茶多酚对鼻咽癌HNE-1及HNE-1(200)细胞株增殖抑制作用研究

目的研究天然有效成分茶多酚对鼻咽癌HNE-1及HNE-1(200)细胞株增殖的抑制作用。方法本研究以鼻咽癌HNE-1细胞株和HNE-1(200)耐药细胞株为研究对象,采用MTT法测定茶多酚对两组细胞的增殖抑制率。结果茶多酚对两组实验细胞均有抑制作用,且这种作用呈浓度依赖关系;茶多酚对两种细胞株的抑制率没有显著差别。结论茶多酚对鼻咽癌耐药细胞株和非耐药细胞株均有相似而明显的增殖抑制作用,这为茶多酚的进一步研究和应用打下了基础。

冬凌草甲素对鼻咽癌HNE-1细胞株生长及其PCNA、Caspase-3表达的影响

目的观察冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞株HNE-1生长及其细胞核抗原(PCNA)、Caspase-3表达的影响。方法 HNE-1中加入冬凌草甲素,MTT法观察其生长情况,FCM检测细胞周期,免疫细胞化学染色法检测PCNA,Western-blot技术检测Caspase-3。结果加入冬凌草甲素后HNE-1细胞生长受抑制,细胞被阻滞于G_0/G_1期;冬凌草甲素作用48 h后,HNE-1细胞的PCNA蛋白表达下调,Caspase-3蛋白表达增加。结论冬凌草甲素在体外可显著抑制人鼻咽癌细胞株HNE-1细胞生长并诱导其凋亡,其机制可能是下调PCNA蛋白表达,激活Caspase-3的活性。

茶多酚和粉防己碱联合抗肿瘤药物对鼻咽癌耐药细胞株HNE-1(200)增殖的抑制作用

目的研究天然有效成分茶多酚(TP)和粉防己碱(TET)分别联合4种常见抗肿瘤药物对鼻咽癌耐药细胞株HNE-1(200)增殖的抑制作用。方法以鼻咽癌耐药细胞株HNE-1(200)为研究对象,用MTT法测定无毒剂量的TP和TET分别联合顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、长春新碱(VCR)、阿霉素(ADM)对实验细胞的增殖抑制率。结果无毒剂量的TP分别与4种抗肿瘤药物联合应用后,药物对HNE-1(200)细胞的抑制率增加约200%;无毒剂量的TET分别与4种抗肿瘤药物联合应用后,药物对HNE-1(200)细胞的抑制率增加约300%。结论无毒浓度的天然药物TP、TET分别与抗肿瘤药物联合应用能提高药物对鼻咽癌耐药细胞株的增殖抑制率,降低药物的IC50。

鼻咽癌细胞株HNE-1蛋白质二维电泳图谱的建立

目的建立及优化聚丙烯酰胺二维凝胶电泳技术,结合分析软件,全面展示鼻咽癌细胞株HNE-1的蛋白质表达谱,为进一步开展鼻咽癌的蛋白质组学研究奠定了基础。方法大规模培养HNE-1细胞,利用优化的蛋白质抽提技术获得HNE-1细胞的总蛋白。选用线性及非线性的不同pH梯度固相(IPG)干胶条对细胞总蛋白等电聚焦以及聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳,初步建立了HNE-1细胞株总蛋白质的二维电泳(2-DE)图谱。结果采用不同pH梯度范围的IPG胶条和优化的2-DE技术能够有效展示HNE-1细胞全蛋白质表达谱。结论重叠窄pH梯度范围的IPG胶条提高了2-DE中蛋白质的分离效果。

氧化苦参碱对放疗鼻咽癌HNE-1细胞P-糖蛋白表达影响

目的(1)氧化苦参碱对放射前后鼻咽癌HNE-1细胞有无生长抑制作用;(2)研究天然产物氧化苦参碱对鼻咽癌HNE-1细胞株放射前、后P-糖蛋白表达的影响。方法(1)MTT法检测长春新碱、维拉帕米、氧化苦参碱对放射前HNE-1细胞、放射后HNE-1(200)细胞生长抑制情况;(2)免疫化学法检测氧化苦参碱、维拉帕米对HNE-1(200)细胞P-糖蛋白表达的影响。结果(1)长春新碱、维拉帕米、氧化苦参碱对放射前、后细胞生长均有抑制作用,呈浓度依赖关系,随着浓度的增加抑制作用也增加;(2)高浓度VCR对放射治疗后细胞HNE-1(200)的抑制率比对HNE-1细胞的抑制率降低了近50%,P值小于0.01,有显著差异;氧化苦参碱、维拉帕米对两种实验细胞抑制没有显著差异。(3)免疫组化检测细胞P-糖蛋白表达,结果为HNE-1阴性,HNE-1(200)阳性,维拉帕米、氧化苦参碱分别作用于HNE-1(200)细胞后P-gp表达弱阳性。结论(1)氧化苦参碱对放射前后鼻咽癌HNE-1细胞有明显生长抑制作用;(2)放射后细胞HNE-1(200)对长春新碱产生耐药;(3)低毒性浓度氧化苦参碱具有与维拉帕米相似的作用,能使放射照射后鼻咽癌HNE-1细胞株P-糖蛋白的表达下降。

抑瘤基因NGX6对鼻咽癌细胞株HNE1细胞生长的影响(英文)

鼻咽癌是我国南方多发恶性肿瘤 ,它的发生发展与遗传因素密切相关 .采用定位候选克隆策略在 9p上克隆出一个候选抑瘤基因 ,命名为NGX6 .为了进一步研究它的功能 ,将NGX6基因的全长cDNA片段亚克隆至pcDNA3.1(+ )的表达载体中 ,通过脂质体转染入鼻咽癌细胞系HNE1中 ,Northern杂交方法筛选高效表达NGX6的细胞株 ,并借助细胞生长曲线、软琼脂糖集落形成实验、裸鼠体内接种实验和流式细胞仪对转染细胞的生物学行为进行了检测 .结果显示 ,转染了NGX6基因的HNE1细胞的生长速度明显减慢 ,在软琼脂中集落形成率较对照组显著下降 (P〈0 0 5 ) ,裸鼠体内成瘤的时间较对照组明显延长 ,瘤体的大小和重量较对照组明显减少 ,流式细胞仪检测发现细胞的凋亡率无明显变化 .为了明确NGX6蛋白在细胞中发挥作用的部位 ,进一步将NGX6的开放阅读框架完整正确地克隆到pEGFPC1的荧光载体中 ,转染到COS7细胞中 ,用荧光显微镜观察细胞中荧光的分布 ,发现荧光主要分布在细胞浆中 ,说明NGX6蛋白可能是一种胞浆蛋白 .该研究表明 ,NGX6在NPC的发生发展中起重要作用 ,为全面阐述NGX6的功能提供重要的信息 。

紫杉醇联合热疗对鼻咽癌CNE-1细胞株增殖及凋亡的影响

目的探讨紫杉醇(Paclitaxel)联合热疗对鼻咽癌细胞株CNE-1增殖及凋亡的影响,为临床紫杉醇与热疗联合应用提供实验依据。方法将不同温度(39℃、41℃和43℃)及不同浓度(0.01、0.10、1.00、10.00和100.00nmol/L)紫杉醇采用分组设计(共15个组),各浓度组设37℃为对照组(共5个组)。在紫杉醇对CNE-1细胞作用48h后加热30min,使用MTT法、克隆形成能力试验、细胞形态学、超微结构观察及琼脂糖凝胶电泳等方法测定紫杉醇联合热疗对CNE-1细胞体外增殖抑制及细胞凋亡的影响。结果加热41℃组细胞增殖率与其他不同温度同剂量组比较均降低,差异有显著性。与其他各组比较均降低,差异均有显著性(P<0.05);39℃和43℃组细胞增殖率与37℃对照组比较均升高,差异有显著性(P<0.05)。琼脂糖凝胶电泳显示紫杉醇作用48h后便可出现DNA梯带,并呈时间剂量性增强。最低0.10nmol/L浓度可见DNA梯带。倒置显微镜和电镜下可见细胞损伤及凋亡细胞。结论加热41℃时不同浓度紫杉醇对CNE-1细胞均有增殖抑制及诱导细胞凋亡作用;39℃或43℃热疗联合0.01nmol/L紫杉醇化疗时CNE-1细胞增殖能力最强。

CNE1、CNE2鼻咽癌细胞株中ATM/PI3K区基因突变的检测

为了探讨具有不同放射敏感性的CNE1、CNE2鼻咽癌细胞株中ATM/PI3K区基因突变的情况,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术和PCR产物直接测序方法(荧光标记的ddNTPs循环测序),对CNE1、CNE2中ATM的PI3K关键区域进行突变检测。结果表明,所测CNE1、CNE2中的ATM/PI3K区序列中没有发生突变,认为鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2间内在的放射敏感性的差异可能与ATM/PI3K区基因突变不相关。

紫杉醇对鼻咽癌CNE-1细胞株作用的研究

目的探讨紫杉醇对鼻咽癌细胞株CNE-1生长抑制及诱导凋亡作用。方法应用肿瘤细胞培养技术,随机分组和空白对照设计,观察紫杉醇对CNE-1生长抑制的剂量和时间效应;培养不同时间后,用MTT法、集落形成能力测定、流式细胞仪检测分析观察细胞周期分布和凋亡发生率。结果紫杉醇为1.0×10-9低浓度时细胞生长受到明显影响,1.0×10-8浓度组的细胞生长受到明显抑制(P<0.05)。并且存在时间关系和一定范围内的剂量依赖关系。细胞周期分析结果显示;在中等或低浓度紫杉醇作用下,CNE-1细胞被阻止于G0/G1期,并能诱导细胞发生凋亡。在紫杉醇的短时间作用去除后再培养比持续作用培养更易促使细胞凋亡。结论鼻咽癌细胞株CNE-1对紫杉醇是高度的敏感,能使细胞生长阻止于G0/G1期,并诱导细胞凋亡,为紫杉醇治疗鼻咽癌提供实验依据。

慢病毒介导RNA干扰HES1鼻咽癌稳定细胞株的建立与鉴定

目的建立稳定干扰Split多毛增强子1(HES1)的鼻咽癌(NPC)细胞株,为进一步探讨HES1对NPC的影响奠定基础。方法将293T细胞接种6孔板后随机分为A、B、C、D、E组,分别瞬时转染慢病毒质粒shHES1-a、shHES1-b、shHES1-c、shHES1-d及空载质粒shSCR,分别用qRT-PCR和Western blot法检测HES1 mRNA及蛋白,筛选出最有效干扰质粒;将最有效干扰质粒或空载质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得含最有效干扰质粒或空载质粒的病毒上清(LV-shHES1/LV-shSCR)。将NPC细胞CNE2和S18随机分为观察组和对照组,分别将LVshHES1、LV-shSCR以浓度梯度方式感染细胞,分别采用qRT-PCR和Western blot法检测HES1 mRNA及蛋白。结果C组293T细胞中HES1 mRNA及蛋白相对表达量均低于其余各组(P均<0.05)。与对照组比较,观察组CNE2和S18细胞中HES1 mRNA及蛋白相对表达量均降低(P均<0.05)。结论成功建立稳定干扰HES1的NPC细胞株。

AQP1在不同转移潜能的人鼻咽癌细胞株中的表达

目的:探讨AQP1在不同转移潜能人鼻咽癌细胞中表达的差异。方法:利用RT-PCR及Western blot两种方法,检测CNE1、CNE2、5-8F三种不同转移潜能的人鼻咽癌细胞株中AQP1的表达情况,并分析AQP1表达与细胞转移潜能的关系。结果:在CNE1、CNE2及5-8F细胞株中均可检测到AQP1的表达。在三种不同转移潜能细胞株中,AQP1的表达量水平有统计学差异(P <0.05)。而且,AQP1的表达水平随着细胞株转移潜能的增高而增加。结论:AQP1的表达水平可能与人鼻咽癌细胞的转移潜能密切相关。

化疗药物联合TRAIL对鼻咽癌细胞株增殖抑制的实验研究

目的:探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis indncing ligmard,TRAIL)联合化疗药物顺铂(Cisplatin,DDP)、5氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)作用于鼻咽癌HNE-1细胞株后对其细胞毒作用及凋亡影响的研究。方法:MTT法检测其增殖抑制率,FCM法检测细胞凋亡率。结果:TRAIL与DDP、5-FU联合作用于HNE-1细胞株时,其抑制率、凋亡率高于单独作用时的抑制率和凋亡率。结论:TRAIL与5-FU、DDP联合作用有协同抑制HNE-1细胞株增殖、诱导HNE-1细胞株凋亡的作用。

反义角蛋白13慢病毒质粒对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响

目的探讨反义角蛋白13(Keratin-13,KRT13)慢病毒质粒对鼻咽癌HNE-1细胞放射敏感性的影响。方法构建稳定表达反义KRT13基因的慢病毒质粒,并通过G418筛选出稳定转染该质粒的鼻咽癌HNE-1细胞。按数字随机法将细胞分为control(正常HNE-1细胞)组、lentivirus(转染慢病毒空载体)组和anti-KRT13(转染慢病毒质粒组)。并分别检测各组细胞中KPT13含量。同时采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡的变化。在0、1、2、4、6、8 Gy 6个放射剂量点下,采用克隆形成实验分析转染反义KRT13基因对细胞的存活影响,并分别用单击多靶模型和线性二次模型拟合出细胞的剂量存活曲线,对比放射生物学参数D0、Dq、N值、α、β和SF2值,评价细胞放射敏感性的变化。结果转染慢病毒质粒组的HNE-1细胞D0、Dq、N和SF2值较其他两组均增加,α/β值减小,且差异具有统计学意义(P均<0.05);反义KRT13可以阻滞细胞于G2/M期,同时抑制细胞凋亡。结论反义KRT13慢病毒质粒可降低鼻咽癌HNE-1的放疗敏感性。

长片段非编码RNA XIST可改变人鼻咽癌HNE1细胞对顺铂的耐药性

目的明确长片段非编码RNA(lncRNA)X失活特异性转录本(XIST)对人鼻咽癌细胞顺铂(DDP)耐药性的影响及可能的机制。方法通过荧光定量PCR检测人鼻咽癌顺铂耐药HNE1细胞株(HNE1/DDP)中XIST的表达特征。采用MTT试验观察XIST上调和下调对HNE1/DDP细胞DDP耐药性的影响,并通过EdU试验和流式细胞技术观察其对HNE1/DDP细胞增殖和凋亡的影响。采用蛋白质印迹法检测XIST上调和下调对促凋亡因子程序性细胞死亡4(PDCD4)和Fas配体(Fas-L)蛋白表达的影响。结果 XIST在HNE1/DDP细胞的表达量显著高于HNE1细胞(0.57±0.06 vs 0.1±0.02,P<0.05)。下调XIST的表达显著降低HNE1/DDP细胞对DDP的耐药性(P<0.05),而上调XIST增加对DDP的耐药性(P<0.05)。下调XIST的表达显著降低HNE1/DDP细胞增殖(6.17±1.93 vs 16.59 4.86, P<0.05)并诱导细胞凋亡[(18.04±4.72)%vs(4.22±1.65)%, P<0.05],而上调XIST增加细胞增殖(25.40±7.21 vs 13.16±3.95, P<0.05)并抑制细胞凋亡[(2.82±0.88)%vs(6.46±1.75)%, P<0.05]。下调XIST的表达显著增加HNE1/DDP细胞中PDCD4(4.10±0.42 vs 1.0±0.12, P<0.05和Fas-L(3.07 0.29 vs 1.0±0.14, P<0.05)蛋白的表达,而上调XIST降低PDCD4(0.36±0.11 vs 1.0±0.18, P<0.05)和Fas-L(0.17±0.09 vs 1.0±0.21, P<0.05)蛋白的表达。结论 XIST在HNE1/DDP细胞中表达升高,下调和上调XIST的表达可分别降低和增加HNE1/DDP细胞对DDP的耐药性,其机制可能与PDCD4和Fas-L蛋白表达改变相关。

放射线诱导hEgr-1-CD对鼻咽癌CNE放射增敏作用的研究

目的研究放射线诱导hEgr-1-CD自杀基因前药系统对鼻咽癌CNE细胞株放射增敏作用。方法将pcDNA3.1(+)Egr-1-CD利用脂质体转染的方法转染入鼻咽癌细胞株,给予不同剂量的X线照射观察基因表达与放射的剂量效应关系,观察不同的放射线及不同剂量的前药对鼻咽癌细胞的杀伤效应。结果电离辐射可诱导增强自杀基因阳性鼻咽癌CNE细胞株中CD基因的表达,电离辐射与前药5-Fc的联合应用大大增强了对自杀基因阳性细胞的杀伤作用,其杀伤作用大于单独自杀基因前药系统和单独照射。结论hEgr-1-CD自杀基因前药系统对鼻咽癌CNE细胞株有放射增敏作用,其与放射联合应用对CNE细胞有明显的协同杀伤作用。

氧化苦参碱对鼻咽癌耐药细胞株HNE-1(200)耐药逆转机制的研究

目的:研究天然有效成分氧化苦参碱对鼻咽癌耐药细胞株HNE-1(200)耐药逆转的机制。方法:以放射线照射诱导的鼻咽癌耐药细胞株HNE-1(200)为研究对象,采用免疫细胞化学法、免疫印迹(Western Blot)法检测细胞P-糖蛋白(P-gp)表达的变化,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测多药耐药1基因(mdr1)的mRNA的改变。结果:氧化苦参碱作用于HNE-1(200)细胞24h后,免疫细胞化学方法和Western Blot显示:人鼻咽癌(P-gp)表达下调;RT-PCR显示:HNE-1、HNE-1(200)细胞的mdr1表达无差异。结论:氧化苦参碱能通过下调P-gp表达,在一定程度上逆转耐药,但是mRNA表达并无变化,说明鼻咽癌多药耐药引起P-gp表达上调受多种机制控制。

用TRAP PCR ELISA及TRAP PCR PAGE测定鼻咽癌端粒酶活性的比较

比较TRAPPCRELISA及TRAPPCRPAGE检测鼻咽癌端粒酶的活性。方法 :分别采用TRAPPCRELISA及TRAPPCRPAGE检测了 38例鼻咽癌 (NPC)、15例癌旁组织、19例慢性鼻咽炎和鼻咽癌HNE1细胞株、其它 2种癌细胞株及 3种正常细胞的端粒酶表达。并探讨了在不同数量的HNE1细胞中端粒酶表达的灵敏度及HNE1细胞株、5例NPC活检组织经热灭活后端粒酶检测的特异性。结果 :两种方法在NPC、癌旁、慢性鼻咽炎及HNE1细胞株端粒酶表达的阳性率非常接近 ,分别为 84.2 9%和 85 .2 9%、73.3%和6 9.2 %、5 .3%和 12 .1%及 95 .5 %和 91.2 %。ELISA间接定量法能很好地反映不同程度的端粒酶活性状态。在 10 2 HNE1细胞中仍能检测到端粒酶活性 ,而热灭活后测不出其活性。结论 :两种方法均能很好地显示鼻咽部不同组织及细胞中的端粒酶活性状态 ,有较高的灵敏度和特异性。

Cdc2/cdk1和survivin特异性siRNA真核表达载体的设计、构建和鉴定

目的：构建表达靶向cdc2/cdk mRNA和survivin mRNA的siRNA真核表达质粒。方法：从GenBank中搜索Cdc2/cdk1和survivin基因组标准序列,根椐siRNA设计原理构建siRNA真核表达质粒phU6-cdc2/cdk1-shRNA1、phU6-cdc2/cdk1-shRNA2、phU6-survivin-shRNA1和phU6-survivinshRNA。phU6-survivin-shRNA1、phU6-survivin-shRNA2、pU6-HK-shRNA质粒均含有增强绿色荧光基因作为报告基因和酶切位点,而phU6-cdc2/cdk1-shRNA1、phU6-cdc2/cdk1-shRNA2均含有红色荧光基因作为报告基因和酶切位点。质粒酶切、电泳、测序鉴定;用脂质体转染鼻咽癌CNE2细胞,荧光显微镜下观察、摄片、计数阳性细胞,计算转染效率,激光共聚焦显微镜检测质粒载体绿色和红色荧光蛋白的表达,免疫印迹法检测真核表达质粒对相应蛋白的抑制率。结果：荧光显微镜下计算转染效率显示在转染鼻咽癌细胞CNE2 48h转染率高达45.00%-57.45%;质粒phU6-cdc2/cdk1-shRNA1、phU6-cdc2/cdk1-shRNA2、phU6-survivin-shRNA1、phU6-survivin-shRNA2和pU6-HK-shRNA酶切后均可见400bp条带,与预期插入的目的基因大小一致,基因测序证实碱基序列与模板序列相符;在共聚焦显微镜下观察均见大量的细胞表达相应荧光;免疫印迹检测phU6-cdc2/cdk1-shRNA1、phU6-cdc2/cdk1-shRNA2、phU6-survivin-shRNA1和phU6-survivin-shRNA2对鼻咽癌CNE2细胞相应蛋白抑制率分别是33.00±1.41、38.31±1.01（survivin）、36.33±1.21和43.26±1.02（cdk1）。结论：本实验构建了靶向Cdc2/cdk1mRNA和survivin mRNA的真核表达质粒。重组质粒能有效转染人鼻咽癌细胞,phU6-cdc2/cdk1-shRNA2和phU6-survivin-shRNA2与phU6-cdc2/cdk1-shRNA1和phU6-survivin-shRNA1相比,转染CNE2 48h后其对相应蛋白的干扰率相对较高。

Bcl-xl和IGF-1受体特异性siRNA真核表达载体的设计、构建及鉴定

目的:构建能表达靶向Bcl-XL mRNA和IGF1RmRNA的siRNA真核表达质粒。方法:从GeneBank中搜索Bcl-XL(NM_138578)和IGF-1R(NM_000875)基因组标准序列,根椐siRNA设计原理各基因选取两段19bp的碱基序列作为靶目标,根据其序列构建siRNA真核表达质粒:psiBcl-XL1和psiBcl-XL2以及psiIGF1R1和psiIGF1R2。随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列,构建表达siRNA的真核表达质粒作为质粒对照psiHK。所构建的质粒均含有增强绿色荧光基因作为报告基因和SalI的酶切位点。质粒经酶切后,电泳鉴定酶切片段;基因测序分析质粒的碱基序列;用脂质体转染鼻咽癌CNE2细胞。转染后培养48h,做流式细胞仪检测转染率并采用共聚焦显微镜检测质粒绿色荧光蛋白的表达,通过RT-PCR检测各组质粒对其基因的干扰率。结果:质粒psiBcl-XL1、psiBcl-XL2、psiIGF1R1、psiIGF1R2和psiHK酶切后均可见400bp小带,与预期插入的目的基因大小一致,基因测序证实碱基序列与模板序列相符;经荧光显微镜下摄片计算转染效率发现:在转染48小时达最高(45%～50%之间);流式细胞仪检测转染后48小时的转染率为48.45%,并在共聚焦显微镜下观察均见大量的细胞表达绿色荧光;psiBcl-XL1、psiIGF-1R1、psiB-clXL2和psiIGF1R2干扰率分别是:22.1%、50%、70.6%、61.8%。结论:本实验构建了靶向Bcl-XLmRNA和IGF1R mRNA、表达短发夹RNA(short hairpin ribonucleic acid,shRNA)的真核表达质粒。重组质粒能有效转染人鼻咽咽癌细胞,psiBcl-XL2和psiIGF-1R2与psiBcl-XL1和psiIGF1R1相比,转染CNE2 48h后其对mRNA的干扰率相对较高。

X线照射对人鼻咽癌细胞株MRP基因和MRP表达的影响

化疗药物可以诱导肿瘤细胞多药耐药相关基因（MRP基因）及其蛋白（MRP）的过度表达，从而产生多药耐药，导致化疗疗效降低。放疗也能引起肿瘤细胞的MRP基因和MRP表达增强，但照射后肿瘤细胞MRP基因和MRP表达随时间的变化情况，目前少见报道。本研究采用体外培养的鼻咽癌CNE-1细胞株，检测照射前、后细胞MRP基因和MRP的表达随时间变化情况以及细胞对顺铂（DDP）敏感性的变化，从而探讨照射与鼻咽癌多药耐药性的关系。