人Fas配体蛋白在大肠杆菌中的融合表达与应用

目的:在大肠杆菌中融合表达人Fas配体蛋白。方法:应用RT-PCR技术,从激活的人外周血淋巴细胞中提取总RNA,扩增Fas配体cDNA,克隆人PCR2.1载体。测序验证后,克隆人带有组氨酸盒的表达载体pQE-31,在大肠杆菌中表达,经亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达 产物。结果:表达的融合蛋白为人Fas配体,其相对分子质量(Mr)为40 000。经透析复性后,具有诱导Jurkat细胞凋亡的作用。用该蛋白分子免疫BALB/c小鼠制备抗血清,以间接ELISA检测了部分自身免疫病与肿瘤患者血清中可溶性FasL的含量,结果与进口试剂盒的灵敏性相似。结论:获得人Fas配体蛋白,并制备出抗FasL抗血清,为进一步研制抗FasL单克隆抗体,深入研究FasL的应用提供了材料。

表达人Fas配体的质粒用于治疗小鼠甲状腺相关眼病

目的探求表达人Fas配体(hFasL)的质粒在甲状腺相关眼病(TAO)小鼠模型中的治疗作用。方法小鼠分为3组。对照组(10只)用空质粒pcDNA3.1(+)活化的脾细胞免疫后,以空质粒治疗;模型组和治疗组(各19只)均以人TSH受体(hTSHR)活化的脾细胞进行免疫,前者不予治疗,后者行眼球后注射表达hFasL的质粒pcDNA3.1(+)/hFasL。结果模型组52.6%的眼眶组织出现了肌纤维变性及溶解断裂、脂肪组织增生、水肿等TAO样改变,与对照组相比,TT4升高、TSH降低(P<0.05)。治疗组仅15.8%有类似TAO改变,电镜下见有凋亡细胞,TT4、TSH回复至对照组水平。TRAb在3组间均无差异。结论眼球后注射表达hFasL的质粒治疗TAO小鼠取得了一定效果。

利用盘基网柄菌表达可溶性人Fas配体

用PCR扩增从激活的人中性粒细胞中得到的编码可溶性Fas配体胞外区中第14 1个到第2 81个氨基酸的cDNA ,将其与hCG_β信号肽片段融合到质粒MB12neo中,随后导入到盘基网柄菌AX3细胞中,得到分泌性表达hFasL的重组菌AX3_H3。为提高shFasL的表达量,对质粒pMB12neo作了改造,得到衍生质粒pMB74。利用质粒pMB74克隆表达shFasL ,得到高通量表达shFasL的重组菌AX3_pLu8。在复杂培养基HL_5C中,重组菌的细胞密度可达(1 5～2 )×10 7 mL ,AX3_H3及AX3_pLu8分泌的shFasL浓度分别为2 3 5 μg L及2 0 6 μg L。利用合成培养基SIH培养重组菌AX3_H3及AX3_pLu8,细胞密度均达到(4～5 )×10 7 mL ,shFasL浓度则分别达到111μg L和4 2 0 μg L。