细胞周期蛋白激酶抑制调控蛋白p21在HHV-8病毒裂解复制周期的作用

目的研究细胞周期蛋白激酶抑制调控蛋白p21对人类疱疹病毒8型(human herpesvirus 8,HHV-8)病毒裂解复制周期的影响。方法组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂SAHA预处理后,倒置荧光显微镜观察红色荧光蛋白(RFP)阳性的iSLK.219细胞数,实时定量PCR检测TREx-K-Rta BCBL-1细胞中HHV-8病毒相关基因的mRNA水平。脂质体转染p21-siRNA后,免疫印迹法检测iSLK.219和TREx-K-Rta BCBL-1细胞中p21蛋白表达,计算RFP阳性iSLK.219细胞百分率,检测TREx-K-Rta BCBL-1细胞中ORF50和PAN的mRNA水平,CCK-8法和台盼蓝染色观察细胞存活情况。结果SAHA显著增强iSLK.219细胞RFP阳性率、TREx-K-Rta BCBL-1细胞中HHV-8裂解复制周期相关基因ORF50、PAN及K8.1的mRNA水平和p21蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。siRNA沉默p21后,iSLK.219细胞RFP阳性率、TREx-K-Rta BCBL-1细胞中HHV-8裂解复制周期相关基因ORF50和PAN mRNA水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05),且保护SAHA介导的TREx-K-Rta BCBL-1细胞死亡。结论抑制HDAC活性通过调控p21促进HHV-8病毒裂解复制。

BHK-21细胞中猪乙型脑炎病毒动态增殖的研究

为了研究猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)在仓鼠肾细胞(BHK-21细胞)中的增殖情况,试验首先建立了实时荧光定量PCR方法,并检测该方法的敏感性、特异性和重复性,然后利用建立的实时荧光定量PCR方法和病毒半数组织感染量(TCID_(50))方法测定并比较猪JEV在BHK-21细胞中的增殖规律。结果表明:建立的猪JEV实时荧光定量PCR检测方法的扩增效率为99.3%,敏感性、特异性和重复性良好,检测敏感性可以达到1.0×10^(1)copies/μL;TCID_(50)方法测定的细胞悬液和细胞培养上清液中的病毒含量分别为1.0×10^(5.44)TCID_(50)/0.1 mL和1.0×10^(4.86)TCID_(50)/0.1 mL,实时荧光定量方法测定的病毒粒子数量分别为1.0×10^(7.50)copies/μL和1.0×10^(5.60)copies/μL,两种方法在细胞悬液中出现峰值的时间为感染病毒后60小时,在细胞培养上清液中为72小时。说明猪JEV在BHK-21细胞中增殖的最佳收毒时间是感染病毒后60小时。

鼻咽癌细菌L型、EB病毒感染的检测及与P^(21)、P^(53)基因突变的关系

用免疫组化染色和革兰染色等技术，对129例鼻咽癌、20例鼻咽粘膜慢性支进行细菌L型、EB病毒检测，同时对L型阳性、EBV阳性和L型阴性、EBV阴性组织的P21、P53表达进行对比分析。结果显示，鼻咽癌组的L型检出率为69．8％；EBV检出率为27．1％，两者有显著性差异（P＜0．05）。鼻咽癌组的P21、P53阳性表达率显著高于慢性炎组（P＜O.005）。L型阳性、EBV阳性伴P21、P53阳性的表达率也分别高于L型阴性、EBV阴性伴P21、P53阳性的表达率。表明L型、EBV感染与鼻咽癌关系密切；P21、P53过度表达与鼻咽癌的发生也有关。此外，L型和EBV感染与P21、P53的过度表达存在着相关性。提示，L型和EBV参与了P^(21)、P^(53)基因突变，并在鼻咽癌的发生中可能起协同作用。

下调细胞P21^(WAF1/CIP1)基因表达可抑制单纯疱疹病毒Ⅱ型复制

为了揭示细胞P21蛋白在单纯疱疹病毒Ⅱ型(herpes simplex virus type2,HSV-2)复制中的作用,通过用HSV-2感染和感染前用特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制P21基因表达,应用Western印迹方法检测宿主细胞和病毒蛋白水平,用终点滴定法测定病毒半数组织培养感染量(50%tissue culture infectious dose,TCID50),以及观察感染细胞的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)等3个方面,揭示细胞P21蛋白水平的变化对病毒复制的影响.结果表明,HSV-2在细胞内复制时可引起P21蛋白水平增高;而用特异性siRNA下调细胞P21基因表达时,可显著地抑制HSV-2gB蛋白水平,减少培养细胞上清液中病毒TCID50.提示P21蛋白对HSV-2的复制具有重要的作用.

H1N1甲型流感病毒在BHK21中的增殖规律

BHK21细胞是多种动物病毒的易感宿主,是病毒疫苗生产的常用基质,为了解H1N1甲型流感病毒在BHK21细胞中的增殖规律,本研究建立了定量检测甲型H1N1流感病毒M基因表达水平的SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR(RRT-PCR)方法,用于研究H1N1甲型流感病毒在BHK21细胞中的增殖规律.结果发现:用1MOI H1N1甲型流感病毒接种BHK21,细胞于感染后24 h开始出现细胞病变,36h细胞大量脱落和崩解;病毒定量检测结果显示,H1N1甲型流感病毒增殖迅速,于感染后6、12、24、36 h病毒滴度分别为1.77×106拷贝/mL、2.39×106拷贝/mL、6.58×105拷贝/mL、2.87×105拷贝/mL.研究结果证实本实验建立的RRT-PCR能用于H1N1甲型流感病毒的精确定量,病毒在BHK21细胞中的增殖规律为利用细胞毒生产疫苗提供了参考.

文山松毛虫质型多角体病毒在Sf21细胞中离体增殖试验

研究了文山松毛虫质型多角体病毒 (DpCPV W )在Sf2 1细胞中的离体增殖行为 ,并进行了空斑试验 ,结果显示DpCPV W毒株能够在Sf2 1细胞中增殖 ,也能在Sf2 1细胞上形成空斑 ,并能产生形态正常的病毒多角体。在DpCPV W中加入基因工程增效蛋白 ,能显著增加病毒粒子对离体细胞的感染率 ,增幅达 145 %。生物测定表明 ,离体增殖的病毒多角体与虫体增殖的多角体的毒力相当。因此 ,Sf2 1细胞可以作为文山松毛虫CPV增殖行为研究的离体细胞系统 。

9型重组腺相关病毒转染microRNA-21前体在大鼠心肌的转染效率及安全性

目的研究含荧光标记ZsGreen的9型重组腺相关病毒(rAAV9)转染目的基因microRNA-21前体(pre-miR-21)至大鼠心肌的转染效率、表达时间及安全性。方法用冠脉注射方法转染PBS及rAAV9-Zs-Green-pre-miR-21 1.0×1010vg/只、1.0×1011vg/只、1.0×1012vg/只至SD大鼠心肌,倒置荧光显微镜观察心肌组织荧光表达并计算转染效率,Realtime PCR方法测定miR-21表达,超声心动图观察大鼠心功能。结果冠脉注射后7 d PBS组未见绿色荧光,余各组大鼠心肌均可观察到少量绿色荧光表达,第14天达高峰,之后呈下降趋势。14 d高病毒量组较其他中、低病毒量组转染效率明显高([73.7±8.4)%vs(39.6±4.8)%,(P<0.001)];([73.7±8.4)%vs(24.1±4.2)%,(P<0.001)]。14 d miR-21表达在低、中、高病毒量组较PBS组分别增加1.51倍、2.89倍及4.43倍。rAAV9转染后对大鼠心功能无影响(P>0.05)。结论 rAAV9-Zs-Green-pre-miR-21可以有效、持久、安全地在大鼠心肌表达。

猪圆环病毒2型对外周血单核细胞中PD-1,PD-L1和IL-21转录水平的影响

用猪圆环病毒2型(PCV2)体外感染外周血单核细胞,建立荧光定量PCR方法检测PCV2的病毒载量;同时,在PCV2感染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72h收集细胞,抽提RNA进行反转录,检测PD-1、PD-L1和IL-21的转录水平变化,分析评价PCV2感染对PD-1、PD-L1和IL-21的转录水平变化的影响。结果显示,PD-1在感染外周血单核细胞后72 h显著升高,达到峰值;PD-L1在感染后转录水平都显著升高,48 h达到峰值;IL-21在感染后48 h转录水平最低。结果表明,PCV2不仅能够在体外感染外周血单核细胞,而且随着病毒载量的增加,导致PD-1、PD-L1和IL-21的转录水平显著升高。以上结果表明,PCV2感染导致PD-1、PD-L1和IL-21的转录水平升高,通过激活PD-1/PD-L1通路,从而抑制IL-21的转录水平;相反,IL-21刺激PD-1、PD-L1的转录水平升高。研究结果为探索PCV2的致病机制和控制PCV2的感染提供了理论基础。

流行性乙型脑炎病毒在BHK—21细胞上的蚀斑技术研究

本文运用BHK－21细胞进行了流行乙型脑炎病毒的蚀斑试验，同时研究了不同因素对蚀斑的影响，并与数量细胞病变作了比较。结果表明：此法是一种较精确的滴定流行性乙型脑炎病毒的方法，为以后研究流行乙型脑炎的病毒学和血清学打下了基础。

组织微小RNA-21表达及高危型HPV病毒载量与宫颈癌发生发展的相关性研究

目的探索组织微小RNA-21(miR-21)表达、高危型HPV病毒载量与宫颈癌发生发展的相关性研究。方法选择在2011年2月1日至2016年2月1日接受治疗的患有宫颈病变并行宫颈活检的患者150例。经细胞学(诊断标准采用TBS系统报告)及病理学诊断分为正常、炎或疣组14例、不典型鳞状细胞(ASCUS组)15例、宫颈上皮内瘤样病变Ⅰ级(CINⅠ组)29例、鳞状上皮中度非典型增生Ⅱ级(CINⅡ组)34例、鳞状上皮重度非典型增生Ⅲ级(CINⅢ组)31例和子宫颈癌包括宫颈鳞癌和宫颈腺癌(CC组)27例。采集各组患者脱落细胞或病变组织采用Real-timePCR方法和第二代杂交捕获技术(HCII)方法检测miR-21及高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV DNA)的载量,并观察miR-21表达、高危型HPV病毒载量与宫颈癌发生发展的相关性。结果各组结果对比发现,CC组的HPV病毒负荷量及miR-21表达量为(1 308.54±18.64)pg/ml、(1.12±0.65)Ct,均高于其他组。而正常、炎或疣组及ASCUS组的HPV病毒负荷量远远低于其他组,差异具有统计学意义(P<0.05),正常、炎或疣组的miR-21表达量明显低于其他组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。而利用Speaman等级相关和Pearson相关性分析,发现两组数据与宫颈病变严重程度呈正相关,即宫颈病变越重,miR-21表达、高危型HPV病毒载量含量越高。结论 miR-21表达、高危型HPV病毒载量与宫颈癌病变程度呈正相关,检测两指标可为宫颈癌的诊断和治疗提供理论依据。

宫颈癌发生发展过程中组织微小RNA-21表达及高危型HPV病毒载量变化的意义

目的：研究宫颈癌发生发展过程中组织微小RNA-21表达及高危型HPV病毒载量变化的意义。方法选取2011年3月至2015年3月收治的宫颈病变并行宫颈活检的患者150例， CINⅠ组（ n ＝39）、CINⅡ组（ n ＝37）、CINⅢ组（ n ＝34），CC组（ n ＝40），分析miR-21的表达及HR-HPV载量与宫颈癌临床病理特征的联系，miR-21的表达与HR-HPV载量的相关性，不同宫颈病变中miR-21的表达及HR-HPV载量。结果宫颈癌患者肿瘤细胞低分化者miR-21表达（6．12±0．83）低于中分化者（8．17±0．65）及高分化者（11．54±1．29）（ P ＜0．05）；肿瘤细胞直径＞4 cm者HR-HPV载量（26．53±3．12）高于＜4 cm者（23．60±2．85）（ P ＜0．05），FIGO分期Ⅰ～ⅡA者HR-HPV载量（23．86±2．34）低于ⅡB～Ⅳ者（27．59±3．12）；宫颈癌HR-HPV阳性者miR-21表达（9．75±0．83）高于HR-HPV阴性者（5．47±0．46），差异有统计学意义（ P ＜0．05）；但miR-21表达及HR-HPV载量与宫颈癌年龄、FIGO分期、病理类型、淋巴转移、脉管浸润无明显相关性（ P ＞0．05）；CINⅠ组HR-HPV阳性患者（41．03％）分别低于 CINⅡ组（67．57％）、CINⅢ组（85．29％）及CC组（92．50％），CINⅠ组mi-R21相对表达水平（6．42±0．53）低于CINⅡ组（7．26±0．61）、CINⅢ组（8．24±0．65）及CC组（9．36±0．70），差异有统计学意义（ P ＜0．05）。结论微小RNA-21表达可反应宫颈癌细胞分化程度，高危型HPV病毒载量可反应宫颈癌FIGO分期及肿瘤直径范围，微小RNA-21表达与高危型HPV病毒载量呈正相关，联合检查微小RNA-21及高危型病毒载量能够提示宫颈癌前病变、宫颈癌的发生发展。

肠道非霍奇金淋巴瘤与EB病毒、p53、p21^(ras)的相关性

目的 :研究肠道非霍奇金淋巴瘤 (NHL)与EB病毒 (EBV)感染 p5 3、p2 1ras蛋白表达及其相关性。方法 :以SABC免疫组化方法检测瘤细胞 p5 3、p2 1ras基因的表达及EBV寡核苷酸探针 (EBER)原位杂交。结果 :19例肠道NHL好发部位于小肠下段和结肠 ,以单发瘤结节多见 ,常伴有表面溃疡形成。经免疫组化证实 3例为T细胞淋巴瘤 (15 79% ) ,16例为B细胞淋巴瘤(84 2 1% )。依WHO分类 ,T细胞淋巴瘤为外周T细胞性 (2 / 19例 )和T/NK细胞性 (1/ 19例 )。B细胞淋巴瘤为弥漫性大细胞性 (4/ 19例 )、边缘区B细胞性 (11/ 19例 )和小淋巴细胞性 (1/ 19例 )。EBV EBER原位杂交 3/ 19例有阳性表达 ,均为T细胞淋巴瘤 ,阳性细胞占肿瘤细胞的 30 %～ 80 %。B细胞淋巴瘤未见阳性。p5 3的表达共有 12例 ,占全部病例的 6 3 16 % ,11例有 p2 1ras的表达 ,为 5 7 9%。有 8例同时检出 p5 3和 p2 1ras的表达。结论 :肠道淋巴瘤以B细胞淋巴瘤多发 ,并以惰性为多见。如为T细胞性淋巴瘤 ,提示多是侵袭性 ,且T细胞淋巴瘤与EBV相关性较高 ,而B细胞淋巴瘤无相关性。p5 3的表达与EBV感染无明显相关性 ,而 p2

宫颈病变中NOB1、miR-21的表达及与高危型HPV感染关系

目的:探讨宫颈病变中NOB1、miR-21的表达及与高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染的相关性。方法:选取2018年1月-2020年5月本院就诊的宫颈病变患者138例临床资料进行回顾性分析,其中宫颈癌52例(宫颈癌组)、宫颈鳞状上皮内病变54例(上皮内病变组)、慢性宫颈炎32例(宫颈炎组),对比各组NOB1阳性率、阳性细胞比例和染色强度综合评分、miR-21表达量及HR-HPV阳性率及DNA负荷量;分析NOB1、miR-21与高危型HPV感染的相关性;评估NOB1、miR-21诊断宫颈癌和预测高危型HPV感染效能。结果:NOB1阳性率、阳性细胞的比例和染色强度综合评分及miR-21表达量宫颈癌组、上皮内病变组、宫颈炎组依次降低;宫颈癌组HR-HPV阳性率、HR-HPV DNA负荷量中100~1000、≥1000占比高于另外两组(P<0.05),1~100占比3组无差异(P>0.05)。Kendall’s tau-b相关性分析显示,NOB1阳性细胞比例和染色强度综合评分、miR21表达量与HR-HPV DNA负荷量呈正相关(r=0.137、0.143,均P<0.05)。多元逐步回归分析显示,NOB1阳性细胞比例和染色强度综合评分为HR-HPV阳性率的影响因素。ROC曲线分析显示,NOB1阳性细胞比例和染色强度综合评分、miR-21诊断宫颈癌的AUC分别为0.950、0.975(P<0.05),预测高危型HPV感染的AUC分别为0.739、0.712(P<0.05)。结论:宫颈癌患者NOB1阳性、miR-21呈高表达,且表达与HR-HPV DNA负荷量呈正相关,对宫颈癌诊断和预测高危型HPV感染有一定价值。

BHK-21单细胞克隆敏感株筛选及日本脑炎病毒分离

为筛选出日本脑炎病毒(JEV)敏感度高的BHK-21细胞株,采用终点稀释法从母代BHK-21混合细胞中分离单细胞克隆株,应用接种BHK-21克隆株方法,从JEV阳性蚊子样品研磨液中分离病毒,筛选出的3号单细胞克隆株经3次传代后细胞产生明显病变,分离到1株JEV,5号单克隆株培养物核酸检测呈阳性,但是不产生细胞病变,母代混合细胞没有病变,JEV核酸检测阴性。根据1、3型JEV的prM与E基因设计4对引物初步鉴定分离株基因型,鉴定分离株为1型JEV。综合以上结果,构建的BHK-21单细胞克隆株比BHK-21混合细胞对分离JEV株敏感,更适合JEV的分离与培养。

鼻腔、鼻窦鳞状细胞癌中p53、p21蛋白表达及HPV16/18感染的意义

目的探讨p53和p21的表达及HPV感染在鼻腔、鼻窦鳞状细胞癌(简称鼻鳞癌)中的意义。方法用EnVision免疫组化二步法检测28例鼻鳞癌和24例鼻息肉中p53和p21的表达情况,并用原位杂交方法检测其HPV16/18的感染情况。结果鼻鳞癌组中p53的阳性表达率为64.29%,鼻息肉组中p53未见表达,两组比较差异极显著(P<0.01);而p21的阳性表达率在鼻鳞癌组和鼻息肉组间差异不显著;鼻鳞癌组HPV16/18检出率为78.57%,鼻息肉组HPV16/18检出率为0,两组比较差异极显著(P<0.01)。结论p53基因突变以及HPV感染与鼻鳞癌的发生、发展可能有一定的相关性。

EB病毒相关胃癌组织中P53及P21蛋白的表达

目的探讨Epstein-Barr病毒(EBV)感染、P53和P21蛋白表达异常在胃癌发生发展中的作用以及三者相关性。方法应用免疫组化技术检测13例EBV相关胃癌(EBVaGCs)、45例临床指标与之匹配的EBV阴性胃癌(EBVnGCs)以及58例相应癌旁组织中P53和P21蛋白的表达。结果胃癌组织P53蛋白阳性率明显高于癌旁组织,差异有极显著性(χ2=50.000,P<0.01)。EBVnGCs组织中P53蛋白阳性率与EBVaGCs相比差异无显著性(χ2=0.072,P>0.05);但EBVaGCs组织P53蛋白过表达率明显低于EBVnGCs组织,差异有极显著性(χ2=7.259,P<0.01)。胃癌组织P21蛋白阳性率明显低于癌旁组织,差异有极显著性(2χ=12.500,P<0.01)。EBVnGCs与EBVaGCs组织P21蛋白阳性率无明显差异(P>0.05)。胃癌组织中P21与P53蛋白共同表达率较高,但无显著相关性(2χ=1.323,P>0.05,r=0.202 5)。结论P21蛋白表达存在p53依赖性和p53非依赖性两条途径;胃癌组织中EBV感染与P53蛋白的异常表达有关,而与P21蛋白异常表达无显著相关性。

呼吸道病毒、17q21基因多态性与哮喘易感性的研究进展

支气管哮喘是儿童时期最常见的呼吸道疾病之一,其发病机制复杂,是环境与遗传背景直接或间接作用的结果。目前,鼻病毒感染被认为是哮喘发生机制环境因素中最重要的因素,但是并不是所有鼻病毒感染后都会发生哮喘,说明遗传背景的重要性。17q21染色体上基因多态性是目前研究证据最充分的与儿童哮喘发病相关的遗传因素。在病毒感染与哮喘关系中,病毒作为直接因果关系的证据很少,更多观点认为病毒标记筛选出具有哮喘易患体质的儿童。具有17q21基因遗传背景的儿童,在早期发生的HRV感染喘息性疾病,后期发展成为儿童哮喘的可能性大。

TRIM21在病毒诱导的天然免疫应答中的研究进展

三结构域蛋白21(TRIM21)是TRIM家族中的一员,其作为E3泛素连接酶在抗病毒天然免疫中发挥了重要作用。当病毒入侵时,TRIM21与病毒核酸感受器介导的抗病毒信号通路中的关键蛋白相互作用,泛素化IRF3、IRF5、IRF7、IRF8、MAVS、DDX41等调控和维持机体的抗病毒稳态。TRIM21在机体内还介导抗体依赖的细胞内中和反应,协同补体系统发挥抗病毒效应。本文主要就当前TRIM21作为E3泛素化酶在病毒诱导的天然免疫应答中的研究进展进行归纳和阐述。

蓝舌病病毒感染对BHK-21细胞中Ⅰ型干扰素应答的影响

蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)是一种严重危害绵羊等反刍动物的一种虫媒病毒,为研究蓝舌病病毒感染与宿主细胞干扰素抗病毒免疫应答的分子机制。研究以感染复数(MOI)为1的BTV诱导18、24、36 h的BHK-21细胞通过实时荧光定量PCR分析干扰素通路基因mRNA表达特征,以及Western blot分析MDA5、TRAF3、RIG-Ⅰ和TBK1蛋白表达。结果表明,在诱导24 h时,干扰素信号通路基因表达的变化最为明显,IFN-α、IFN-β、RIG-Ⅰ、TBK1、MDA5、VISA、TRAF3基因的mRNA表达水平呈上调表达,而IKKε、TRAF6基因的mRNA表达水平呈下调表达,在蛋白水平上MDA5、TBK1蛋白上调表达而RIG-Ⅰ、TRAF3蛋白下调表达,表明BTV感染诱导BHK-21细胞中Ⅰ型干扰素免疫应答,为进一步探究IFN-Ⅰ信号通路调控基因在BTV感染的宿主细胞抗病毒免疫机制研究奠定基础。