RUNX2蛋白及其mRNA的表达水平(P<0.05)。RUNX2过表达可逆转miR-338-3p对hBMSCs成骨分化的抑制作用。结论:miR-338-3p通过靶向RUNX2负调控hBMSCs的成骨分化,从而促进骨质疏松的进展。

尿酸对人骨髓间充质干细胞成骨分化中Cbfα1/Runx2表达的影响

目的观察不同浓度尿酸对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化过程中核心结合因子α1(Cbfα1/Runx2)表达变化的影响。方法以体外培养的健康成年hBMSCs为研究对象,分为5个组,分别为对照组(完全培养基组)和加入不同浓度尿酸(0 mmol/l、0.2 mmol/l、0.4 mmol/l、0.8mmol/l)的成骨诱导组,通过倒置显微镜观察细胞形态,碱性磷酸酶染色和茜素红染色鉴定细胞。在干预诱导第7天和第14天行RT-PCR检测Cbfα1/Runx2的表达。结果碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果均阳性,表示诱导后细胞为成骨细胞。RT-PCR结果表明,对照组各时间点均无Cbfα1/Runx2表达,尿酸培养组随尿酸浓度增加和时间的延长,Cbfα1/Runx2表达逐渐增强,呈现时间依赖性和浓度依赖性。结论尿酸可能通过促进Cbfα1/Runx2的表达,从而促进hBMSCs向成骨细胞分化。

尿酸对人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中Wnt信号通路的影响

背景:尿酸作为一种内源性的抗氧化剂,其抗氧化、抗DNA损害作用及发挥促成骨作用近年受到关注。目的:探讨不同浓度尿酸对人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达的影响。方法:采用全骨髓贴壁法体外分离培养健康成年人骨髓间充质干细胞,培养至第3代时,用含不同浓度尿酸(0,140,280,560μmol/L)的成骨诱导液进行成骨向诱导分化培养,检测细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶活性、增殖能力以及Wnt信号通路中Wnt-3α,β-catenin m RNA的表达。结果与结论:各组细胞碱性磷酸酶染色为阳性,尿酸干预后各组细胞碱性磷酸酶活性和增殖能力增高,Wnt信号通路相关基因Wnt-3a、β-catenin的表达上调,且呈现浓度依赖性,各指标在实验组与对照组间比较以及实验组组间比较,差异均有显著性意义(P<0.05)。结果显示尿酸可通过促进Wnt-3a/β-catenin信号通路进而促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖和分化,具有浓度依赖性。

Spry1在miR-21调控人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

背景:前期研究发现,miR-21在骨髓间充质干细胞成骨分化中表达上升,但是miR-21在骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用及分子机制尚不明确。目的:验证miR-21的靶基因Spry1,探明Spry1在人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用。方法:荧光素酶报告验证miR-21靶基因Spry1,Western Blot检测Spry1在人骨髓间充质干细胞成骨过程的表达。构建Spry1慢病毒表达载体,感染人骨髓间充质干细胞。碱性磷酸酶、茜素红染色、RT-PCR和Western Blot分析Spry1高表达后人骨髓间充质干细胞成骨能力的改变。结果与结论:荧光素酶报告提示Spry1为miR-21的靶基因,在人骨髓间充质干细胞成骨过程中表达量下降。上调Spry1能够抑制人骨髓间充质干细胞的成骨分化。结果表明Spry1作为miR-21的靶基因负向调控人骨髓间充质干细胞的成骨分化,在骨形成过程发挥着重要作用。

miR-195对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

背景:既往研究发现,miR-195在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中,表达量显著增加,但是其作用及其机制尚不明确。目的:探索mi R-195对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制。方法:体外分离、培养人骨髓间充质干细胞,通过碱性磷酸酶活性测定试剂盒、蛋白免疫和实时定量反转录PCR(q RT-PCR)检测在人骨髓间充质干细胞诱导分化过程中,碱性磷酸酶活性和骨分化特异基因Runx2和osteopontin表达水平的变化,以及miR-195和它的潜在靶SMAD7表达量的变化;通过脂质体转染构建miR-195低表达的人骨髓间充质干细胞,研究miR-195对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。利用荧光素酶报告基因实验检测miR-195对SMAD7的靶向作用。结果与结论:(1)分离培养的人骨髓间充质干细胞具有优良的体外成骨分化能力;(2)miR-195表达量随人骨髓间充质干细胞诱导分化时间的增加而升高,SMAD7则相反。(3)mi R-195能够促进人骨髓间充质干细胞成骨分化;(4)荧光素酶实验证实SMAD7是miR-195的直接靶,SMAD7过表达抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化;(5)结果提示,miR-195通过靶向SMAD7促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。

水蛭素上调VEGF/Notch1信号通路促进人骨髓间充质干细胞成骨分化

目的观察水蛭素对人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)成骨分化的影响。方法BMSCs细胞分为正常培养的对照组、成骨诱导的诱导组以及加入不同浓度(1、10、20 ATU/mL)处理的水蛭素组。MTT检测细胞增殖并筛选水蛭素最适作用浓度。流式细胞仪检测细胞凋亡。RT-PCR和Western blot分别检测成骨基因Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达。BCIP/NBT染色法检测细胞中的碱性磷酸酶水平。茜素红染色检测矿化结节。检测VEGF、Notch1、Jagged1和CBF1的mRNA和蛋白表达。结果骨髓间充质干细胞经成骨诱导细胞增殖显著增加,中高浓度的水蛭素可以不同程度促进成骨诱导的BMSCs细胞增殖(P<0.05),并筛选出20 ATU/mL作为水蛭素的使用浓度。水蛭素抑制成骨诱导的BMSCs细胞凋亡,上调Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达,增加碱性磷酸酶水平,促进细胞中矿化结节的生成,并提升BMSCs细胞中VEGF、Notch1、Jagged1和CBF1的表达(P<0.05)。结论水蛭素可能通过上调VEGF/Notch1信号通路促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。

人骨髓间充质干细胞成骨分化相关的长链非编码RNA表达谱特征

目的观察人骨髓间充质干细胞(h MSCs)成骨分化过程中长链非编码RNA(lncRNA)的表达谱变化。方法以h MSCs及成骨诱导分化7、14、21 d后的细胞为研究对象,利用Agilent lncRNA芯片技术筛选出成骨诱导分化前后2倍变化幅度的差异lncRNA,并通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)对芯片结果进行验证。选取筛选结果中表达差异较大的lncRNA利用UCSC Genome Browser并结合芯片筛选结果分析lncRNA邻近蛋白编码基因。结果 h MSCs经成骨诱导分化7、14、21 d后,均具有成骨细胞特性;芯片筛选结果表明,与成骨诱导分化前的h MSCs相比,成骨诱导分化7、14、21 d后持续表达上调超过2倍的lncRNA有433条,下调超过2倍的有232条;选取其中部分lncRNA,RT-PCR验证与芯片结果相符合;对lncRNA邻近蛋白编码基因分析提示某些lncRNA(如lncRNA ENST00000585537.1和lncRNA e HIT00001595)可能在h MSCs成骨分化过程中发挥重要作用。结论 h MSCs成骨诱导分化前后,lncRNA表达谱发生显著变化,提示差异表达的lncRNA可能与h MSCs成骨分化密切相关,由此可进一步解释h MSCs成骨分化机制。

瘦素对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

背景:瘦素及其受体在中枢和外周多个部位均有表达,具有多种生物学功能,对于骨代谢有着重要的影响作用,但目前瘦素影响骨重建的机制尚未完全明了。目的:探讨瘦素对人骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/2008-09在山西医科大学生化与分子生物学实验室完成。材料:健康志愿者髂骨骨髓由山西医科大学第二医院提供。瘦素为Sigma公司产品。方法:采用全骨髓法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第3代以1×108L-1密度接种至预置盖玻片的6孔培养板中,设立3组:成骨诱导组添加原代培养液后,再加入含10-8mol/L地塞米松、10mmol/Lβ-磷酸甘油、50mg/L维生素C的成骨诱导培养基;成骨+瘦素诱导组添加成骨诱导培养基后,再加入50nmol/L瘦素;空白对照组仅加入含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM培养液。主要观察指标:骨髓间充质干细胞表面标志表达、钙化结节染色结果、碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原及骨钙素含量、骨保护素和RANKL蛋白的表达。结果:第3代骨髓间充质干细胞CD44和CD71阳性率分别为95.21%,72.31%,CD34阳性率仅为0.39%。成骨诱导21d后vonKossa染色可见呈棕黑色的细胞外基质钙盐沉积。诱导14d与空白对照组比较,成骨诱导组、成骨+瘦素诱导组骨髓间充质干细胞内碱性磷酸酶活性及Ⅰ型胶原、骨钙素含量均明显升高(P<0.05);且成骨+瘦素诱导组各指标升高幅度明显高于成骨诱导组(P<0.05)。与成骨诱导组比较,成骨+瘦素诱导组骨髓间充质干细胞骨保护素蛋白的表达明显上调(P<0.05),RANKL蛋白的表达明显下调(P<0.05)。结论:瘦素作用于人骨髓间充质干细胞后可促使其向成骨细胞分化,可能通过骨保护素/RANKL途径发挥对骨代谢的调节作用。

富血小板血浆对人骨髓间充质干细胞成骨分化的抑制效应

目的:一些理论质疑富血小板血浆对骨前体细胞成骨分化的作用,本实验拟验证富血小板血浆对体外培养的人骨髓间充质干细胞成骨分化的抑制效应。方法:实验于2005-05/11在南方医科大学组织工程试验室(省级)完成。①实验方法:抽取6名健康志愿者髂前上棘骨髓5mL进行体外细胞培养扩增,静脉血10mL以二次离心法制得富血小板血浆。诱导骨髓间充质干细胞时富血小板血浆与骨髓间充质干细胞均来自同一个体。②碱性磷酸酶染色:取第4代骨髓间充质干细胞,分为两组:富血小板血浆组加入富血小板血浆使终浓度为100g/L,单纯血清培养组仅加入等量胎牛血清。培养后第7天进行碱性磷酸酶染色,阳性细胞为胞质中呈现黑色颗粒或块状沉淀。③矿化结节染色:取第4代骨髓间充质干细胞,分组同上。培养后第19天以0.1%茜素红-TrisHcl(pH8.3)37℃下放置30min,矿盐沉积染色阳性为红色。④Cbfa1基因表达:取第4代骨髓间充质干细胞,分组同上。培养后第3,7,12,16天RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞Cbfa1基因的表达。⑤形态学观察:实验过程中使用相差显微镜观察各组细胞生长情况及形态学变化。结果:①骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶染色结果:培养后第7天,富血小板血浆组碱性磷酸酶阳性细胞数量较单纯血清培养组明显减少,且阳性细胞内灰黑色颗粒也明显减少,为弱阳性。②骨髓间充质干细胞矿化结节染色结果:培养后第19天,单纯血清培养组可见细胞表面有较多的矿盐沉积,但未形成明显的矿化结节。富血小板血浆组细胞表面只有稀少的矿盐沉积。③骨髓间充质干细胞cbfa1mRNA的表达:培养后第3,7,12,16天,随着培养时间的延长单纯血清培养组与富血小板血浆组cbfa1基因表达量均逐渐增高,同一时间点两组间cbfa1基因的表达基本相似。④骨髓间充质干细胞形态学变化:富血小板血浆组骨髓间充质干细胞增殖旺盛,细胞达到单层汇合的时间较单纯血清培养组明显缩短。单纯血清培养组细胞在完全汇合后开始出现聚合现象(14～16d),但趋向性不明显,未完全形成团簇;富血小板血浆组细胞在完全汇合后未出现聚合现象,细胞密集生长。培养初期两组细胞以梭形为主,多角形细胞较少,培养至14～16d单纯血清培养组多角形细胞较富血小板血浆组增多。结论:富血小板血浆可抑制人骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶的分泌与矿盐沉积,对人骨髓间充质干细胞成骨分化的直接效应是抑制其分化。

miR-21调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

目的:观察miR-21在人骨髓间充质干细胞(h BMMSCs)成骨分化过程中的表达。方法:通过转染使h BMMSCs过表达或抑制miR-21后,分别采用ALP染色、茜素红染色观察各组ALP活性和钙化结节的表达形成量;并采用Real time RT-PCR、Western blot检测各组成骨相关基因Runxz、osterixmRNA及其蛋白的表达水平,以观察miR-21对h BMMSCs体外成骨分化的调控作用。将表达不同水平miR-21的各组h BMMSCs与HA/TCP复合后植入裸鼠皮下,8周后取材,采用HE染色和Masson三色染色观测各组类骨质的形成量。结果:miR-21在h BMMSCs成骨过程中表达量较对照组明显升高(P<0.05)。过表达miR-21能促进h BMMSCs体外成骨分化及体内的异位成骨能力;而抑制miR-21则能降低h BMMSCs体外成骨分化及体内的异位成骨能力。结论:miR-21可外调控h BMMSCs成骨分化,在骨形成过程发挥作用。

EPHA2在人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

目的:研究EPHA2在人骨髓间充质干细胞(h BMSC)成骨分化过程中表达的动态变化及其在成骨分化中的作用。方法:h BMSC成骨分化诱导0、4、10和14 d后分别收集细胞提取RNA和蛋白,采用Real-time PCR和Western blot方法检测EPHA2 mRNA及蛋白表达;使用EPHA2的si-RNA下调EPHA2表达后进行成骨分化诱导,检测下调EPHA2表达对早期成骨分化指标ALP活性及晚期成骨分化指标钙沉积、成骨分化标志物OSX、OCN和成骨分化关键转录因子RUNX2表达的影响。结果:EPHA2在h BMSC成骨分化过程中表达逐渐上升,下调EPHA2表达能抑制ALP活性和钙沉积,抑制OSX、OCN及关键转录因子RUNX2的表达。结论:EPHA2在h BMSC成骨分化过程中表达逐渐上升,EPHA2可能通过增强RUNX2的表达从而促进h BMSC成骨分化。

Sclerostin对骨形态发生蛋白2诱导的人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨Sclerostin对骨形态发生蛋白2(BMP-2)诱导的人骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响。方法取两位男性车祸伤致截肢患者的骨髓组织进行体外人BMSCs培养。将培养细胞随机分为三组,1组未做转染(Mock),2组转染对照siRNA,3组转染Sclerostin(骨形态发生蛋白抑制剂)siRNA,均采用含有0.1μg/m L BMP-2的成骨诱导培养基培养。分别在诱导培养的第0、3、7天,采用CCK-8法检测各组细胞活性,采用Cy QUANT细胞增殖检测试剂盒检测DNA含量。在培养的第14天,采用RT-PCR方法检测骨相关基因骨钙素(OCN)、骨钙蛋白(OC)及骨桥蛋白(OPN),采用碱性磷酸酶(ALP)分析试剂盒进行ALP活性分析,采用BCA蛋白检测试剂盒检测细胞蛋白含量。结果在诱导培养的第3、7天,3组细胞增殖活性、DNA含量均高于1、2组(P均<0.05)。在诱导培养的第14天,3组OCN、OC、OPN mRNA相对表达量及蛋白含量均高于1、2组(P均<0.05);1、2、3组ALP活性分别为1.00%±0.08%、1.12%±0.09%、2.50%±0.03%,3组高于1、2组(P均<0.05)。结论抑制Sclerostin表达可以促进BMP-2诱导的人BMSCs的活性及成骨分化能力。

LncRNA-CWF19L1调控miR-132-3p抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用研究

目的探讨lncRNA-CWF19L1通过调控miR-132-3p抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机制。方法通过双荧光素酶试验验证lncRNA-CWF19L1与miR-132-3p以及miR-132-3p与Smad2的相互关系;通过茜素红(ARS)染色和碱性磷酸酶(ALP)染色计量钙结节数量变化;通过qRT-PCR和Western Blot检测成骨基因(ALP、BMP2和Runx2)的表达量变化。结果过表达lncRNA-CWF19L1抑制骨髓间充质干细胞成骨分化。利用生物信息学预测方法发现lncRNA-CWF19L1可直接靶控miR-132-3p,而Smad2作为miR-132-3p的下游靶基因。过表达lncRNA-CWF19L1致miR-132-3p表达上调;而上调miR-132-3p致Smad2表达下调,进而抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化。结论lncRNA-CWF19L1可通过调控miR-132-3p来抑制Smad2的表达,进而抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化。

-80℃一步法冻存对成人骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响

目的观察-80℃一步法冻存法对成人骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法体外分离、培养正常成人骨髓MSCs,于-80℃分别冻存6个月和9个月,通过检测碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原等指标比较两组冻存细胞与非冻存组MSCs成骨分化能力。结果三组细胞成骨指标相比较无显著性差异。结论在一定的冻存时间内,-80℃一步法冻存对成人骨髓间充质干细胞成骨分化能力没有明显影响。

调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的miR-106a及其靶基因骨形态发生受体蛋白2

背景:正常生理条件下,人骨髓间充质干细胞的骨生成和脂肪生成维持平衡,成骨分化是骨骼发展的重要过程,骨骼形成需要成骨细胞的分化和成熟。目的:探索mi R-106及其靶基因骨形态发生受体蛋白2在成骨分化中的作用,为后续研究奠定基础。方法:使用成骨诱导培养基诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞,通过Western blot和碱性磷酸酶染色检测成骨分化标志物表达情况判断成骨分化进程。通过转染模拟剂过表达miR-106a,转染si RNA敲降骨形态发生受体蛋白2的表达,分别使用Real-time PCR和Western blot检测miR-106a和骨形态发生受体蛋白2表达情况。TargetS can软件预测和双荧光素酶报告实验验证miR-106a和骨形态发生受体蛋白2的相互作用。结果与结论:在成骨分化过程中miR-106a表达下调,骨形态发生受体蛋白2表达上调。过表达miR-106a,结果发现碱性磷酸酶活性下降,成骨分化标志蛋白Runx2和OCN表达量下降,同时骨形态发生受体蛋白2表达下调。使用TargetS can预测骨形态发生受体蛋白2可能是mi R-106a的靶基因,双荧光素酶报告实验验证了预测结果。敲降骨形态发生受体蛋白2的表达,成骨分化受到抑制。结果表明miR-106a通过靶向骨形态发生受体蛋白2从而调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。

R-spondin1在促进人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

目的:研究Wnt信号通路激活剂R-spondin1在人骨髓间充质干细胞(h BMSC)成骨分化中的作用。方法:用0、5、10、20μg/L R-spondin1处理h BMSC,利用荧光素酶实验检测R-spondin1对h BMSC中Wnt信号通路的作用,Western blot检测R-spondin1对Wnt信号通路下游靶基因β-catenin蛋白表达的影响;在成骨分化培养基中添加20μg/L R-spondin1诱导h BMSC成骨分化,检测R-spondin1对早期成骨分化指标ALP活性及成骨分化晚期钙沉积、成骨分化标志物OSX、OCN和成骨分化关键转录因子RUNX2表达的影响。结果:R-spondin1增强h BMSC中Wnt信号通路,R-spondin1增强ALP活性和钙沉积,促进OSX、OCN及RUNX2的表达。结论:Rspondin1增强h BMSC中Wnt信号通路的作用,促进h BMSC成骨分化。

高糖微环境下miR-449对人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用和机制研究

目的探讨miR-449在高糖(HG)作用下对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响及其可能的作用机制。方法将hBMSCs接种于成骨培养基培养,诱导其成骨分化。实验组:成骨培养基中加入高糖25 mmol/L,模拟高糖微环境处理。对照组:细胞维持在5 mmol/L葡萄糖的正常培养基中。采用茜素红染色、碱性磷酸酶活性测定、双荧光素酶测定、实时定量PCR(qRT-PCR)检测等方法测定以下指标:(1)miR-449在HG诱导的hBMSCs成骨分化时的表达水平;(2)miR-449模拟物和抑制物对碱性磷酸酶(ALP)活性,成骨相关标志物表达的影响;(3)Sirt1和Fra-1的过表达对miR-449在HG处理的hBMSCs成骨分化标志物表达的影响。结果(1)HG处理的实验组hBMSCs成骨分化低于对照组细胞(P<0.05),miR-449表达水平较对照组降低(P<0.05)。(2)在HG诱导的hBMSCs成骨分化过程中,miR-449模拟物可降低ALP活性(P<0.05),降低成骨标志物的mRNA表达(P<0.05);而miR-449抑制剂能提高成骨标志物的mRNA活性(P<0.05)。(3)miR-449直接靶向结合Sirt1,Sirt1过表达逆转了miR-449模拟物对Fra-1mRNA表达的抑制作用,而Fra-1的过表达减轻了这种抑制作用;过表达Fra-1可减轻miR-449模拟物对ALP活性及成骨标志物mRNA的抑制作用。结论miR-449过表达通过Sirt1/Fra-1信号通路抑制HG处理的hBMSCs的成骨分化;通过调节miR-449可能为糖尿病骨质疏松症的干预提供一种新的治疗方法。

米诺环素改性纯钛抗菌性能及其对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨米诺环素改性纯钛的抗菌性能及其对人骨髓间充质干细胞(hMSC)成骨分化的影响。方法用聚多巴胺(PD)接枝米诺环素,用PD包被纯钛(Ti),将PD涂层的Ti片分别浸入100、200、500μg/mL米诺环素溶液中(100μg/mL组、200μg/mL组、500μg/mL组),制备米诺环素涂层Ti片(MHCI-Ti)。荧光光谱仪测定接枝的米诺环素,X射线光电子能谱表分析MHCI-Ti表面的化学成分,LIVE/DEADBacLaght染色检测细菌黏附能力。常规培养hMSC,并分别接种在抛光的Ti、MHCI-Ti(200μg/mL)上,于成骨培养基中培养。分别于培养第1、4、7天采用MTT法检测细胞活力,在成骨诱导后的第7、14、21、28天用荧光光谱仪检测碱性磷酸酶(ALP)活性,用茜素红染色法检测细胞钙沉积。结果200μg/mL组米诺环素量高于100μg/mL组(P<0.05),200μg/mL组米诺环素量与500μg/mL组比较差异无统计学意义(P>0.05)。扫描电镜图像显示,Ti和MHCI-Ti表面形态相似,MHCI-Ti表面的N1s(399 eV)峰的强度高于Ti表面,表明PD和米诺环素被成功覆盖。变形链球菌在样品上培养7 d,电镜下观察到大量的细菌簇,与MHCI-Ti相比,Ti表面附着的细菌多。激光共聚焦显微镜结果显示,Ti表面有一层明显的细菌层绿色细菌,MHCI-Ti表面有一层死亡的微生物层,其中200μg/mL组抗菌性能最高。与Ti比较,MHCI-Ti表面hMSC培养第4、7天活力高,培养第28天ALP活性高,培养第21、28天钙沉积高(P<0.05)。结论MHCI-Ti抗菌性能高,且可促进hMSC成骨分化。