亚甲蓝对人髓核细胞毒性的CCK-8法检测

背景:亚甲蓝在腰椎椎间孔镜手术中具有鉴别及显影退变椎间盘的作用,但是很多专家学者提出亚甲蓝会加速椎间盘的退变,然而国外文献研究发现亚甲蓝具有嗜酸性,推测对具有酸性环境的退变椎间盘具有治疗作用。因此,亚甲蓝对椎间盘是否具有毒性作用一直存在争议。目的:使用CCK-8法测定亚甲蓝对髓核细胞是否具有毒性作用。方法:选取2例椎间盘突出患者的废弃髓核组织,消化后提取髓核细胞,培养至细胞长满培养皿80%后消化细胞并制作细胞悬液,分6组接种到96孔板,一组为空白对照(只有培养基、CCK-8溶液而没有细胞),一组为0加药对照组(只有培养基、细胞和CCK-8溶液),其余分别加入1%,2%,3%,4%浓度的亚甲蓝干预细胞生长繁殖。在培养24,48,72,96 h后使用CCK-8法测定吸光度,计算细胞活力并观察每一组颜色变化。结果与结论:0加药对照组颜色最深,亚甲蓝各浓度组随着亚甲蓝浓度升高浓度变浅,细胞活力0加药组活力最强,随着亚甲蓝浓度增高,活力下降。推测亚甲蓝对人髓核细胞具有一定的细胞毒性。

肿瘤坏死因子α诱导人髓核细胞凋亡的作用途径

背景:在与细胞凋亡有关的众多因素中,肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成员发挥了重要的作用。但TNF是通过何种途径诱导椎间盘髓核细胞凋亡的机制尚未阐明。目的:探讨TNF-α激活后,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号转导通路中P38MAPK和应激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase,JNK/SAPK)两条途径对人髓核细胞凋亡的作用。方法:体外培养人髓核细胞,将细胞随机分成4组:TNF-α刺激组,P38MAPK阻断组,P-JNK/SAPK阻断组和对照组。采用TUNEL法检测髓核细胞凋亡情况,免疫荧光法检测P-P38MAPK和P-JNK/SAPK的表达及定位;Western Blot法检测P38MAPK,JNK/SAPK及其磷酸化形式的表达。结果与结论:TUNEL法检测凋亡结果中,TNF-α刺激组较其他各组的凋亡细胞密度大(P<0.01);免疫荧光结果显示TNF-α刺激组P-P38MAPK和JNK/SAPK在细胞质和细胞核的表达高于各阻断组和对照组(P<0.01);Western Blot结果显示P38MAPK,P-JNK/SAPK在各组髓核细胞内均有表达,但无活化形式,TNF-α刺激组可见P-P38MAPK,P-JNK/SAPK表达,但相应阻断组无表达。结果表明,外源性TNF-α可通过P38MAPK和P-JNK/SAPK途径导致人髓核细胞凋亡。

骨形态发生蛋白7通过PI3K/Akt通路可抑制人髓核细胞的凋亡

背景:骨形态发生蛋白7可促进人髓核细胞的细胞外基质合成,减缓椎间盘退变。近年来,有学者提出其可能通过对抗髓核细胞凋亡从而发挥上述作用,但其进一步的分子机制一直未被详细阐明。目的:观察骨形态发生蛋白7对无血清诱导下发生凋亡的人髓核细胞产生的作用及其对PI3K/Akt通路的影响,分析并探讨骨形态发生蛋白7抑制人髓核细胞凋亡的分子机制。方法:通过改良Pfirrmann分级及相关条件选取12例患者获取椎间盘组织,采用酶消化法获取人髓核细胞后分组实验,以含体积分数15%胎牛血清的培养基正常培养的髓核细胞设为空白组;使用无血清培养基培养48 h诱导凋亡作为阳性对照组;在无血清条件下,通过加入不同剂量的骨形态发生蛋白7以及同时添加PI3K/Akt通路拮抗剂LY294002形成处理组和拮抗组。使用流式细胞术检测各组细胞凋亡率;免疫荧光观察p-Akt表达;蛋白印迹法检测Akt,p-Akt,BAD和Caspase 9等通路蛋白的表达变化。结果与结论:无血清凋亡诱导下,流式细胞术结果显示,随着骨形态发生蛋白7处理浓度上升,髓核细胞凋亡率明显下降,加入LY294002共同作用后细胞凋亡率再次升高(P<0.05)。p-Akt免疫荧光和蛋白印迹法检测结果进一步表明,与凋亡阳性对照组相比,加入骨形态发生蛋白7的实验组中,p-Akt表达明显增加,其下游凋亡相关蛋白BAD、Caspase 9蛋白表达减少(P<0.05),而在同时加入Akt通路拮抗剂LY294002后,p-Akt蛋白表达下降而凋亡相关蛋白的表达又恢复到相对较高的水平(P<0.05)。结果证明,骨形态发生蛋白7在无血清诱导的人类髓核细胞凋亡中通过激活PI3K/Akt通路,拮抗了BAD-Caspase 9相关的细胞凋亡过程,抑制了髓核细胞的退变。

利拉鲁肽对高糖环境下体外培养的人髓核细胞凋亡的影响

目的:研究不同浓度的利拉鲁肽(liraglutide,LIR)对高糖环境下体外培养的人髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)凋亡的影响。方法:培养人髓核细胞株,第三代髓核细胞随机分为对照组(CON组,NPCM细胞培养液培养)、高糖组(HG组,0.2 mol/L高糖培养液培养)、利拉鲁肽10 nmol/L干预组(LIR10组,0.2 mol/L高糖+10 nmol/L利拉鲁肽)、利拉鲁肽100 nmol/L干预组(LIR100组):0.2 mol/L高糖+100 nmol/L利拉鲁肽、利拉鲁肽1 000 nmol/L干预组(LIR1 000组):0.2 mol/L高糖+1 000 nmol/L利拉鲁肽。各组细胞培养48 h,CCK-8对人髓核细胞的增殖活性进行定量分析,流式细胞术及ELISA检测细胞凋亡率,细胞内活性氧(ROS)检测评估氧化应激水平。采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。结果:与正常对照组相比,高糖组细胞增殖活性明显减低,细胞内ROS生成及凋亡率明显增加(P<0.05)。利拉鲁肽(10,100,1000 nmol/L)的干预使细胞增殖活性较高糖组明显升高,ROS的水平及细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。在浓度为100 nmol/L时,利拉鲁肽的促进细胞增殖,抑制氧化应激及抗凋亡作用最强,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:利拉鲁肽通过抗氧化应激抑制了高糖诱导的人髓核细胞凋亡,从而发挥保护作用。

CCK-8法定量检测亚甲蓝对人髓核细胞的毒性

背景:前期细胞实验研究发现亚甲蓝确实对人髓核细胞具有毒性作用,且与药物浓度呈正相关,但是其毒性的临界范围未进行研究。目的:使用CCK-8法定量测定亚甲蓝对髓核细胞毒性作用的临界范围值。方法:选取1例椎间盘突出症患者的术后废弃髓核组织,提取髓核细胞,培养1代后制作细胞悬液,分9组接种到96孔板,空白对照只有培养基、CCK-8溶液而没有细胞;0加药对照组只有培养基、细胞和CCK-8溶液;其余7个加药组分别加入1%,0.5%,0.1%,0.05%,0.01%,0.005%,0.001%浓度的亚甲蓝干预细胞生长繁殖。在培养24,48,72,96 h后使用CCK-8法测定吸光度,计算细胞活力并观察每一组颜色变化。结果与结论:(1)颜色变化:0加药对照组颜色最深,加药组颜色与药物浓度负相关,且0.05%、0.01%、0.005%、0.001%组颜色较深并与0加药组颜色接近;(2)各组吸光度值均数及细胞活力:与0加药组相比,1%组吸光度减小(P<0.05),1%与0.5%组比较差异均无显著性意义(P>0.05),0.1%组吸光度及细胞活力显著高于0.5%组,0.05%组显著高于0.1%组;(3)结论:亚甲蓝对人髓核细胞具有细胞毒性,毒性临界值在0.1%-0.05%之间且靠近0.05%,确切值还有待于进一步研究。

身痛逐瘀汤对静水压下人髓核细胞凋亡和基质相关蛋白表达的影响

目的:探讨身痛逐瘀汤对静水压下人髓核细胞(NP)凋亡率及髓核细胞外基质相关蛋白SOX9、CollagenⅡ表达的调控作用。方法:按照兔与人的表面积转换方法得出兔中药灌胃量为28 g/(kg·d)颗粒剂。连续灌胃3 d后,从腹主动脉取血,制备身痛逐瘀汤含药血清。将人NP细胞分为6组,压力组:0.3 MPa压力组、1 MPa压力组、3 MPa压力组;中药组:0.3 MPa压力+中药含药血清组、1 MPa压力+中药含药血清组、3 MPa压力+中药含药血清组。将6组人NP细胞在医用恒温静水压压力罐中作用2 h、4 h、6 h后,使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测每组NP细胞的增殖活性;使用Annexin V-FITC/Propidium Iodide双染法检验各组NP细胞的凋亡情况;Western Blot法检验SOX9、CollagenⅡ在NP细胞中含量的变化。结果:CCK-8法检验2组NP细胞的活性:在相同压力和时间下,含药血清组NP细胞活性比压力组高,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞术检测NP细胞凋亡:在相同压力和时间下,含药血清组NP细胞凋亡率低于压力组,差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot检测相关蛋白的表达情况:中药组SOX9、Collagen II的总体水平高于压力组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在静水压环境下下,身痛逐瘀汤能够增加细胞活性,减少细胞凋亡,并促进人NP细胞CollagenⅡ、SOX9表达,具有延缓椎间盘退变的作用。

构建人端粒酶反转录酶基因腺相关病毒2载体在人髓核细胞的表达

背景:动物研究显示,自体髓核细胞移植能有效修复椎间盘退变。然而髓核细胞体外增殖能力差,这就限制了其作为种子细胞在椎间盘退变性疾病治疗中的研究及应用。目的:构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2载体,观察其转染人髓核细胞后人端粒酶反转录酶基因的表达。方法:构建pSNAV2.0-pRSV-hTERT质粒并鉴定,采用AAVMaxTM包装系统进行重组腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体的构建,以PCR及酶切方法验证构建的质粒,构建成功后扩增,并纯化。利用腺相关病毒2-增强型绿色荧光蛋白载体转染第1代人髓核细胞,测定最佳感染复数。参照此感染复数值,确定腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶对人髓核细胞转染的相关感染复数;对照组采用不含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2进行转染。转染后1,2,4周分别采用RT-PCR对人端粒酶反转录酶基因mRNA水平进行半定量检测。结果与结论:实验成功构建了腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体;并获得了滴度达2×1011 v·g/mL的腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体。测得腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体对人髓核细胞的最佳感染复数为5×104 v·g/cell。在以1×104,5×104,1×105 v·g/cell转染人髓核后,均可检测到人端粒酶反转录酶基因mRNA的高量表达。采用RT-PCR半定量检测方法,发现以转染后2周时人端粒酶反转录酶mRNA表达量相对最高(P<0.05),4周时仍可见人端粒酶反转录酶基因mRNA的稳定表达。而对照组无论在何时间点均未能检测到人端粒酶反转录酶mRNA的表达。提示利用腺相关病毒2可以成功构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的病毒载体,腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶能有效转染人髓核细胞并稳定表达人端粒酶反转录酶基因mRNA,此结果可能为增强髓核细胞性能提供新的策略。

淫羊藿苷联合地塞米松对人髓核细胞增殖及分泌表达的影响

目的探讨淫羊藿苷(ICA)与地塞米松(Dex)联合作用对人髓核细胞(h NPs)增殖及聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、II型胶原蛋白(Col2a)、IL-6、IL-8和基质金属蛋白酶(MMP-13)表达的影响。方法取生长状态良好的h NPs按不同处理因素分为:control组(只含培养基)、ICA组(20μmol/L ICA)、Dex组(0.2μmol/L Dex)、ICA+Dex组(20μmol/L ICA+0.2μmol/L Dex)、IL-1β组(10 ng/ml IL-1β)、ICA+IL-1β组(20μmol/L ICA+10 ng/ml IL-1β)、Dex+IL-1β组(0.2μmol/L Dex+10 ng/ml IL-1β)、ICA+Dex+IL-1β组(20μmol/L ICA+0.2μmol/L Dex+10 ng/ml IL-1β),各组作用48 h;CCK-8法检测细胞的增殖;Western blot、RT-PCR以及ELISA检测Aggrecan、Col2a、IL-6、IL-8和MMP-13表达。结果 CCK-8结果显示:与control组比较,低浓度的ICA(≤20μmol/L)和Dex(≤0.2μmol/L)单独作用均提高h NPs存活率但差异无统计学意义(P>0.05)。然而,10μmol/L ICA和0.2μmol/L Dex联合用药对h NPs的存活率大于单独用药(P<0.05);Western blot、RT-PCR以及ELISA结果表明:与单独用药组相比,ICA和Dex联合作用促进Aggrecan、Col2a蛋白和m RNA表达(P<0.05);另外,ICA和Dex联合处理抑制IL-1β诱导的h NPs炎症介质IL-6、IL-8的分泌表达(P<0.05),同时降低MMP-13蛋白、m RNA水平(P<0.05)。结论 ICA与Dex联合作用对促进h NPs增殖、Aggrecan和Col2a表达有效果;同时抑制IL-1β诱导的h NPs炎症介质IL-6、IL-8和MMP-13的表达,为椎间盘退行性病变的药物治疗提供理论依据。

过表达miR-200c对人髓核细胞凋亡的影响及其机制

目的观察过表达miR-200c对人髓核细胞(HNPCs)凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法体外培养HNPCs,将HNPCs分为观察组、阴性组和空白组,观察组转染hsa-miR-200c mimics,阴性组转染阴性对照mimics-NC,空白组未经任何干预。转染后24 h,采用real-time PCR法检测3组细胞miR-200c的表达,流式细胞仪测算细胞凋亡率,ELISA平板计数法检测Caspase3/7活性,Western blotting法检测3组细胞酪氨酸蛋白激酶受体B(Trk B)蛋白。结果观察组、阴性组和空白组细胞miR-200c相对表达量分别为8.11±0.21、1.07±0.04、0.99±0.05,细胞凋亡率分别为23.6%±3.1%、1.5%±0.2%、1.6%±0.1%,Caspase3/7活性分别为299.237±24.245、119.476±10.657、117.317±11.317,Trk B蛋白相对表达量分别为0.48±0.11、0.50±0.12、0.15±0.06,观察组与阴性组、空白组比较,P均<0.01。结论过表达miR-200c能够促进HNPCs的凋亡,其机制可能与调控Trk B的表达有关。

miR-640调控Wnt信号通路对腰椎间盘突出患者髓核细胞衰老及凋亡的影响

目的探讨miR-640调控Wnt信号通路对腰椎间盘突出患者髓核细胞衰老及凋亡的影响及其机制。方法选取我院32例腰椎间盘突出患者的腰椎间盘组织作为观察组,另选取32例外伤患者未病变的腰椎间盘组织作为对照组,qPCR检测2组miR-640表达水平。分离培养人髓核细胞,培养后将原代培养髓核细胞分为Control组、NC组和miR-640组,NC组和miR-640组分别转染NC质粒和miR-640质粒,通过SA-β-gal实验检测各组细胞衰老水平,流式细胞仪检测各组细胞凋亡水平,免疫荧光检测β-连环蛋白(β-catenin)的表达水平和定位,双荧光素酶报告基因实验检测miR-640和β-catenin的靶向调控关系。结果与对照组比较,观察组腰椎间盘组织miR-640表达水平显著升高(P<0.01)。与Control组比较,miR-640组细胞衰老水平增加,细胞凋亡率增加,差异均具有统计学意义(P<0.01),NC组与Control组上述指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光证实miR-640组细胞β-catenin的表达降低,β-catenin入核受到抑制,差异具有统计学意义(P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验证实miR-640和β-catenin具有靶向关系,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论腰椎间盘突出患者中miR-640表达水平升高,miR-640可以促进髓核细胞衰老和凋亡,其机制可能与Wnt信号通路的调控有关。

柚皮苷通过Fas膜受体通路调控髓核细胞凋亡的机制研究

[目的]观察中药骨碎补单体柚皮苷(Naringin)对人退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响,为治疗椎间盘退变提供理论依据。[方法]对体外培养的人退变椎间盘髓核细胞利用番红O染色和甲苯胺蓝染色进行鉴定,并对P3代细胞分别用柚皮苷0 g/m L(对照组)、柚皮苷20 g/m L、柚皮苷40 g/m L、柚皮苷80 g/m L的培养基培养人髓核细胞48 h,噻唑蓝(MTT)法选择其抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡的最佳浓度,并用流式细胞仪测定各组细胞凋亡率。实时定量聚合酶链锁反应(q RT-PCR)检测Fas、Fas L、Caspase-8基因表达。蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测Fas蛋白表达。[结果]MTT法和流式细胞检测均测定20 g/m L柚皮苷为抑制髓核细胞凋亡的最佳浓度(P<0.05)。q RT-PCR检测20 g/m L柚皮苷能够抑制Fas、Fas L、Caspase-8 m RNA表达(P<0.05)。Western-blot检测显示20 g/m L柚皮苷能够抑制Fas、Fas L、Caspase-8蛋白表达。[结论]柚皮苷可能通过调控Fas/Fasl死亡受体凋亡通路抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡。

补骨脂素调控SKP2/PTHrP/SIRT1轴缓解炎症环境下髓核细胞退变的作用

目的探讨补骨脂素对白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的人髓核细胞(HNPCs)退变的影响及机制。方法体外培养HNPCs,用10 ng/ml IL-1β和50 ng/ml TNF-α诱导HNPCs 24 h使其发生退变,设置对照组、IL-1β+TNF-α组、补骨脂素(10 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L)组、补骨脂素(25 μmol/L)+S期激酶相关蛋白2(SKP2)干扰或过表达组、补骨脂素+甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)重组蛋白(100 nmol/L)组、补骨脂素+PTHrP重组蛋白(100 nmol/L)+沉默信号调节子1(SIRT1)激活剂SRT1720(1 μmol/L)组。采用流式细胞术检测髓核细胞凋亡情况;ELISA法检测髓核细胞中IL-6、基质金属蛋白酶3(MMP-3)和MMP-13的表达水平;DCFDA探针法检测髓核细胞中活性氧(ROS)的水平;Western blotting检测髓核细胞中SKP2、PTHrP、SIRT1、细胞外基质(ECM)相关蛋白[二型胶原蛋白(COL Ⅱ)和蛋白聚糖蛋白]的表达水平;蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)实验检测SKP2与PTHrP蛋白的相互作用;泛素化实验检测补骨脂素对SKP2介导的PTHrP泛素化水平的影响。结果补骨脂素以剂量依赖的方式抑制炎症环境下髓核细胞凋亡以及IL-6、MMP-3、MMP-13和ROS的生成(P<0.05或P<0.01),促进SKP2和ECM相关蛋白的表达(P<0.05)。与补骨脂素+杂乱干扰组比较,补骨脂素+SKP2干扰组SKP2和ECM相关蛋白的表达水平明显降低(P<0.05),髓核细胞凋亡率、IL-6、MMP-3、MMP-13和ROS水平明显增高(P<0.05或P<0.01)。Co-IP实验结果显示,SKP2与PTHrP蛋白存在相互作用。泛素化实验结果显示,与补骨脂素+空载体组比较,补骨脂素+SKP2过表达组PTHrP蛋白表达水平明显降低,SKP2蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与补骨脂素组比较,补骨脂素+PTHrP重组蛋白组SIRT1和ECM相关蛋白表达水平明显降低(P<0.05),髓核细胞凋亡率、IL-6、MMP-3、MMP-13和ROS水平明显升高(P<0.05);与补骨脂素+PTHrP重组蛋白组比较,补骨脂素+PTHrP重组蛋白+SRT1720组PTHrP蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),SIRT1和ECM相关蛋白表达水平明显升高(P<0.05),髓核细胞凋亡率、IL-6、MMP-3、MMP-13和ROS水平明显降低(P<0.05)。结论补骨脂素可通过促进SKP2介导的PTHrP泛素化降解而活化SIRT1,抑制炎症环境下髓核细胞的凋亡。

白介素6对人髓核细胞凋亡的影响

[目的]研究炎症因子IL-6对人髓核细胞凋亡的影响及可能机制。[方法]培养人髓核细胞,将细胞随即分为4组:IL-6刺激组;IL-6+P38MAPK阻断组;IL-6+JNK/SAPK阻断组及对照组。然后用AnnexinV/PI染色流式细胞仪和TUNEL法检测髓核细胞凋亡情况,免疫荧光检测P-P38MAPK和P-JNK/SAPK的表达及定位;West-ern印迹法检测P38MAPK、JNK/SAPK及各自活化形式,即P-P38MAPK和P-JNK/SAPK的表达。[结果]流式细胞仪和TUNEL法检测凋亡结果中,IL-6刺激组相对于对照组及各阻断组有着较高的凋亡细胞密度(P<0.01);免疫荧光结果显示IL-6刺激组P-P38MAPK和P-JNK/SAPK在细胞质和细胞核均有表达,各阻断组在细胞质和细胞核可见少量表达,与IL-6刺激组差异有显著统计学意义(P<0.01),对照组仅见极少量表达;Western印迹法结果显示P38MAPK,JNK/SAPK在各组髓核细胞内均有表达,但无活化形式,IL-6刺激组可见P-P38MAPK,P-JNK/SAPK表达,但相应阻断组无表达。[结论]外源性IL-6可通过P38MAPK和P-JNK/SAPK途径导致人髓核细胞凋亡。

柚皮苷通过Wnt/β-连环蛋白通路调控人髓核细胞凋亡的机制

目的观察柚皮苷通过Wnt／β-连环蛋白（β-catenin）通路对人退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响。方法对体外培养的人退变椎间盘髓核细胞染色鉴定后，分别用柚皮苷0μg／ml（对照组）、10、20、40、80、100μg／ml的培养基培养48h，细胞计数试剂盒（CCK-8）及流式细胞法选择其抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡的最佳浓度。实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测β-catenin、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、c-Mye癌基因（c-Myc）表达。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测B淋巴细胞瘤-2（bcl-2）、bcl-2相关X蛋白（bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖表达。Western blot检测Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖表达。结果细胞染色结果均为阳性。CCK-8及流式细胞法测定20 μg/ml柚皮苷为抑制人髓核细胞凋亡的最佳浓度。liT-qPCR检测显示，在人退变椎间盘髓核细胞（对照组）中，与正常髓核细胞比较，β-catenin基因过表达，CyclinD1、c-Myc基因表达下调。加入20 μg/ml柚皮苷后，可以明显抑制β-catenin基因的表达（P=0．000），促进Cyclin D1、c-Myc基因表达（P：0．000、0．001）。ELISA显示，20 μg/ml柚皮苷可以明显上调bcl-2、蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白表达（P=0．001、0．000、0．023），下调bax、Caspase-3蛋白表达（P=0．001、0．001），并可以促进Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖表达。结论柚皮苷可能通过调控Wnt／β-catenin信号通路和线粒体凋亡通路抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡。

体外培养人正常椎间盘髓核细胞与退变髓核细胞的生物学性状比较：可以为干预退变髓核细胞提供最佳时机吗？

背景:人体椎间盘是一个承受载荷却又缺乏血管的结构,因而容易发生退行性变,但椎间盘退变的机制尚不明确。目的:通过体外培养人正常椎间盘髓核细胞与退变髓核细胞生物学性状比较,认识退变髓核细胞的细胞学退变时机。方法:分离、培养人正常及退变椎间盘髓核细胞,对两种细胞采用光镜、电镜等形态学方法进行大体形态和超微结构观察,采用生长曲线和XTT实验研究两种细胞的生长动力学差异,测定髓核细胞的活力和细胞Ⅱ型胶原及糖胺多糖的mRNA表达。结果与结论:退变椎间盘细胞至少要比正常椎间盘细胞提前2代出现形态学老化表现。退变髓核细胞表现为G1期阻滞,使细胞不能进入S期,细胞有丝分裂受到抑制。退变髓核细胞总体来说,生长要比正常髓核细胞快,但老化也较快。退变髓核细胞自第1代开始,Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达比同期正常髓核细胞低得多。说明在体外培养条件下,退变髓核细胞持续增殖能力低,更容易衰老、凋亡。提示退变髓核细胞体外培养衰老较快,进行干预试验逆转椎间盘退变的最佳时机为传2代之前的细胞。

微小RNA-410对人髓核细胞增殖及分泌表达的影响

目的探讨微小RNA（miRNA，miR）-410对人髓核细胞增殖及分泌表达的影响。方法实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测人髓核细胞转染miR-410 mimics后miR-410表达水平；转染后细胞培养12、24、48、72 h，细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测细胞增殖；双荧光素酶报告基因检测miR-410与低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的靶标关系；Western blot检测聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、Ⅱ型胶原蛋白α1链（Col2A1）和HIF-1α的表达水平。结果与scramble组比较，转染miR-410 mimics后miR-410的表达显著增加（0.85±0.12比2.74±0.34，P＝0.015）。CCK-8结果显示与scramble组比较，转染miR-410 mimics后细胞存活率逐渐增加，并存在时间依赖性，72 h时最显著（1.15±0.12比0.62±0.05，P＝0.003）；miR-410过表达使Aggrecan和Col2A1蛋白表达量显著上升（0.96±0.08比3.23±0.29，P＝0.003；0.96±0.06比2.45±0.18，P＝0.000）。双荧光素酶报告基因检测结果表明miR-410与HIF-1α存在直接的靶标关系（0.32±0.15，P＝0.000）；miR-410过表达抑制HIF-1α蛋白表达水平（0.53±0.04，P＝0.007）。 结论miR-410过表达促进人髓核细胞增殖并增加Aggrecan和Col2A1表达，其机制可能与靶向抑制HIF-1α表达有关。

利拉鲁肽对波动高糖所致人髓核细胞损伤的作用

目的观察利拉鲁肽(LIR)对波动高糖诱导的人髓核细胞氧化应激和炎性损伤的保护作用。方法培养人髓核细胞株,第三代髓核细胞随机分为7组:(1)5.5 mmol/L低浓度葡萄糖对照组(CON组);(2)33 mmol/L持续高浓度葡萄糖组(H组);(3)5.5~33 mmol/L波动高糖组(F组);(4)33 mmol/L高渗对照组(P组);(5)LIR 10 nmol/L(nM)干预组(LIR 10组):5.5~33 mmol/L波动葡萄糖+10 nM LIR;(6)LIR 100 nM干预组(LIR 100组):5.5~33 mmol/L波动葡萄糖+100 nM LIR;(7)LIR 1000 nM干预组(LIR 1000组):5.5~33 mmol/L波动葡萄糖+1000 nM LIR。各组细胞培养72 h,CCK-8对人髓核细胞的增殖活性进行定量分析,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平,ELISA检测各组细胞上清液中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)与细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的含量。结果与CON组和P组相比,H组、F组、LIR干预组(LIR 10、100、1000 nM)的细胞增殖活性(OD值)、SOD、GSH降低,ROS水平及MDA、TNF-α、ICAM-1含量增加,差异有统计学意义(P<0.05);P组与CON组相比各指标差异均无统计学意义(P>0.05);F组与H组相比,细胞增殖活性、SOD、GSH水平明显下降,MDA、ROS、ICAM-1与TNF-α含量升高(P<0.05)。与F组相比,LIR各浓度干预组细胞增殖活性、SOD活性、GSH含量均增加,ROS、MDA、ICAM-1与TNF-α含量均下降(P<0.05),且LIR在中等浓度(100 nM)达到最大作用效果。结论LIR可能通过减轻波动高糖诱导的人髓核细胞的氧化应激及炎性反应,从而发挥保护作用。

人退变髓核细胞中内质网应激水平的观察研究

目的观察探讨退变与正常髓核组织中内质网应激水平的差异。方法获取正常和退变髓核组织共9例(均为海军总医院骨科2016年1月至2017年6月期间住院手术患者),取组织及分离培养髓核细胞,通过透射电镜观察内质网形态、免疫组化法对髓核组织中葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表达分布进行定性分析,RT-PCR及Western blot对髓核细胞中GRP78、CHOP进行mRNA和蛋白质水平的分析。结果透射电镜结果显示退变髓核细胞的内质网扩张、肿胀,正常片状折叠结构消失;免疫组化染色及Western blot检测结果均可见退变髓核组织GRP78、CHOP的表达升高;RT-PCR提示较之于正常组,退变组GRP78[(1.076±0.13)vs(2.471±0.53)]、CHOP[(1.09±0.21)vs(6.873±1.4)]明显升高(P<0.05)。结论退变髓核细胞中内质网应激水平较正常髓核细胞升高,提示内质网应激可能在髓核细胞退变过程中发挥作用。

退变髓核细胞拉伸实验的形态学研究

目的:探讨退变髓核细胞拉伸实验对髓核细胞形态学的影响,为临床牵引治疗腰椎间盘突出症提供理论依据。方法:取椎间盘突出症患者术中取出的废弃髓核组织6例,将培养后的髓核细胞接种到拉伸板上,分别以5%、10%和15%拉伸幅度拉伸24 h,高倍镜下观察细胞形态学变化;腰椎间盘突出症患者使用体重20%、30%、35%牵引力的重量牵引,拍摄牵引前、牵引30 min时的腰椎侧位X线片,测量并计算各椎间隙高度的变化。结果:退变髓核细胞5%幅度拉伸24 h后髓核细胞形态轻度好转,10%幅度拉伸24 h后髓核细胞形态接近正常髓核细胞,15%幅度拉伸24 h后髓核细胞形态变差。不同组的细胞个数存在统计学差异(P<0.05),表现为10%拉伸幅度组>5%拉伸幅度组>对照组>15%拉伸幅度组;腰椎间盘突出症患者牵引30 min时三组椎间隙增加幅度存在统计学差异(P<0.05),表现为20%体重组<30%体重组<35%体重组。结论:5%拉伸幅度可促进退变髓核细胞的缓慢修复,15%拉伸幅度不利于退变髓核细胞的修复,10%拉伸幅度有利于促进退变髓核细胞的较快修复。30%体重牵引力适合于腰椎间盘突出症患者的牵引治疗。

从脊柱内镜手术摘除组织中分离髓核间充质干细胞及其生物学特征鉴定

目的:利用经皮内镜下腰椎间盘切除术获取来源明确的髓核组织,结合组织块培养法高效分离培养人髓核间充质干细胞(human nucleus pulposus mesenchymal stem cells,hNP-MSCs),并鉴定其生物学特征。方法:收集6例腰间盘突出症手术摘除的髓核组织,利用组织块培养法分离培养。取第3~6代生长良好的细胞用于实验,采用CCK-8检测增殖能力;用流式细胞术检测细胞表面标志物;并分别向成骨、成脂和成软骨方向诱导分化,用油红O染色、茜素红染色及阿利新蓝染色对分化结果进行检测。结果:成功从椎间盘内镜摘除的髓核组织中分离培养具有增殖能力的细胞,流式细胞术检测显示细胞高表达CD29、CD44、CD90、CD73和CD105等间充质干细胞抗原,不表达造血干细胞标志CD34和CD45。生长曲线显示符合正常间充质干细胞增殖特征。茜素红染色、阿利新蓝染色及油红O染色均呈阳性,说明分离培养的细胞具有向成骨、成软骨和成脂肪诱导分化的能力。结论:首次结合椎间盘内镜微创手术和组织块培养法,体外高效分离培养了具有自我更新能力和多向分化潜能的hNP-MSCs。