基于Met/PI3K/Akt信号通路研究五味子甲素对人鼻咽癌细胞HONE-1增殖、迁移和侵袭的影响

目的:研究五味子甲素对人鼻咽癌细胞HONE-1增殖、迁移和侵袭的影响及其可能机制。方法:以HONE-1细胞为研究模型,使用不同浓度[0(空白对照)、10、20、40μmol/L]的五味子甲素处理后,分别采用CCK-8试验、划痕试验和Transwell小室试验检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力变化;通过计算机分子对接分析五味子甲素与酪氨酸蛋白激酶(Met)蛋白的结合能力;采用Western blotting法检测细胞中磷酸化酪氨酸蛋白激酶(p-Met)、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)的相对表达量。结果:与空白对照比较,10、20、40μmol/L五味子甲素处理后细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著减弱(P<0.05);分子对接结果显示,五味子甲素能与Met蛋白的活性口袋稳定结合;Western blotting试验结果显示,与空白对照比较,10、20、40μmol/L五味子甲素处理后细胞中p-Met、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2和N-cadherin蛋白的相对表达量均显著降低(P<0.05)。结论:五味子甲素可通过抑制Met/PI3K/Akt信号通路的活化来抑制HONE-1细胞的增殖、迁移和侵袭。

循环肿瘤细胞PD-L1表达对鼻咽癌患者的预后价值评估

目的探讨循环肿瘤细胞(CTC)上细胞程序性死亡配体1(PD-L1)表达对鼻咽癌患者预后的意义。方法收集2021年6月10日—2023年7月10日经病理学确诊的鼻咽癌患者59例,检测患者外周血CTC和PD-L1的表达情况。分析CTC和PD-L1+CTC与鼻咽癌患者临床病理特征的相关性;评估CTC和PD-L1+CTC检测对鼻咽癌患者预后的临床诊断价值。结果59例患者的CTC检出率为76.3%(45/59),检出数量为(1.4±1.1)个。不同M分期,CTC检出数量的差别有统计学意义(P=0.026)。PD-L1+CTC的检出率为35.6%(21/59),检出数量为(0.4±0.7)个。鼻咽癌患者的2 a疾病进展率为8.5%(5/59),PD-L1+CTC患者相较于PD-L1-CTC患者具有更低的无进展生存率(PFS)和总生存率(OS),差别均有统计学意义(P=0.016,P=0.012)。Cox回归分析显示,PD-L1+CTC是鼻咽癌患者PFS(HR=9.244,95%CI:1.030~82.991,P=0.047)和OS(HR=190.642,95%CI:1.389~341.562,P=0.023)的预后影响因素。结论PD-L1+CTC是鼻咽癌患者PFS和OS的预后影响因素,CTC和PD-L1检测可能辅助鼻咽癌患者的预后评估。

DDX6通过调控CKMT1A mRNA稳定性促进鼻咽癌细胞增殖和迁移的机制研究

背景与目的:DDX是一类腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)依赖的RNA解旋酶,与mRNA调控、肿瘤增殖及侵袭等密切相关。本研究旨在探讨DDX家族成员DDX6对CKMT1A mRNA稳定性的影响以及DDX6-CKMT1A轴对人鼻咽癌细胞CNE2增殖和迁移能力的影响及其分子机制。方法:检索癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中DDX6和CKMT1A在人头颈部鳞状细胞癌中的表达情况并进行相关性分析,利用蛋白质印迹法(Western blot)检测南通大学附属医院保存的人体鼻咽癌组织和正常鼻咽部组织中CKMT1A和DDX6的表达,本研究通过了南通大学附属医院伦理委员会的审查(编号:2022-L114)。利用transwell实验检测细胞迁移能力,采用EdU试剂盒检测细胞增殖能力,采用细胞集落形成实验检测克隆形成能力。转染慢病毒、质粒,构建南通大学附属医院保存的人源鼻咽癌细胞CNE2的shDDX6、sh-CKMT1A、sh-CKMT1A+sh-DDX6和oe-CKMT1A细胞模型,明确DDX6和CKMT1A表达水平对鼻咽癌细胞恶性生物学表型的影响。构建BALC/c裸小鼠皮下移植瘤模型,检测DDX6和CKMT1A在小鼠体内对鼻咽癌细胞成瘤性的影响。采用RNA稳定性实验检测敲除DDX6对CKMT1A mRNA的影响,进一步明确DDX6的分子机制。结果:人鼻咽癌组织中DDX6高表达,CKMT1A低表达,DDX6与CKMT1A表达呈负相关。DDX6通过破环CKMT1A mRNA稳定性,抑制CKMT1A蛋白质翻译。在CNE2细胞中,CKMT1A低表达可增强细胞迁移和增殖能力,高表达则抑制细胞迁移和增殖能力,而DDX6的敲除可逆转CKMT1A下调导致的恶性行为进展。在裸鼠皮下移植瘤模型中,低表达CKMT1A促进肿瘤细胞生长,低表达DDX6抑制肿瘤细胞生长,而同时敲除DDX6与CKMT1A能恢复单独敲低DDX6导致的抑制效果。结论:鼻咽癌细胞中DDX6通过破坏CKMT1A mRNA稳定性,负调控CKMT1A蛋白质翻译,增强鼻咽癌细胞增殖和迁移能力,从而促进鼻咽癌恶性进展。

益气解毒方通过TGF-β1/SMAD3信号通路抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的研究益气解毒方对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并从转化生长因子β1(TGF-β1)/SMAD3信号通路探讨其对增殖、迁移和侵袭的作用机制。方法(1)将鼻咽癌细胞分为4组:溶剂对照组、益气解毒方0.5 mg·mL^(-1)组、益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)2μg·mL^(-1)组,采用实时无标记细胞功能分析仪(real time cellular analysis technology,RTCA)监测细胞增殖;创伤愈合实验检测细胞迁移;药物干预24 h后,侵袭小室法检测细胞侵袭;Western Blot法检测细胞β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、TGF-β1、SMAD3蛋白的表达水平。(2)将鼻咽癌细胞分为5组:溶剂对照组、TGF-β110 ng·mL^(-1)组、TGF-β110 ng·mL^(-1)+益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、LY320088210μmol·L-1组,采用实时无标记细胞功能分析仪监测细胞增殖;创伤愈合实验检测细胞迁移;药物干预24 h后,侵袭小室法检测细胞侵袭;Western Blot法检测细胞β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、TGF-β1、SMAD3蛋白的表达水平。(3)随机将裸鼠分为模型组、益气解毒方组和5-Fu组。皮下部位注射细胞悬液制备鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,基本成瘤后,5-Fu组每2 d腹腔注射1次,其余组每天灌胃给药1次,连续3周。每隔3 d测量瘤体体积1次;Western Blot法检测各组组织中β-catenin、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达水平。结果与溶剂对照组比较,益气解毒方(0.5、1.0 mg·mL^(-1))组的细胞增殖曲线均下降,细胞迁移和侵袭能力均降低(P<0.05,P<0.01),且E-cadherin蛋白表达明显升高(P<0.01),β-catenin、N-cadherin、TGF-β1、SMAD3蛋白表达均明显降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,益气解毒方组的鼻咽癌移植瘤体积明显减小(P<0.05),且益气解毒方组移植瘤组织中的β-catenin和N-cadherin蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01),E-cadherin蛋白表达明显上调(P<0.01)。加入TGF-β1信号通路激活剂和抑制剂后,与益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组比较,TGF-β110 ng·mL^(-1)+益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组的TGF-β1、SMAD3、β-catenin和N-cadherin蛋白表达水平均明显升高(P<0.05,P<0.01),且细胞增殖、迁移和侵袭的能力明显增强(P<0.01)。结论益气解毒方能够通过调控TGF-β1/SMAD3信号通路抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

LncRNA HCG18影响鼻咽癌细胞PD-L1表达及CD8^(+)T细胞的杀伤功能研究

目的:探究LncRNA HCG18调控CD8^(+)T细胞抗鼻咽癌细胞的功能及机制。方法:qRT-PCR检测鼻咽癌组织及癌旁组织HCG18表达以及人鼻黏膜上皮细胞HNEpC和人鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、HONE-1、HNE-2中HCG18表达。CNE1细胞分为si-HCG18组、si-NC组、si-HCG18^(+)PD-L1组,HNE-2细胞分为HCG18组、Vector组和HCG18^(+)sh-PD-L1组,上述各组CNE1细胞和HNE-2细胞分别与CD8^(+)T细胞共孵育24h(si-HCG18^(+)CD8^(+)T组、si-NC+CD8^(+)T组、si-HCG18^(+)PD-L1+CD8^(+)T组、HCG18^(+)CD8^(+)T组、Vector+CD8^(+)T组和HCG18^(+)sh-PD-L1+CD8^(+)T组),酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测共孵育体系中INF-γ、TNF-α、IL-2浓度,细胞毒性试剂盒检测肿瘤细胞裂解率。Western blot检测PD-L1蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证HCG18与miR-20b-5p的靶向关系,miR-20b-5p与PD-L1的靶向关系。结果:鼻咽癌组织中HCG18表达显著高于癌旁组织,CNE1、CNE2、HONE-1、HNE-2细胞中HCG18表达均显著高于HNEpC细胞(P<0.05)。si-HCG18组CNE1细胞中PD-L1表达显著低于si-NC组(P<0.05),HCG18组HNE-2细胞PD-L1表达显著高于Vector组(P<0.05),相比于si-NC+CD8^(+)T组,si-HCG18^(+)CD8^(+)T组共孵育体系中INF-γ、TNF-α、IL-2浓度显著增加(P<0.05),CNE1细胞裂解率显著增加(P<0.05),相比于si-HCG18^(+)CD8^(+)T组,si-HCG18^(+)PD-L1+CD8^(+)T组共孵育体系中INF-γ、TNF-α、IL-2浓度显著降低(P<0.05),CNE1细胞裂解率显著降低(P<0.05)。相比于Vector+CD8^(+)T组,HCG18^(+)CD8^(+)T组共孵育体系中INF-γ、TNF-α、IL-2浓度显著降低(P<0.05),HNE-2细胞裂解率显著降低(P<0.05),相比于HCG18^(+)CD8^(+)T组,HCG18^(+)sh-PD-L1+CD8^(+)T组共孵育体系中INF-γ、TNF-α、IL-2浓度显著增加(P<0.05),HNE-2细胞裂解率显著增加(P<0.05)。miR-20b-5p为HCG18靶基因,PD-L1为miR-20b-5p靶基因。结论:HCG18上调鼻咽癌细胞PD-L1表达并且抑制CD8^(+)T细胞的抗肿瘤活性。

lncRNA JPX对鼻咽癌细胞增殖、侵袭能力的调控作用及其机制

目的观察长链非编码RNA(lncRNA)JPX对鼻咽癌细胞增殖、侵袭能力的调控作用并探讨其机制。方法取鼻咽癌细胞系CNE-1、5-8F、6-10B、HONE-1、C666-1及鼻咽正常上皮细胞系NP69,采用RT-qPCR法检测细胞中lncRNA JPX表达,取lncRNA JPX表达最高的C666-1细胞作为研究细胞。C666-1细胞随机分为JPX降表达组、降表达对照组、JPX高表达组、高表达对照组,分别转染JPX沉默序列sh-JPX、阴性对照序列sh-NC及JPX过表达质粒pcDNA3.1-JPX、阴性对照质粒pcDNA 3.1-NC。采用MTT法观察细胞增殖能力,Transwell实验观察细胞侵袭能力。利用StarBase数据库对lncRNA JPX进行靶向miRNA及基因的预测,发现lncRNA JPX与miR-1265存在靶向结合位点、miR-1265与MAT1存在靶向结合位点;采用双荧光素酶实验对靶向关系进行验证显示,lncRNA JPX可与miR-1265靶向结合并对miR-1265表达具有抑制作用,miR-1265可与MAT1靶向结合并对MAT1表达具有抑制作用。进一步将C666-1细胞随机分为对照组、JPX降表达组、JPX降表达+miR-1265降表达组、JPX降表达+MAT1降表达组,分别转染NC对照序列、sh-JPX序列、sh-JPX+miR-1265 inhibitor序列、sh-JPX+si-MAT1序列。采用Western blotting法检测各组细胞MAT1蛋白表达、MTT法观察细胞增殖能力,Transwell实验观察细胞侵袭能力。结果细胞活力、侵袭细胞数JPX高表达组>高表达对照组、降表达对照组>JPX降表达组(P均<0.05)。MAT1蛋白表达、细胞活力及侵袭细胞数对照组、JPX降表达+miR-1265降表达组>JPX降表达组>JPX降表达+MAT1降表达组(P均<0.05)。结论lncRNA JPX可促进鼻咽癌细胞的增殖、侵袭,其机制可能与靶向调控miR-1265/MAT1轴有关。

lncRNA MSC-AS1通过调节miR-429/RhoA轴对人鼻咽癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

目的探索长链非编码RNA(lncRNA)MSC-AS1通过调节微小RNA(miR)-429/Ras同源基因家族成员A(RhoA)轴对人鼻咽癌(NPC)细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。方法实时荧光定量PCR法(qPCR)检测NPC细胞系(CNE-1、HNE2、HONE-1细胞)以及人鼻咽上皮细胞系NP69细胞中lncRNA MSC-AS1、miR-429、RhoA mRNA的表达水平。以CNE-1细胞为研究对象,将si-MSC-AS1、miR-429 inhibitor、miR-429 mimics及相应阴性对照分别转染或共转染CNE-1细胞,记为对照组(未转染)、si-NC组、si-MSC-AS1组、mimics NC组、miR-429 mimics组、si-MSC-AS1+inhibitor NC组、si-MSC-AS1+miR-429 inhibitor组。MTT法、流式细胞术、Transwell分别检测细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力;双荧光素酶实验分别验证miR-429与MSC-AS1、RhoA的靶向关系;免疫印迹法检测RhoA、B淋巴细胞因子相关x蛋白(Bax)、上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、细胞周期素D1(CyclinD1)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)的表达水平。结果miR-429分别与MSC-AS1、RhoA存在靶向关系。与NP69细胞相比,CNE-1、HNE2、HONE-1细胞中MSC-AS1、RhoA mRNA的表达水平显著增加,miR-429表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组、si-NC组相比,si-MSC-AS1组细胞增殖率、迁移和侵袭数、MSC-AS1、N-cadherin、RhoA、CyclinD1比较表达水平显著下降,细胞凋亡率、E-cadherin、Bax显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组、mimics NC组相比,miR-429 mimics组细胞增殖率、迁移和侵袭数、N-cadherin、RhoA、CyclinD1表达水平显著下降,细胞凋亡率、miR-429、E-cadherin、Bax显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);抑制miR-429表达水平可减弱干扰MSC-AS1对细胞恶性生物学行为的影响(P<0.05)。结论干扰MSC-AS1可以抑制NPC细胞增殖、侵袭及迁移,促进其凋亡,可能与miR-429/RhoA轴有关。

杨梅素调节JAK-STAT-IRF1信号通路对鼻咽癌细胞免疫逃逸的影响

目的探讨杨梅素对鼻咽癌细胞免疫逃逸的影响及对JAK-STAT-IRF1信号通路的调节作用。方法体外实验:培养人鼻咽癌CNE1细胞并分为对照组、杨梅素L组、杨梅素M组、杨梅素H组和杨梅素H+Broussonin E组,MTT法检测细胞增殖能力;Hoechst法检细胞凋亡;蛋白免疫印迹(Western blot)技术验证细胞叉头样转录因子3(Foxp3)、维甲酸相关孤核受体γt(RORγt)、磷酸化(p)-Janus激酶(JAK)1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-信号转导与转录激活子(STAT)1、STAT1、干扰素调节因子1(IRF1)蛋白表达。体内实验:建立BALB/c裸鼠鼻咽癌模型,随机分为模型组、杨梅素低剂量组、杨梅素中剂量组、杨梅素高剂量组和紫杉醇组,取瘤体并称重,流式细胞术检测巨噬细胞程序性死亡受体1配体(PD-L1)表达,Western blot法检测瘤体Foxp3、RORγt、p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1、IRF1蛋白表达。结果与对照组相比,杨梅素L、M、H组CNE1细胞增殖能力以及RORγt、p-JAK1/JAK1、p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1、IRF1蛋白表达降低,细胞凋亡率和Foxp3蛋白表达增加(P<0.05);与杨梅素H组相比,杨梅素H+Broussonin E组细胞增殖能力以及RORγt、p-JAK1/JAK1、p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1、IRF1蛋白表达升高,细胞凋亡率和Foxp3蛋白表达减少(P<0.05);与模型组对比,杨梅素低、中、高剂量组Foxp3蛋白表达增加,瘤体质量以及PD-L1、RORγt、p-JAK1/JAK1、p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1、IRF1蛋白表达减少(P<0.05)。结论杨梅素可能通过抑制JAK-STAT-IRF1信号通路的激活抑制鼻咽癌细胞免疫逃逸。

电离辐射对鼻咽癌中铁死亡驱动因子SOCS1与抑制因子FTH1表达水平的影响

目的 探索铁死亡驱动因子细胞因子信号转导抑制蛋白1(SOCS1)与抑制因子铁蛋白重链1(FTH1)在鼻咽癌中的表达水平及电离辐射对其的影响。方法 分析来自GEO数据库的鼻咽癌数据集GSE53819(18个鼻咽癌样本和18份鼻咽正常组织样本)和GSE12452(31个鼻咽癌样本和10份鼻咽正常组织样本)中SOCS1与FTH1的表达水平,并联合GSE62328(30个鼻咽癌样本)分析不同肿瘤分期、淋巴结转移状态与原发-复发类型中SOCS1和FTH1表达水平;利用GSE48501数据集中放射抵抗性鼻咽癌CNE2-IR细胞和放射敏感性鼻咽癌CNE2细胞中m RNA表达数据,分析SOCS1与FTH1在放射抵抗性和放射敏感性鼻咽癌细胞株中的表达水平;以经2 Gy电离辐射照射后的鼻咽癌C666-1细胞为实验组,0 Gy电离辐射照射的鼻咽癌C666-1细胞为对照组,应用RT-q PCR法分别检测其中SOCS1与FTH1的表达水平。结果 GEO数据库分析显示,鼻咽癌组织中SOCS1与FTH1表达水平高于正常鼻咽组织(P<0.05)。与伴淋巴结转移的鼻咽癌样本比较,无淋巴结转移的鼻咽癌样本中SOCS1与FTH1表达水平较高(P<0.05)。SOCS1与FTH1在放射抵抗性和放射敏感性鼻咽癌细胞株中的表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR结果提示,实验组C666-1细胞中SOCS1表达水平高于对照组,FTH1表达水平低于对照组(P<0.05)。结论 铁死亡驱动因子SOCS1与抑制因子FTH1在鼻咽癌中差异表达且可作为鼻咽癌放射治疗潜在靶点。

长链非编码RNA TUG1对鼻咽癌细胞生物学行为及放射敏感性的影响

目的对长链非编码RNA TUG1进行泛癌分析,并评估其对鼻咽癌生物学行为及放射敏感性的影响。方法基于TCGA数据库检测TUG1在泛癌中的表达情况和预后价值。用qPCR方法检测鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞系中TUG1的表达情况。用TUG1 siRNA或阴性对照siRNA转染鼻咽癌CNE-1和CNE-2细胞。采用MTS法、transwell实验和划痕实验检测鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。细胞克隆形成实验测定细胞放射敏感性。流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况。结果基于TCGA数据库的分析发现,在12种癌症类型中TUG1的表达上调。TUG1表达增加与多种癌症类型的较差预后相关。体外实验研究发现lncRNA TUG1在鼻咽癌细胞系和组织中也显著上调。TUG1高表达与TNM分期恶化有显著相关性。TUG1的高表达与鼻咽癌患者不良预后有显著相关性。下调TUG1的表达可抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭,促进鼻咽癌细胞凋亡,提高鼻咽癌细胞放射敏感性。结论TUG1在多种癌症类型中发挥重要作用,并与鼻咽癌的不良预后相关。TUG1可能作为鼻咽癌治疗的潜在治疗靶点。

miR-125b-2-3p表达对鼻咽癌细胞HNE1增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-125b-2-3p表达对鼻咽癌细胞HNE1增殖和凋亡的影响。方法荧光定量PCR检测miR-125b-2-3p在人永生化鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞中的表达。荧光定量PCR检测上调和下调miR-125b-2-3p表达转染效率。实验分为control组(未处理)、mimics NC组(Lip 2000+mimics NC)、miR-125b-2-3p mimics组(Lip 2000+miR-125b-2-3p mimics)、inhibitor NC组(Lip 2000+inhibitor NC)和miR-125b-2-3p inhibitor组(Lip 2000+miR-125b-2-3p inhibitor)。CCK-8实验、细胞集落形成实验和活细胞/死细胞双染色实验检测细胞增殖的情况;流式细胞术检测细胞凋亡情况;DAPI细胞核染色检测细胞核的形态变化;线粒体膜电位检测细胞早期凋亡情况。结果与人永生化鼻咽上皮细胞NP69相比,鼻咽癌细胞中miR-125b-2-3p的表达较高(P<0.05)。与control组和mimics NC组相比,miR-125b-2-3p mimics组miR-125b-2-3p表达上调(P<0.01);与control组和inhibitor NC组相比,miR-125b-2-3p inhibitor组miR-125b-2-3p表达下调(P<0.01)。与mimics NC组相比,miR-125b-2-3p mimics组细胞增殖能力较强(P<0.01),细胞凋亡能力较弱(P<0.01),线粒体膜电位较高(P<0.01);相较于inhibitor NC组,miR-125b-2-3p inhibitor组细胞增殖能力被抑制(P<0.01),细胞凋亡能力较强(P<0.01),核固缩核碎裂较多,线粒体膜电位较低(P<0.05)。结论下调miR-125b-2-3p能抑制鼻咽癌细胞HNE1的增殖,促进细胞的凋亡。

LMP-1、Bcl-2表达与鼻咽癌侵袭转移的相关性

目的分析鼻咽癌组织中潜伏膜蛋白(LMP)-1、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2基因与其侵袭转移的关系。方法选择120例NPC患者进行研究,使用鼻内镜采集病灶组织,采用免疫组织化学法检测组织中LMP-1、Bcl-2的表达,根据TNM分期评估NPC肿瘤侵袭和转移程度,分析LMP-1、Bcl-2与NPC侵袭和转移的关系。结果120例NPC患者中LMP-1阳性共86例,占71.67%,Bcl-2阳性共90例,占75.00%;LMP-1、Bcl-2阳性患者中EBV-DNA阳性占比居高,与LMP-1、Bcl-2阴性者相比,差异有统计学意义(P<0.05)。TNM不同分期患者LMP-1、Bcl-2阳性表达率相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。采用卡方Phi和Cramer's V系数检验发现,NPC组织中LMP-1、Bcl-2表达与肿瘤侵袭和转移均显著相关(P<0.05)。结论LMP-1、Bcl-2在NPC组织中阳性表达率普遍较高,且LMP-1、Bcl-2阳性表达与肿瘤侵袭和转移有关。

上调miR-34c-5p对鼻咽癌细胞HONE-1增殖和侵袭的影响

目的探讨上调mi R-34c-5p对鼻咽癌细胞HONE-1增殖和转移能力的影响。方法利用定量PCR分析mi R-34c-5p在鼻咽癌细胞株HONE-1和正常鼻咽细胞株NP69中的表达情况;利用克隆形成实验和Transwell实验分析上调mi R-34c-5p表达对mi R-34c-5p mimic转染组、mi R-34c-5p对照序列组和未处理组增殖和侵袭能力的影响。结果 mi R-34c-5p在鼻咽癌细胞株HONE-1的表达水平低于正常鼻咽细胞株NP69;mi R-34c-5p mimic转染组鼻咽癌细胞HONE-1的克隆形成和侵袭能力明显低于mi R-34c-5p对照序列组和未处理组(均P<0.05)。结论 mi R-34c-5p的下调与鼻咽癌的生物学功能增殖和侵袭能力相关,是鼻咽癌治疗的潜在靶点。

生物钟基因Per1对鼻咽癌细胞CNE2侵袭迁移及与JAK2-STAT3通路相关蛋白表达的影响

目的:探讨生物钟基因Per1对鼻咽癌细胞CNE2侵袭转移及上皮-间质转化(EMT)的影响,并阐述其与JAK2-STAT3信号通路相关蛋白的关系。方法:实时荧光定量PCR法(qPCR)以及蛋白质印迹法(WB)检测CNE2细胞中Per1基因及蛋白水平;构建Per1基因过表达及干扰慢病毒载体并转染CNE2细胞;实验分为过表达组(Per1-OE)、过表达对照组(Per1-OENC)、干扰组(Per1-sh)、干扰对照组(Per1-shNC);利用划痕愈合、Transwell实验检测Per1基因对各组细胞侵袭、迁移能力;WB检测Per1基因对EMT相关蛋白:E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达的影响;WB检测Per1基因对JAK2-STAT3信号通路相关蛋白表达的影响。结果:WB和PCR结果显示:与人永生化鼻咽上皮细胞NP69相比,Per1在鼻咽癌细胞CNE2中表达降低。通过构建Per1基因过表达及干扰慢病毒载体,有效地上调和下调了CNE2中Per1在转录及蛋白水平的表达,并分别成功筛选出稳转细胞株。划痕实验结果显示:Per1-OE组较Per1-OENC组24 h、48 h细胞迁移率均明显下降(P=0.04,P=0.01),Per1-sh组较Per1-shNC组24 h、48 h细胞迁移率均明显升高(P=0.01,P=0.005)。Transwell实验结果显示:Per1-sh组较Per1-shNC组穿过Transwell小室细胞数明显增加(P=0.02),Per1-OE组较Per1-OENC组穿过Transwell小室细胞数明显减少(P=0.001)。WB结果显示:JAK2、p-JAK2、STAT3蛋白在各组细胞中表达无统计学差异(P>0.05)。Per1-sh组较Per1-shNC组p-STAT3、N-cadherin、Vimentin的蛋白表达下降,E-cadherin表达升高(P<0.05),Per1-OE组较Per1-OENC组p-STAT3、N-cadherin、Vimentin的蛋白表达均升高,E-cadherin表达下降(P<0.05)。结论:过表达Per1基因后可抑制鼻咽癌细胞CNE2侵袭、迁移,使N-cadherin、Vimentin、p-STAT3蛋白表达下降,E-cadherin表达增加;干扰Per1基因后则相反,进而表明Per1基因在鼻咽癌细胞CNE2中可能扮演着抑癌基因的角色;同时我们推测Per1基因与p-STAT3的表达有一定的相关性,但其具体作用机制有待进一步研究。

敲低lncRNA LINC01296调节PD-L1抑制鼻咽癌细胞免疫逃逸的机制研究

目的研究敲低长链非编码RNA(lncRNA)LINC01296调节程序性死亡配体-1(PD-L1)抑制鼻咽癌细胞免疫逃逸的机制。方法分离培养人外周血淋巴细胞后与人鼻咽癌细胞CNE-2Z共培养,同时取C57BL/6小鼠皮下注射CNE-2Z细胞构建鼻咽癌移植瘤模型24只,均随机分为对照组、lncRNA LINC01296敲低组[转染lncRNA LINC01296小干扰RNA(siRNA)]、阴性对照组(转染lncRNA LINC01296 siRNA阴性对照和空载质粒)、lncRNA LINC01296敲低+PD-L1过表达组(转染lncRNA LINC01296 siRNA和PD-L1过表达质粒),分组转染后,流式细胞术检测人外周血淋巴细胞中活化CD8^(+)T细胞比例;细胞计数试剂盒-8法检测人外周血淋巴细胞对CNE-2Z细胞杀伤率;测量移植瘤小鼠肿瘤体积;免疫荧光染色检测移植瘤小鼠肿瘤组织CD8和PD-L1阳性表达;实时荧光PCR实验检测CNE-2Z细胞和肿瘤组织lncRNA LINC01296、PD-L1信使RNA(mRNA)表达;蛋白印迹实验检测CNE-2Z细胞和肿瘤组织PD-L1蛋白表达。结果与对照组相比,lncRNA LINC01296敲低组人外周血淋巴细胞中活化CD8^(+)T细胞比例及对CNE-2Z细胞杀伤率、肿瘤组织CD8阳性比例升高(P<0.05),肿瘤体积、CNE-2Z细胞和肿瘤组织PD-L1阳性比例、CD8和PD-L1双阳性比例、lncRNA LINC01296、PD-L1 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05);阴性对照组各指标无明显变化(P>0.05);过表达PD-L1可减弱敲低lncRNA LINC01296对CNE-2Z细胞和小鼠各指标的影响。结论敲低ln⁃cRNA LINC01296可通过下调PD-L1而促进CD8^(+)T细胞活化及浸润,减弱鼻咽癌细胞免疫逃逸,增强CD8^(+)T细胞对其杀伤力。

KAI1,Snail,Slug,E-cadherin在鼻咽癌组织中的表达及其与患者预后的关系

目的 探讨KAI1、Snail、Slug、上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)在鼻咽癌组织中的表达及其与患者预后的关系。方法 选取43例鼻咽癌患者,收集癌组织与癌旁正常组织,采用免疫组织化学法测定其KAI1、Snail、Slug、E-cadherin表达。分析四者与患者临床病理特征的关系;另随访3年,采用Kaplan-Meier法分析四者表达与鼻咽癌患者预后的关系。结果 癌组织中KAI1、E-cadherin阳性表达率低于癌旁组织,Snail、Slug阳性表达率高于癌旁组织,有统计学差异(P<0.05);KAI1、Snail、Slug、E-cadherin表达与鼻咽癌患者年龄、性别无关(P>0.05);KAI1、Snail、Slug、E-cadherin表达与肿瘤临床分期、分化程度、淋巴结转移有关(P<0.05);癌组织KAI1、E-cadherin阴性表达与Snail、Slug阳性表达患者的3年生存率低于KAI1、E-cadherin阳性表达与Snail、Slug阴性表达患者,有统计学差异(P<0.05)。结论 KAI1、E-cadherin在鼻咽癌组织内呈低表达,Snail、Slug呈高表达,四项指标均参与疾病的发生、发展,与患者预后相关。

鼻咽癌细胞中EB病毒编码的潜伏膜蛋白1活化cyclinD1的表达

为了探讨EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1(EBV LMP1)促进细胞增殖 ,参与EBV相关疾病致瘤的分子机制 ,研究了LMP1在鼻咽癌细胞中调节cyclinD1表达 ,进而影响细胞周期行进及细胞恶性表型改变 ,并初步确定了LMP1发挥该功能的结构域 .利用已建株的Tet on LMP1 HNE2鼻咽癌细胞系 ,蛋白质印迹实验分析LMP1诱导cyclinD1蛋白质表达的表达动力学 ,包括时间效应及剂量效应 ;利用三种LMP1功能区缺失的突变体及野生型LMP1,以载体型细胞为对照 ,确定LMP1活化cyclinD1表达的结构域 .同时结合基因诱导表达及反义寡聚核酸技术阻断基因表达的实验方法 ,进一步确定LMP1上调的cyclinD1功能 ,即对细胞周期行进及细胞恶性表型的影响 .结果表明LMP1确实可以诱导cyclinD1的表达 (2～ 4倍 ) ,且诱导具有时间依赖性及剂量依赖性 ;利用三种LMP1功能区缺失的突变体及野生型LMP1,以载体型细胞为对照 ,结合报道基因分析法 ,确定与空白载体细胞系比较 ,野生型LMP1从转录水平可反式激活cyclinD1报道基因活性约 11 2倍 ,其中CTAR1及CTAR2均可活化cyclinD1表达 ,但以CTAR2为主 ,与野生型LMP1诱导cyclinD1反式激活活性比较 ,CTAR1缺失导致cyclinD1报道基因活性下降 2 3 6 % ,CTAR2缺失导致cyclinD1活性下降约 80 7% ,C端均缺失时cyclinD1活性只?

细胞色素P450 2E1基因与鼻咽癌易感性分析

目的：为了探讨鼻咽癌的病因发病机理，进一步揭示鼻咽癌的易感因素，本文进行了细胞色素Ｐ４５０２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１） 基因多态性与鼻咽癌易感性关系的研究。方法：采用病例－ 对照分子流行病学方法分析１０５ 例鼻咽癌患者和９３ 例正常人体细胞ＣＹＰ２Ｅ１ 基因型。结果： 发现ＲｓａＩ和ＰｓｔＩ识别的ＣＹＰ２Ｅ１ 基因纯合子突变型（Ｃ２／Ｃ２） 在鼻咽癌人群为５－７ ％ ，显著高于正常人群（１－１％ ） 分布（χ２ ＝ ４－８６ ，Ｐ＜ ０－０５） ；携带Ｃ２／Ｃ２ 基因型个体发生鼻咽癌的危险性比携带其它基因型个体高５ 倍左右。结论：ＣＹＰ２Ｅ１ 基因的多态性可能是鼻咽癌易感的因素之一。

替拉扎明调节乏氧诱导鼻咽癌细胞HIF-1α和OPN mRNA的表达及其对放射增敏的作用

背景与目的:乏氧细胞毒性药物联合肿瘤放化疗是肿瘤治疗的一种重要途径,替拉扎明(tirapazamine,TPZ)是最受瞩目的乏氧细胞毒性药物之一,研究证实替拉扎明联合放疗作用于肿瘤细胞具有协同效应,但在乏氧条件下是否能下调乏氧诱导相关基因未见报道,因此本实验研究人鼻咽癌细胞HNE-1EB+和CNE-1EB-乏氧相关基因乏氧诱导因子1α(HIF-1α)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达差异以及TPZ的放射增敏作用。方法:在常氧和乏氧条件下,用MTT法测定TPZ对HNE-1和CNE-1细胞的生长抑制作用,计算出IC50;用RT-PCR测定TPZIC10作用24h后HNE-1和CNE-1细胞HIF-1α和OPN mRNAs的表达;以及用克隆形成法测定TPZ预作用6h和1～6Gy60Coγ射线照射后细胞的存活率,用单击多靶数学模型拟合剂量-生存曲线,计算出D0、Dq和放射增敏比(SER)。结果:TPZ对HNE-1和CNE-1细胞的IC50在常氧条件下分别为34.81μmol/L、35.02μmol/L,在乏氧条件下分别为30.20μmol/L和28.48μmol/L;TPZ能明显下调HNE-1细胞乏氧后HIF-1α和OPN的表达,对CNE-1HIF-1α和OPN的表达无明显作用;放射剂量-生存曲线符合单击多靶数学模型特征;HNE-1aero和HNE-1hypox的D0和Dq分别为0.89Gy、0.28Gy,1.47Gy和0.44Gy;HNE-1hypox/TPZ的D0和Dq分别为0.66Gy和0.21Gy;CNE-1aero和CNE-1hypox的D0和Dq分别为0.72Gy、0.68Gy,0.95Gy和0.56Gy;CNE-1hypox/TPZ的D0和Dq分别为0.85Gy和0.79Gy。结论:TPZ对HNE-1EB+细胞明显的放射增敏作用可能与其下调乏氧诱导的HIF-1α和OPN表达有关,以及具有乏氧修饰剂的作用。