人Cosmc胞外段蛋白在昆虫细胞Sf-9中的表达与纯化研究

目的:利用昆虫细胞Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达人Cosmc胞外段蛋白,为体外研究Cosmc蛋白的结构和功能奠定基础,同时也为O-连接糖基化及相关疾病的研究提供思路。方法:采用Bac-to-Bac系统,构建重组转移质粒p FastBac1-Cosmc extracellular domain(p Fast Bac1-Cosmc ED),转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组转座子r Bacmid-Cosmc ED。在脂质体介导下,重组病毒感染Sf-9无血清细胞,在Sf-9中表达Cosmc胞外段蛋白,由于Cosmc N端加有昆虫细胞信号肽HBM(Honey Bee Melittin)且不含有跨膜段,所以Cosmc胞外段蛋白表达后分泌到培养基上清中,通过SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱对其进行纯化分析。结果:SDS-PAGE和Western blot分析显示得到一条分子量约为33 k D的特异性条带,与目的蛋白大小相符,质谱结果进一步证明所得蛋白为Cosmc胞外段蛋白。结论:Sf-9细胞中可成功表达Cosmc胞外段蛋白,为进一步研究Cosmc的结构和功能奠定基础。