人鼠嵌合抗体重链基因转染小鼠骨髓瘤细胞的初步研究

本文介绍了通过人鼠嵌合抗体重链基因转染小鼠骨髓瘤J558L的研究,较详尽地阐述了用原生质体融合法将重组的人鼠嵌合抗体重链基因转染到S558L骨髓瘤细胞中,并用ELISA法检测转染子的过程和方法。同时简要地说明了影响转染率的一些因素。

抗乳腺癌人鼠嵌合抗体的构建

目的 :构建抗人乳腺癌单克隆抗体人鼠嵌合抗体 ,降低鼠源性抗体应用于人体的免疫排斥反应。方法 :采用 RT- PCR技术 ,从分泌抗人乳腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株 CDI 315 B分离克隆抗体轻重链可变区基因 ,对其进行序列分析。将连接组建人鼠嵌合轻链和人鼠嵌合重链 ,然后分别将它们克隆到真核细胞表达载体 pc DNA3。结果 :构建的人鼠嵌合抗体基因克隆在真核细胞表达载体上。结论

NBS法标记CEA人鼠嵌合抗体rch24的初步研究

目的:研究125I直接标记CEA人鼠嵌合抗体rch24的方法。方法:采用NBS(溴代琥珀酰亚胺)法进行碘标,并测定标记物的放射化学纯度、标记率和体外稳定性。结果:采用纸层析法测定的标记率和放射化学纯度分别为97.2%±0.4%和95.5%±0.2%;标记抗体体外4℃存放,放射化学纯度逐渐下降,14天后降为92.6%,35天后为89.3%。结论:标记物具有较高的放射化学纯度及稳定性,为体内治疗打下良好的基础。

免疫球蛋白变区基因的体外扩增及人－鼠嵌合抗体的表达

应用聚合酶链反应法体外扩增抗人小细胞肺癌单克隆抗体的变区基因，经核苷酸序列分析，轻链变区基因为３２４ｂｐ，编码１０８个氨基酸；重链变区基因为３５１ｂｐ，编码１１７个氨基酸。将重链变区基因克隆至ｐＳＶ_２△ＨｇｐｔＨｕγ_３质粒，经一系列克隆、筛选，得一插入方向正确的表达人－鼠嵌合重链抗体的载体－ｐＳＶ_２△Ｈｇｐｔ２Ｆ７ＶＨＨｕγ_３。用电穿孔方法将该质粒导入鼠源骨髓瘤细胞Ｊ５５８Ｌ，用霉酚酸进行初步筛选，最终用兔抗人免疫球蛋白ＩｇＧＦｃ片段的抗体筛选得七株阳性克隆，免疫印迹法结果表明在与人ＩｇＧ相同位置上有一阳性条带。

射频消融术联合瘤内注射^(131)I-肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体治疗肺癌的近期疗效评估

目的观察射频消融术联合瘤内注射131I-肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体(131I-chTNT)治疗肺癌的近期疗效。方法对32例肺癌患者采用射频消融联合131I-chTNT瘤内注射。结果治疗后有效率56.25%,其中完全缓解3例,部分缓解15例,无变化8例,进展6例。结论该治疗方法疗效满意,是一种疗效可靠、安全、并发症少的治疗技术。

人鼠嵌合单克隆抗体c30.6的纯化

采用介体电泳技术对CHO细胞培养液中的人鼠嵌合单克隆抗体c30 6进行纯化 ,第一步在pH8 6条件下进行 ,抗体带正电荷而培养液中的大部分杂质带负电荷 ,抗体和杂质在电场作用下向两电极运动 ,结果被分离在分离膜的两侧 ,SDS -PAGE显示抗体纯度达 95 % ,且剩余杂质的分子量均小于抗体的分子量。第二步是在pH6 0条件下进行 ,此时抗体和杂质都带正电荷 ,它们在电场作用下向同一方向运动 ,但分离膜只允许分子量较小的杂质通过 ,抗体得以进一步纯化 ,抗体的回收率为 80 % ,而且生物活性未受影响。

人鼠嵌合弓形虫免疫球蛋白M重组抗体制备及J链对其聚体形成的影响

目的体外制备人鼠嵌合弓形虫免疫球蛋白M(TOX-IgM)抗体,并验证加入J链对IgM抗体蛋白聚体、效价及稳定性的影响。方法从美国国家生物信息中心数据库获取抗体的重链可变区、轻链可变区以及J链序列,通过DNA重组技术分别将TOX抗体轻重链可变区和人源恒定区进行拼接,构建人鼠嵌合IgM表达载体,转染HEK 293F细胞进行表达。观察J链相关效应。结果J链有利于抗体聚体形成(聚体占比由11.3%提升至75.5%),抗体效价由1∶40提升至1∶160;在37℃热稳定性实验及反复冻融实验中,TOX-IgM(J+)稳定性与TOX-IgM(J-)相当。通过酶联免疫吸附试验鉴定蛋白活性,本实验成功制备人鼠嵌合TOX-IgM抗体,经聚丙烯酰胺凝胶电泳还原显示,重链大小约为75000,轻链大小约为25000,符合预期;效价、稳定性、基质效应均满足需求。结论在连接链J链(15000蛋白)存在下,IgM抗体更易形成五聚体,即5个IgM单体通过二硫键和J链彼此之间相互连接,且经评价效价和稳定性均有了明显提升。

注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体病毒去除/灭活工艺的建立及效果验证

旨在建立注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体病毒去除/灭活工艺,并进行效果验证。膜过滤工艺去除病毒验证结果表明,膜过滤后的蛋白质回收率在98%以上,分子排阻色谱纯度在膜过滤前后没有明显变化;经测试,膜过滤后小鼠白血病病毒、小鼠微小病毒、呼肠孤病毒滴度的降幅均大于4 lg TCID 50/0.1 mL。低pH值孵放灭活病毒验证工艺结果表明,低pH值孵放前后蛋白质含量、分子排阻色谱纯度没有明显变化;测试结果表明,室温处理时间≥0.5 h,小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒的滴度降幅均大于4 lg TCID 50/0.1 mL。该去除/灭活效果均符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求,建立的工艺有效保证了产品的质量及安全性。

重组抗人CD22嵌合抗体SM03的^(125)I标记及生物活性

为了探讨125I标记的重组抗人CD22嵌合抗体SM03的生物活性,采用Iodogen法进行单克隆抗体SM03的125I标记,Sephacryl S-300 HR色谱柱分离标记混合物,测定分离后样品的纯度与浓度。采用竞争结合法和酶联免疫吸附法(ELISA)测定纯化后样品的活性。抗体经过放射性标记后,放化纯度>99%,回收率>47%1。25I-SM03的生物活性与未标记抗体差异没有显著性,P=0.907。用125I-SM03筛选CD22抗原表达量最多的细胞,在Raji、Daudi和Ramos细胞中,SM03与Ramos细胞的特异性结合量最多,每个细胞的结合量为1.3 pmol。以上结果表明,Indogen法可以用于单克隆抗体SM03的标记,标记后不影响SM03的生物活性。

铜绿假单胞菌VgrG1a蛋白的原核表达及其人鼠嵌合型单抗的制备与鉴定

目的探究铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌系统缬氨酸甘氨酸重复蛋白G1a(VgrG1a)的原核表达方法,并制备其鼠源性和人鼠嵌合型单克隆抗体,为抗铜绿假单胞菌感染的诊断和治疗提供基础。方法根据NCBI网站上查找到的VgrG1a序列构建重组质粒pET-21a-VgrG1a,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)plysS进行诱导。通过免疫沉淀法和酶联免疫吸附实验(ELISA)对诱导得到的重组蛋白进行表达、纯化和鉴定。用纯化后的VgrG1a重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠源多克隆抗体,并利用ELISA方法测定小鼠血清抗体的效价和特异性。通过P3X63Ag8.653骨髓瘤细胞融合小鼠脾细胞制备杂交瘤细胞,再通过有限稀释法获得单克隆细胞。经多次ELISA筛选出能够稳定表达特异性抗体的细胞株。测序后获得单克隆抗体的序列信息,并构建人鼠嵌合基因,设计出含有此嵌合基因抗体的质粒,转染Expi293细胞,制备人源化单克隆抗体。结果实验成功构建了VgrG1a重组质粒,经探索在最佳表达诱导条件下[16℃下使用0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导16 h],表达得到了重组蛋白VgrG1a。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,相对分子质量72000处重组蛋白浓度最高。检测制备的鼠源抗体在稀释到1/640000后效价仍较高,并且与目的蛋白能特异性地识别并结合。人鼠嵌合型单克隆抗体8A4F5对抗原VgrG1a亲和力高于鼠源单克隆抗体。结论该原核表达的重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的重组蛋白制备的单克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究蛋白的结构与功能、研制相关的诊断试剂及疫苗提供了生物材料。

HEV保护性基因工程抗体的制备及功能研究

目的:制备抗戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)的人鼠嵌合基因工程抗体并研究其中和保护作用及特性。方法:将已获得的抗HEV鼠源单克隆抗体基因序列进行优化,设计人鼠嵌合的工程化抗体基因序列,将其克隆入真核表达载体;表达载体共转染293F细胞进行表达优化,高效制备基因工程化抗体;通过酶联免疫反应(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫荧光及HEV细胞感染模型,研究工程化抗体的结合能力及中和活性。结果:成功构建基因工程化人鼠嵌合HEV保护性抗体表达载体,在293F表达系统中实现高效表达。抗体表达产率达30 mg/L,亲和力为1.202×10^-8mol/L。免疫荧光检测结果显示抗体能够灵敏、特异地与已感染HEV的Kernow细胞结合,实时荧光定量PCR检测结果显示抗体可保护易感的C3A细胞不被HEV感染。结论:基因工程化抗体抗体具有高效的HEV结合能力及中和作用,能有效阻断HEV感染,并实现低成本高效表达。

HSV-IgM人-鼠嵌合抗体制备及稳定细胞株构建工艺开发

为实现体外大规模制备单纯疱疹病毒HSV-IgM(HSV1,HSV2)人鼠嵌合抗体,本研究通过RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends,RLM-RACE)技术获取其对应杂交瘤细胞基因序列,构建嵌合抗体至真核表达载体,在CHO-S细胞中稳定表达所需目的蛋白。同时优化稳定细胞株筛选工艺,对细胞池构建阶段和单克隆筛选阶段的加压条件进行摸索与探究,最后目的抗体采用蛋白L亲和纯化法进行纯化并进行生物活性检测;最终成功制备899 kDa和909 kDa的稳定高表达重组IgM抗体(HSV1,HSV2)细胞株。结果表明,最适筛选压力为20P200M(一轮加压)和50P1000M(二轮加压);使用加压培养基进行单克隆筛选抗体表达量较高,HSV1-IgM和HSV2-IgM单克隆最终表达量分别为1620 mg/L和623 mg/L。本研究为HSV1和HSV2的IgM系列重组抗体质控品开发以及体外高表达分泌IgM亚型抗体提供理论与实践基础。

抗埃博拉病毒核蛋白NP人-鼠嵌合抗体的研究

埃博拉病毒感染致死率最高可达90%,属烈性传染病,检测诊断对于疫情控制就显得异常重要。目前我国实验室通过实时定量荧光PCR检测埃博拉病毒核酸进行确诊,但耗时相对较长,对检测的人员和仪器要求较高。ELISA法检测血清是病原学诊断的主要指标,该种检测方法简单易操作,能够有效判断患者是否感染埃博拉以及感染程度,可用于流行病学调查,血清学指标的检测可以作为核酸检测的有力补充。由于埃博拉出血热在我国境内尚无病例出现,尤其需要储备血清学检测阳性质控物。通过基因工程抗体技术构建并表达抗埃博拉病毒核蛋白NP人-鼠嵌合抗体,为埃博拉出血热血清学检测做人源阳性对照储备。采用RT-PCR技术,从分泌抗埃博拉核蛋白单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞株中分离克隆抗体轻重链可变区基因,对其进行序列分析。根据序列分析的结果,设计特异性引物将鼠源抗体可变区基因VH、VL分别克隆至携带有人抗体轻重链恒定区基因的真核表达载体HL51-14,瞬时转染293T细胞,表达并纯化获得人鼠嵌合IgG抗体,随后对其进行了免疫学检测和功能鉴定。结果表明正确构建抗埃博拉病毒核蛋白人鼠嵌合抗体真核表达载体,成功表达并纯化获得两株人鼠嵌合单抗。

重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体在类风湿关节炎患者体内药动学研究

目的:研究连续静脉滴注重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体(anti-TNF rcMAb)在类风湿关节炎患者体内的药动学。方法:按GCP指导原则设计试验方案,选择9例类风湿关节炎患者,年龄(41±16)岁,在2h内匀速静脉滴注anti-TNF rcMAb,每次3mg·kg-1,共给药5次,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定人血清中各点anti-TNF rcMAb浓度。采用DAS2.1.1软件进行数据处理,计算药动学参数。结果:受试者多次静脉滴注anti-TNF rcMAb,按非房室模型计算,主要药动学参数t1/2为(9.2±1.8)d,Cssmax为(0.008±0.001)mg·L-1,Tssmax为(0.092±0.018)d,AUCss为(248±38)mg.d.L-1,Vss为(0.10±0.08)L·kg-1,DF为(5.5±0.6)。受试者在给药期间未出现严重不良反应。结论:本研究在给药后第3次时血药浓度可达到稳态,连续给药5次后体内未见蓄积,该方案适宜在临床推广使用。建议临床按此方案用药时,使用时间不宜过长,以减少药物不良反应。

重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体N糖谱的定性及定量分析

临床上,单克隆抗体用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病,是近年生物制药行业最热门的研究领域之一[1-2]。重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体是一种特异性靶向淋巴细胞表面CD20抗原的抗体,可与CD20抗原发生结合,激发机体免疫反应,可致表面表达CD20抗原的B-淋巴细胞的溶解和被杀伤。

重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体对类风湿关节炎患者RANK／RANKL／骨保护素系统的影响

目的探讨重组抗肿瘤坏死因子（TNF）-α人鼠嵌合单克隆抗体（Infliximab）对类风湿关节炎（RA）患者外周血核因子KB受体因子（RANK）／核因子KB受体活化因子（RANKL）屑保护素系统的影响。方法50例经严格筛选的类风湿关节炎（RA）患者按随机分配原则分为2组。一组患者接受Infiiximab（3mg／kg）±甲氨蝶呤治疗；一组患者接受甲氨蝶呤单独治疗作为对照，分别于0、2、6、14周给药。观察0周与18周Infliximab治疗组与对照组患者相关临床指标的改变，对比外周血中RANK、RANKLmRNA表达情况以及血清中骨保护素蛋白水平的变化。用t检验和矿检验做统计学分析。结果经Infliximab治疗后，在RA患者关节放射成像中，可以观察到骨破坏程度有减缓趋势。与对照组比较，Infliximab治疗组（病史〉1年）患者骨丢失情况得到控制；Infliximab治疗组（0周：80．25；18周：63．2）与对照组（0周：83．37；18周：30．87）患者外周血中RANK、RANKLmRNA表达水平均下降（P〉O．05）；与对照组比较，Infliximab可使RA患者外周血骨保护素/RANKL比值下降趋势减缓。虽然，经甲氨蝶呤或Infliximab±甲氨蝶呤治疗后，对照组[0周：（238±15）pg／ml；18周：（118±10）pg／ml]和Infliximab治疗组[0周：（223±6）pg／ml；18周：（162±6）pg／m]）]患者血清中骨保护素水平均下降（P〉0．05），但Infliximab治疗组患者血清骨保护素下降趋势得以减缓。结论RA患者经Inniximab联合甲氨蝶呤治疗后，骨破坏受到抑制，其作用机制可能是部分通过对RANK／RANKL／骨保护素系统的调节来行使的。

重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体对类风湿关节炎患者的疗效及其Th细胞亚群的影响

目的研究重组抗肿瘤坏死因子-α（TNF-α）人鼠嵌合单克隆抗体（anti—TNF rcMAb）对类风湿关节炎（RA）患者治疗效果及对患者外周血Th1、Th17、调节性T细胞影响。方法50例经严格筛选的RA患者按随机分配原则分为2组。联合治疗组（40例），给予anti-TNF rcMAb（3mg／kg）＋甲氨蝶呤治疗；对照组（10例）单独接受甲氨蝶呤治疗，分别于0、2、6、14周给药，于0、18周分别观察联合治疗组与对照组的相关临床指标的变化，在相应观察点做ACR20、50、70评分。同时，对比外周血中Th1、Th17、调节性T细胞的表达情况及相关转录因子T-bet、维甲酸相关孤核受体（ROR）C、叉头状转录因子3（Foxp3）的mRNA表达水平变化。采用t检验和χ^2检验或Ridit作统计学分析。结果治疗前后，联合治疗组ACR20、50、70较对照组均有所改善，尤其ACR20改善程度与对照组相比，差异有统计学意义（Z=1．671，P=0．00094）。联合治疗组患者外周血Th17细胞无显著变化[（0周（1．1±0．6）％；18周（1．1±0．3）％]、Th1细胞比例降低[0周（7．1±3．9）％；18周（4．2±2．8）％]，调节性T细胞比例明显升高[0周（91．5±0．8）％；18周（3．0±0．6）％，t=2．301，P=0．048]；对照组Th1比例下降[0周（9．1±3．1）％；18周（5．8±2．6）％]，调节性T细胞比例略升高[0周（1．2±0．6％）；18周（2．2±0．6）％]。2组Th17、Th1细胞的转录因子RORC、T-bet mRNA表达水平降低，调节性T细胞转录因子Foxp3的表达水平均升高。结论anti-TNF rcMAb联合甲氨蝶呤治疗对RA患者疗效显著，可能通过影响患者外周血Th细胞亚群发挥其治疗作用。

两种重组抗表皮生长因子受体人鼠嵌合单克隆抗体临床前安全性相似性评价

目的比较国产抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)人鼠嵌合单克隆抗体CDP1与进口抗EGFR单抗(以下简称进口单抗)临床前安全性的相似性。方法将50只食蟹猴随机分为溶媒对照组、CDP1低剂量组(5 mg/kg)、中剂量组(50 mg/kg)、高剂量组(100 mg/kg)和进口单抗对照组(50 mg/kg),每组10只,雌雄各半。每周静脉给药1次,共5次,恢复期6周。定期对动物进行一般观察,监测体重、摄食量、体温、眼检、尿检、血液生化和血液学指标,并检测心电图、血压、呼吸等安全药理学指标,于给药后不同时间点进行血样采集,进行毒代动力学和血清抗药抗体(anti-drug antibody,ADA)分析,给药结束后和恢复期末进行大体解剖和组织病理学检查。结果CDP1(5～100 mg/kg)连续5周给药,CDP1各剂量组均耐受良好,无明显可见毒性剂量为5 mg/kg,毒性剂量为50 mg/kg;CDP1和进口单抗毒性靶器官(靶部位)毒性反应和组织病理学变化相似,毒性靶器官均为消化系统(肝脏、胃肠道)、血液系统(红细胞、白细胞)和皮肤,毒性作用可逆或部分有可逆趋势,皮肤和胃肠道毒性与药物作用机制有关;CDP1中剂量组和进口单抗对照组主要毒代参数差异无统计学意义(P> 0. 05);ADA发生率相同。结论 CDP1不同剂量组均耐受良好,同等剂量下,CDP1和进口单抗在临床前安全性相似,为该药作为生物类似药进行临床试验提供了初步的安全性数据。

食蟹猴静脉注射重组人鼠嵌合抗EGFR单克隆抗体AV02重复给药毒性研究

目的:评价食蟹猴静脉重复注射重组人鼠嵌合抗EGFR单克隆抗体AV02的安全性,为临床设计人用剂量及临床毒副反应的监测提供参考依据。方法:将食蟹猴随机分为4组,分别为溶媒对照组、AV02低、中和高(12/7.5,38/24,120/75 mg·kg^(-1))剂量组,每组8只,雌雄各半。静脉注射给药,每周1次,连续26周,恢复12周,进行各项毒理学指标检测。结果:AV02多次静脉给药,临床观察可见各剂量组动物皮肤均出现皮疹、干燥粗糙、红斑、脱屑、龟裂、脱毛等反应,病理组织学检查也出现相应的皮肤损伤。中、高剂量组在给药期13,26周可引起ALB,A/G降低,ALT,γ-GT,GLDH升高,恢复期可恢复;并可引起肾脏脏器重量和脏器系数高于对照组。免疫原性检查中,低剂量组有1例动物检出抗药性抗体。除上述反应外,摄食量、体重、体温、血液学、免疫球蛋白、心电图、血压、尿液分析、骨髓、眼科检查均未见与受试物相关的改变。结论:食蟹猴连续静脉注射AV02 26周,主要毒性反应为与药理作用相关的皮肤毒性、可逆性的肝脏功能性损伤、代偿性肾脏增大及发生率极低的免疫原性反应,提示临床试验时应密切关注上述指标的变化。这些研究结果为国产重组人鼠嵌合抗EGFR单克隆抗体进入临床试验奠定了基础。

微波消融序贯^(131)I-chTNT放射免疫法治疗肺癌的疗效及其对患者生存质量的影响

目的探讨微波消融序贯131I-肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体(131I-chTNT)放射免疫法治疗非小细胞肺癌的疗效及其对患者生存质量的影响。方法将61例非小细胞肺癌患者随机分为两组,A组(32例)为外科手术治疗后放化疗,B组(29例)为微波消融联合131I-chTNT放射免疫治疗后化疗。对两组患者进行临床疗效比较和生存质量评定。结果治疗后6个月,A组局部病灶控制率为84.4%,B组为89.7%,两组相比,P<0.05;两组不良反应发生率相近(P>0.05)。治疗后6个月,两组患者生存质量评分均优于治疗前,其中B组的认知、情绪、社会功能量表及疼痛、呼吸困难症状量表评分结果与A组相比,P均<0.05。结论微波消融序贯131I-chTNT放射免疫法治疗肺癌安全、有效,能明显提高肺癌患者生存质量。