利用报告基因的人7型腺病毒中和抗体检测方法的建立

目的:构建表达萤光素酶报告基因的重组人7型腺病毒(HAdV7)Ad7-dE1-dE3-Luc(Ad7-Luc)病毒,用于检测人群中HAdV7的中和抗体水平。方法:利用同源重组方法构建E1区和E3区部分缺失,并在E1区嵌入萤光素酶基因表达框的pAd7-Luc重组质粒,转染HEK-293细胞,包装出能够表达萤火虫萤光素酶的Ad7载体重组病毒(Ad7-Luc);选取HAdV7阳性血清样本对新建立的报告基因检测方法的准确性和稳定性进行验证;最后,利用该方法对北京地区60份血清样本进行HAdV7中和抗体检测。结果:获得能够表达萤火虫萤光素酶的Ad7-Luc重组病毒,病毒滴度可达4.85×10~8IFU/mL,Ad7-Luc检测法与传统细胞病变效应(CPE)法具有很好的一致性(R^2=0.8612,P<0.0001),批内和批间差异分别在10%和20%以内。北京地区60例血清样本的检测结果显示,HAdV7血清阳性率约为60%(36/60),明显低于HAdV5血清阳性率75%(45/60),75%的HAdV7阳性血清中和抗体滴度集中于低滴度水平(12～200)。结论:与传统的细胞病变方法相比,HAdV7中和抗体报告基因检测方法更快速、灵敏、准确,适用于人群中HAdV7血清流行病学调查及其疫苗的中和抗体研究。

人7型腺病毒Hexon蛋白原核表达及蛋白纯化

目的将人7型腺病毒(Human Adenovirus-7,HAdV-7)六邻体蛋白(Hexon)通过原核表达系统进行表达,筛选不同时间、浓度、温度诱导下的最佳表达条件,并进行蛋白纯化研究。方法通过PCR扩增获得Hexon目的基因,并将目的基因克隆至原核表达载体pET30a(+),构建pET30a-Hexon重组质粒,转化至宿主菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,筛选蛋白表达条件,利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋白。结果RT-PCR结果显示可扩增出2805 bp Hexon目的片段,将Hexon目的基因成功克隆至pET30a(+)载体,转化至BL21(DE3),成功构建pET30a-Hexon重组蛋白;筛选出pET30a-Hexon重组蛋白的最佳表达条件为34℃、1 mmol/L诱导剂诱导8 h,重组蛋白以包涵体的形式进行表达,通过His标签镍离子纯化柱可纯化出目的蛋白。结论成功表达pET30a-Hexon重组蛋白,筛选出最佳诱导条件并纯化出Hexon目的蛋白,为研究制备单克隆抗体及新型疫苗的开发提供了理论依据。

Ⅲa基因缺失的人7型腺病毒载体系统的建立

为了获得既能高效扩增外源基因,又不产生复制型子代病毒的腺病毒载体,我们构建了一个Ⅲa基因缺失的单周期腺病毒载体。本研究在前期已构建的E3区携带绿色荧光蛋白GFP的人7型腺病毒载体pK-Ad7E3GFP基础上进行。首先设计引物扩增包含氨苄青霉素抗性基因和质粒复制起点的AMP-ORI片段,利用限制性内切酶Asc I将pK-Ad7E3GFP切割为29.1kb与7.7kb的大小片段,其中,7.7kb小片段与AMP-ORI片段组装,获得第一个中间质粒pA-Ad7E3GAscI;经重叠延伸PCR、酶切、DNA组装等方法,将pA-Ad7E3GAscI上的Ⅲa基因进行删除,获得第二个中间质粒pA-AscDⅢa;经Pme I酶切的pA-AscDⅢa与上述29.1kb大片段经DNA组装后,得到重组腺病毒质粒pK-Ad7DⅢaE3GFP。同时,构建携带Ⅲa基因的真核表达载体pTPL-Ⅲa,转染293细胞,经G418筛选构建细胞系293-Ⅲa。结果发现,经Pme I线性化的pK-Ad7DⅢaE3GFP质粒转染293-Ⅲa细胞,7d后可见荧光聚集,且逐渐增大,表明重组腺病毒Ad7DⅢaE3GFP拯救成功;提取病毒基因组进行PCR鉴定,结果与预期相符;细胞培养上清经负染后,在电镜下可见腺病毒典型的正二十面体形态,培养细胞中也可见病毒呈晶格排列;以上结果均表明Ad7DⅢaE3GFP拯救成功。本研究成功建立了Ⅲa基因缺失的单周期人7型腺病毒载体系统,为该载体的研究与应用奠定基础。

沉默A549细胞中的CD46和DSG2可抑制人3型和7型腺病毒的侵入及IL-8的释放

目的探讨沉默受体CD46、桥粒芯蛋白(DSG2)对人3型腺病毒(HAdV-3)和7型腺病毒(HAdV-7)的侵入及炎症因子释放的影响。方法通过RNA干扰技术沉默A549细胞中CD46、DSG2的表达。实验分为HAdV-3组、HAdV-3+siRNA-NC组(siRNA无关序列对照组)、HAdV-3+siRNA-CD46组(转染siRNA-CD46)、HAdV-3+siRNA-DSG2组(转染siRNA-DSG2);HAdV-7组、HAdV-7+siRNA-NC组(siRNA无关序列对照组)、HAdV-7+siRNA-CD46组(转染siRNA-CD46)、HAdV-7+siRNA-DSG2组(转染siRNA-DSG2)。HAdV-3、7感染A549细胞后0.5、2 h,通过激光共聚焦显微镜观察两种腺病毒与受体CD46、DSG2结合水平;体外转染siRNA-CD46、siRNA-DSG2后不同时间点,qRT-PCR技术检测HAdV-3、7拷贝数,ELISA检测转染后IL-8表达情况。结果腺病毒感染A549细胞后0.5、2 h,HAdV-3、7与其受体CD46、DSG2结合共定位;腺病毒入胞后,随时间延长,病毒拷贝数增加,转染siRNA-CD46后2、6、12、24 h,HAdV+siRNA-CD46组的病毒拷贝数较HAdV组降低(HAdV-3+siRNA-CD46 vs HAdV-3:6 h,P<0.05;12、24 h,P<0.0001;2 h,降低趋势无统计学差异;HAdV-7+siRNA-CD46 vs HAdV-7:2 h,P<0.01;6 h,P<0.001;12、24 h,P<0.0001)。转染siRNA-DSG2后2、6、12、24 h,同样明显降低了病毒载量(HAdV-3+siRNA-DSG2 vs HAdV-3,HAdV-7+siRNA-DSG2 vs HAdV-7,P<0.0001)。HAdV-3、7感染A549细胞后,炎症因子IL-8释放增多(P<0.0001),沉默CD46和DSG2的表达后2、6 h,炎症因子IL-8水平降低(P<0.0001)。结论HAdV-3、7与其受体CD46、DSG2结合后入胞,病毒拷贝数随时间延长而增加,沉默CD46、DSG2后,抑制HAdV-3、7型腺病毒的侵入及IL-8释放。

HAdV-7感染诱导肺泡上皮细胞铁死亡

目的探究人7型腺病毒(human adenovirus type 7,HAdV-7)感染对肺泡上皮细胞发生铁死亡的诱导作用。方法体外培养肿瘤性肺泡上皮细胞(A549)和正常人肺泡Ⅱ型上皮细胞(HPAEpiC),感染HAdV-7(24、48、72 h)后,CCK-8检测细胞活性变化,电子透射显微镜观察胞内线粒体形态,活性氧(ROS)探针、脂质过氧化物(MDA)检测试剂盒分别检测细胞ROS和MDA水平,胞内亚铁离子荧光探针观察胞内Fe^(2+)水平,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot检测铁死亡通路中关键分子的表达水平。HAdV-7滴鼻感染CD46人源化小鼠后,普鲁士蓝染色和Western blot分别检测肺组织的铁沉积和铁死亡相关蛋白的表达水平。体内外予铁死亡抑制剂后,CCK-8检测HAdV-7感染肺泡上皮细胞后细胞活性变化,HE染色观察HAdV-7感染CD46人源化小鼠肺组织病理情况改变。结果HAdV-7感染导致A549、HPAEpiC细胞活性降低,细胞线粒体出现体积缩小,线粒体嵴减少等铁死亡特征性改变,HAdV-7组感染后48、72 h ROS水平显著高于对照组(P<0.01);感染后48 h的MDA水平也明显升高(P<0.05)。HPAEpiC细胞感染后胞内铁离子显著高于对照组(P<0.01)。RT-q PCR结果显示,HAdV-7感染降低了两种细胞胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白溶质载体家族7成员11(SLC7A11,也称为xCT)(P<0.01)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)(P<0.05)、膜铁转运蛋白(SLC40A1)(P<0.05)、铁蛋白重链1(FTH1)(A549:72 h,P<0.01;HPAEpiC:48、72 h,P<0.01)等基因的表达,而上调了铁调素(HAMP)基因的表达(A549:72 h,P<0.01;HPAEpiC:P<0.05)。HPAEpiC细胞感染后xCT和GPX4的蛋白表达水平降低。HAdV-7感染CD46人源化小鼠后,肺组织铁染色加深,而xCT(P<0.05)和Gpx4(P<0.01)表达显著下调。予以铁死亡抑制剂,DFO能够抑制HAdV-7诱导的肺泡上皮细胞死亡(HPAEpiC:P<0.01),Fer-1抑制细胞死亡的作用更明显(A549:P<0.05;HPAEpiC:P<0.01)。此外,Fer-1能够明显改善HAdV-7感染CD46人源化小鼠肺损伤状态。结论HAdV-7感染致使肺泡上皮细胞铁离子累积、脂质过氧化物增加,从而诱导细胞发生铁死亡,肺泡上皮细胞的铁死亡可能参与了HAdV-7感染所致的肺损伤。