人鼠嵌合单克隆抗体c30.6的纯化

采用介体电泳技术对CHO细胞培养液中的人鼠嵌合单克隆抗体c30 6进行纯化 ,第一步在pH8 6条件下进行 ,抗体带正电荷而培养液中的大部分杂质带负电荷 ,抗体和杂质在电场作用下向两电极运动 ,结果被分离在分离膜的两侧 ,SDS -PAGE显示抗体纯度达 95 % ,且剩余杂质的分子量均小于抗体的分子量。第二步是在pH6 0条件下进行 ,此时抗体和杂质都带正电荷 ,它们在电场作用下向同一方向运动 ,但分离膜只允许分子量较小的杂质通过 ,抗体得以进一步纯化 ,抗体的回收率为 80 % ,而且生物活性未受影响。

大鼠抗小鼠重组Foxc2单克隆抗体的制备与检测应用

目的 :为了研究叉头框c2 (Foxc2 )在骨骼和主动脉发育上的作用。方法 :利用基因重组融合蛋白制作大鼠抗小鼠Foxc2单克隆抗体 (抗 Foxc2mAb) ,并利用蛋白质印迹和免疫荧光分析了Foxc2蛋白在小鼠肌胚细胞C2C12的表达和在小鼠胚胎的表达部位。结果 :用小鼠GST Foxc2融合蛋白免疫大鼠制得的抗 Foxc2mAb效价为 1∶5 0 0 0 ,并特异地与转染了CX Foxc2质粒的小鼠L细胞和人膀胱癌HTB9细胞产生的Foxc2蛋白结合。在骨成形蛋白 2 (BMP 2 )的诱导下 ,Foxc2蛋白在C2C12细胞中显著地增加 ,用反义Foxc2序列转染C2C12细胞可以明显地抑制Foxc2蛋白在这个细胞系中的表达。Foxc2蛋白表达主要定位于 11 5 dpc小鼠胚胎的生骨节和主动脉周围的间充质组织。结论 :应用大鼠抗小鼠基因重组Foxc2单克隆抗体研究Foxc2的作用 ,结果表明Foxc2蛋白在BMP 2的诱导下 。

射频消融术联合瘤内注射^(131)I-肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体治疗肺癌的近期疗效评估

目的观察射频消融术联合瘤内注射131I-肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体(131I-chTNT)治疗肺癌的近期疗效。方法对32例肺癌患者采用射频消融联合131I-chTNT瘤内注射。结果治疗后有效率56.25%,其中完全缓解3例,部分缓解15例,无变化8例,进展6例。结论该治疗方法疗效满意,是一种疗效可靠、安全、并发症少的治疗技术。

Big-BALB/c小鼠亚系选育前后的抗体制备效率比较研究

目的比较利用BALB/c和Big-BALB/c(简称B-BALB/c)两种亚系小鼠制备鼠痘及鼠肝炎单克隆抗体的效率,为今后通过杂交瘤进行体内诱导单克隆抗体制备时实验动物的选择提供参考。方法从常规繁育的BALB/c小鼠群体中选择4周龄体重超过正常动物5%(后期选种标准为超过10%)的个体进行选种并单独繁育,经10代选育制备B-BALB/c小鼠亚系。选择10~11周龄、雌雄各半的BALB/c小鼠和B-BALB/c小鼠各40只,分别接种用液体石蜡预处理后的鼠痘单克隆抗体杂交瘤细胞株G23或鼠肝炎单克隆抗体杂交瘤细胞株Y15,然后通过体内诱生法获取含单克隆抗体的小鼠腹水,利用间接ELISA法检验抗体效价,按照品系、性别和接种杂交瘤类型对小鼠进行分组,分析腹水产量、抗体效价和抗体产量以评估两种亚系小鼠的抗体制备效率。结果经10代选育后获得的10周龄雄性和雌性B-BALB/c小鼠体重分别比同周龄BALB/c小鼠增加了22.3%和12.8%。抗体制备过程中,B-BALB/c小鼠的耐受力比BALB/c小鼠更好,能够适应二次腹水采集;与BALB/c小鼠相比,B-BALB/c小鼠腹水产量和抗体效价均显著提高,尤以杂交瘤细胞株G23接种组更明显(均P<0.0001)。接种杂交瘤细胞株G23或Y15后,B-BALB/c小鼠的平均抗体产量(14.99×10^(4)U和33.22×10^(4)U)高于BALB/c小鼠(5.33×10^(4)U和19.31×10^(4)U)(均P<0.01)。接种杂交瘤细胞株G23后,B-BALB/c小鼠的平均单位体重的抗体产量(0.55×10^(4)U/g)高于BALB/c小鼠(0.23×10^(4)U/g)(P<0.0001)。接种杂交瘤细胞株Y15后,雌性B-BALB/c和BALB/c小鼠的单位体重抗体产量高于同亚系的雄性B-BALB/c小鼠(均P<0.01)。结论B-BALB/c小鼠在单克隆抗体体内诱导制备中可作为BALB/c小鼠的替代选择,能够达到减少实验动物使用数量、降低人力成本并提高抗体制备效率的目的。

6C6鼠-人嵌合抗体的纯化及鉴定

采用基因工程技术 ,将小鼠 6C6单克隆抗体可变区基因与人抗体恒定区基因连接 ,构建了鼠 人 6C6嵌合抗体基因 ,并在CHO细胞中高效表达 .利用ProteinA亲和层析柱从细胞培养上清中分离纯化 6C6嵌合抗体 ,得到电泳纯度大于 98%的 6C6嵌合抗体 ,其重链 (5 5kD)和轻链 (2 4kD)符合IgG相对分子质量的理论值 .Western印迹、细胞免疫荧光和免疫组织化学实验结果均呈阳性 .表明6C6嵌合抗体可识别人乳腺癌细胞表面上的肿瘤相关抗原 ,保持了 6C6单克隆抗体的特性 。

注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体病毒去除/灭活工艺的建立及效果验证

旨在建立注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体病毒去除/灭活工艺,并进行效果验证。膜过滤工艺去除病毒验证结果表明,膜过滤后的蛋白质回收率在98%以上,分子排阻色谱纯度在膜过滤前后没有明显变化;经测试,膜过滤后小鼠白血病病毒、小鼠微小病毒、呼肠孤病毒滴度的降幅均大于4 lg TCID 50/0.1 mL。低pH值孵放灭活病毒验证工艺结果表明,低pH值孵放前后蛋白质含量、分子排阻色谱纯度没有明显变化;测试结果表明,室温处理时间≥0.5 h,小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒的滴度降幅均大于4 lg TCID 50/0.1 mL。该去除/灭活效果均符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求,建立的工艺有效保证了产品的质量及安全性。

分泌抗Bt Cry1Ac蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

从苏云金芽孢杆菌HD-73中提取Bt Cry1Ac蛋白,电镜观察Bt Cry1Ac蛋白为标准的菱形.用SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞与经该Bt Cry1Ac蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞融合,经3次克隆化,筛出两株稳定分泌Bt Cry1Ac单克隆的杂交瘤细胞株1C3、2F3.两株细胞均具有抗Bt Cry1Ac特异性,与Bt Cry1Ab和Bt Cry2A无明显的交叉反应,经亚型鉴定均为IgG1.腹水滴度均为1∶1024000.

小鼠尾静脉注射^(125)I标记的抗CEA人鼠嵌合抗体rch24的药代动力学研究

目的探讨125I-rch24在小鼠体内的药代动力学过程。方法7只BABL/c小鼠,溴代琥珀酰亚胺(NBS)法标记的抗体125I-rch24尾静脉注射,于注射后不同时间尾根部取血,测定放射性计数,绘制血清除曲线,计算药代动力学参数。结果①125I与CEA人鼠嵌合抗体rch24结合,采用纸层析法测定的标记率为95.5%±02%;②标记抗体的放射化学纯度至14天后为92.6%,35天后为89.3%;③经计算机模拟,为双指数曲线,标记抗体的血液分布、清除符合二房室模型。结论正常小鼠尾静脉注射标记抗体125I-rch24后的药代动力学过程符合二房室模型,静脉注射适宜用于结肠癌放射免疫导向手术。

抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达

目的 :构建嵌合型抗人膀胱癌抗体的真核表达载体 ,并实现其真核表达。方法 :从杂交瘤细胞中克隆得到鼠源单抗的可变区基因 ,插入嵌合抗体IgG1真核表达载体pDHL中 ,转染CHO细胞 ,实现其真核表达 ,并对抗人膀胱癌人 鼠嵌合抗体的功能进行初步鉴定。结果 :成功构建抗人膀胱癌人 鼠嵌合抗体真核表达载体 ,并实现其真核表达。初步的功能鉴定表明抗人膀胱癌人 鼠嵌合抗体具有较好的特异性和亲合力。结论 :构建的抗人膀胱癌人 鼠嵌合抗体真核表达载体在真核细胞内得到表达 ,且其功能较为理想。

猪生长激素单克隆抗体的制备及其特性

选取7只BALB/c小鼠,以猪生长激素为抗原,采用常用的免疫方法进行免疫,通过细胞融合技术,经筛选克隆,获得了3株分泌猪生长激素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1A3、1A5、1B5。亚类鉴定,1A3为IgG1,1A5和1B5为IgG2a。腹水效价依次为1∶3.2×105、1∶3.2×104、1∶6.4×104。亲和力常数依次为1.0×109M-1、0.5×107-1和2.0×108-1。

重组抗人CD22嵌合抗体SM03的^(125)I标记及生物活性

为了探讨125I标记的重组抗人CD22嵌合抗体SM03的生物活性,采用Iodogen法进行单克隆抗体SM03的125I标记,Sephacryl S-300 HR色谱柱分离标记混合物,测定分离后样品的纯度与浓度。采用竞争结合法和酶联免疫吸附法(ELISA)测定纯化后样品的活性。抗体经过放射性标记后,放化纯度>99%,回收率>47%1。25I-SM03的生物活性与未标记抗体差异没有显著性,P=0.907。用125I-SM03筛选CD22抗原表达量最多的细胞,在Raji、Daudi和Ramos细胞中,SM03与Ramos细胞的特异性结合量最多,每个细胞的结合量为1.3 pmol。以上结果表明,Indogen法可以用于单克隆抗体SM03的标记,标记后不影响SM03的生物活性。

抗入肝细胞癌单克隆抗体的产生及其相应抗原P60的免疫组化定位研究

本文用肝癌手术标本,制备细胞悬液,免疫BALB/c小鼠,融合产生杂交瘤,用ABC染色法筛选单克隆抗体,获得特异性较好的杂交瘤-HAb_(18),抗体亚类为小鼠IgG1,抗原经亲和层析获得,分子量为60KD,过碘酸-Schiffs染色阴性,脂蛋白电泳阴性,PI:8.2。肝癌免疫组化染色阳性率为75％。

单克隆抗体技术的研究进展

杂交瘤制备单克隆抗体的出现创立了具有划时代意义的新技术。随着分子生物学的飞跃发展,人—鼠嵌合抗体、人源化抗体、完全人源性单克隆抗体应运而生。这些技术在许多学科领域得到广泛应用,特别在疾病的诊断和治疗方面。单克隆抗体受到世界各界学者的极大关注,被认为是具有巨大生命及发展前途的一项新技术。本文主要对单克隆抗体的研究进展进行综述。

抗重组日本血吸虫P38抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的在大肠埃希菌中可溶性表达日本血吸虫P38(SjP38)抗原分子,并以其纯化产物为抗原,制备抗SjP38单克隆抗体(McAb)。方法将pET32(a)-P38重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),在1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过镍柱一步法纯化,以纯化的重组SjP38为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出高分泌滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,蛋白质印迹法(Westernblotting)分析其特异性。结果筛选出能稳定分泌抗重组SjP38单克隆抗体的8株杂交瘤细胞株,均为IgG1;Westernblotting分析显示8株单抗能与日本血吸虫虫卵抗原中的天然P38发生特异性结合。结论制备的抗P38杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的McAb。

猪鼻支原体单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

作者用提纯的猪鼻支原体抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞,在PEG1000作用下,与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag14融合,共获得5株稳定分泌抗猪鼻支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。制备了小鼠腹水抗体,并对杂交瘤细胞株行进了鉴定。上述细胞株经3～6个月稳定传代,冻存于液氮中,复苏后其分泌抗体的水平未见下降。

基因重组制备鼠/人嵌合McAb研究进展

利用淋巴细胞杂交瘤技术建立分泌特异性McAb杂交瘤细胞系,从中提取已重排的编码功能性Ig DNA 基因组(组建DNA文库)或成熟的IgH,L链mRNA片段(组建cDNA文库及制备探针),从而获得编码特异性McAb的V区基因。利用基因重组技术,将此来源于小鼠特异性IgH、L链的V区基因分别与编码人IgH、L链的C区基因相重组,构成鼠/人嵌合的Ig重组基因。然后将此重组嵌合Ig基因导入真核表达质粒(多为pSV2-ypt和pSV2-neo)_4经磷酸钙沉淀技术,原生质体融合技术或电穿孔导入技术(以后2种方法较为实用且转化频率较高),将此质粒转染哺乳动物非分泌型骨髓瘤细胞如Sp2/0等,经选择性培养基培养,从中筛选分必完整功能性的鼠/人嵌合McAb。将此cMcAb临床应用于人体内进行诊断和治疗时,具有原鼠亲本McAb特异性结合抗原的能力,同时还具备优于亲本鼠McAb的介导补体,细胞对靶抗原的杀伤和吞噬作用。而且不引起过敏反应或干扰治疗效果。从而给临床诊断,治疗恶性肿瘤。病毒,细菌等感染提供了一种新颖的免疫治疗试剂、本文对近年来鼠/人嵌合McAb的研究进展,基本技术及原理,优越性及不足之处作了简要阐述,并认为制备嵌合McAb是今后制备并取代人McAb研制及应用的一种发展趋向。

抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步应用

用提纯的猪流行性腹泻病毒抗原免疫BALB/c小鼠,脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合,用酶联免疫吸附试验(ELISA)间接法筛选,以有限稀释法克隆化,阳性率达100％,建立了1D_8、5D_7、4B_1、2B_8、1A_4五株杂交瘤细胞系。用ELISA检测培养上清及诱生的腹水的效价。培养上清效价为1D_8 1∶1280~×、5D_7 1∶640~×、4B_1 1∶320~×、2B_8 1∶320~×、1A_4 1∶640~×,腹水效价为1D_8 10^(-7)、5D_7 10^(-7)、4B_110^(-7)、2B_8 10^(-5)、1A_4 10^(-4)。用免疫双扩散试验结果,五株单抗中有一株属IgG类,四株属IgG类。将单抗提纯后用ELISA夹心间接法及间接免疫荧光试验(IFA)对6种冠状病毒进行了特异性鉴定,除猪流行腹泻病毒外,不与其它冠状病毒发生交叉反应。取效价高而稳定的1D_8、5D_7、4B_1细胞系单克隆抗体做IFA及直接ELISA试验初步证明该McAb具有敏感性高,特异性强的优点,可作为猪流行性腹泻病毒检测的一种新试剂。

抗H9亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及初步鉴定

利用纯化的H9N2亚型禽流感尿囊液病毒免疫原免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,用间接ELISA方法检测培养上清是否对H5N1亚型AIV及NDV反应,筛选只针对H9N2亚型AIV的阳性细胞株,经克隆获得1株较高亲和力的杂交瘤细胞株,命名为4E7,用其制备的腹水ELISA效价达到2×105,Western-blotting证明单抗4E7经鉴定为针对75KD血凝素的单抗,HI效价为1:27,且不与新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、传染性脑脊髓炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、H5N1亚型禽流感病毒发生交叉反应,具有较好的特异性。IgG亚型为IgG1。

抗重组SARS病毒N蛋白单克隆抗体制备及性质初步研究

目的:制备抗重组SARS病毒N蛋白单克隆抗体。方法:重组SARS病毒N蛋白免疫BALB/c雌性小鼠获得免疫脾细胞,利用杂交瘤技术将免疫脾细胞同骨髓瘤Sp2 /0细胞融合,间接ELISA方法筛选阳性克隆并扩增。结果:获得了能稳定分泌抗重组SARS病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,经鉴定分泌的抗体IgG亚类为IgM。结论:制备了鼠源性单克隆抗体并初步研究了该抗体性质。