一种制备兔抗人IgG抗体的简易方法

目前，制备兔抗人ＩｇＧ的方法很多，但没有一个统一的具体方案，难以制备出理想的高效价抗体。我们根据抗体产生的基本原理，参照有关文献，探索出一种能得到高效价抗体的简易的方法，介绍如下：材料和方法１抗原制备参照文献［１、２］进行。选取多份健康人混合血清，新...

以pH敏感相分离高分子为载体的酶联荧光免疫分析法测定人IgG

pH敏感高分子因其独特的pH敏感性质而在药物的控制释放[1,2]、分子分离[3]以及生物传感器[4]等方面得到应用. 应用于免疫分析时, 要求pH敏感高分子在溶液pH 7.4左右波动时做出响应, 过多偏离生理pH会对免疫反应生成的抗原-抗体复合物造成不同程度的破坏. 目前, pH敏感高分子并未在免疫分析中广泛应用, 这主要是由于高分子的相转变pH大多在4或10左右[5,6]. 我们[7]曾合成了37 ℃下相转变pH在5.6左右的pH敏感高分子, 并将其作为免疫反应载体, 建立了乙肝表面抗原的分析系统, 虽然其相转变pH比以往的高分子更接近于中性[5], 但并没有达到生理pH值7.4范围, 分离时仍可能对免疫复合物造成一定的损害.

TPO模拟肽与人IgG1 Fc片段的融合表达及其生物学特性研究

依据本室获得的人TPO模拟肽序列 ,合成了该模拟肽的DNA序列 ,分别连接至 4种不同长度的人IgG1Fc基因片段的 5′端 ,并克隆至质粒表达载体pET2 8a(+) ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,筛选获得了 4种重组工程菌 ,其中3种分别高效表达了 3种不同长度的融合蛋白 ,而第 4种工程菌未表达。表达的 3种融合蛋白的分子量分别约为2 8kD、12kD和 12kD ,表达量约占菌体蛋白总量的 30 %左右 ,纯化获得了 3种TPO模拟肽融合蛋白。 3种融合蛋白均有较好的体外活性 ,维持TPO依赖细胞Ba F3-mp1生长的EC5 0分别为 :13、10、10nmol L。用血小板减少症小鼠动物模型 ,测定了它们的体内活性 ,3种融合蛋白均有升高血小板和缩短血小板恢复时间的功能 ,分别比TPO模拟肽活性提高了 18、8、8倍 ;而对白细胞及红细胞无显著影响。分别用 3种融合蛋白免疫BALB c小鼠 ,均未刺激小鼠产生抗TPO模拟肽抗体 ,并显示了较好的应用潜力。

点免疫金渗滤法筛选胶体金标记抗人IgG的研究

目的:应用点免疫金渗滤法筛选适宜胶体金标记的抗人IgG(以下简称二抗),并运用多个评价指标进行比较和分析。方法:选择三个不同公司的二抗用胶体金标记,根据棋盘滴定法确定最佳标记条件;运用点免疫金渗滤法对三种二抗的胶体金标记后检测效能进行比较,采用包虫病人和健康对照血清,用包虫病特异性抗原检测包虫病患者血清中的特异性抗体,评价最优的二抗,并与酶联免疫吸附测定法进行比较。结果:A、B、C三种二抗标记的最佳标记条件为:p H均为8.5,加入量分别为38.4、24、19.2μg/ml,综合评价二抗B检测效能最优。将其与酶联免疫吸附测定法检测效能进行比较,两种方法检测结果的Kappa=0.895(P<0.05),吻合度较强。结论:应用点免疫金渗滤法,以及本文提出的评价指标,能够筛选出最佳二抗,对检测试剂盒中二抗的选择具有重要的参考价值。

固体基质室温磷光免疫分析法测定人IgG

在聚酰胺膜 ( PM)等固体基质上 ,人免疫球蛋白 ( Ig G)能与异硫氰酸荧光素 ( FITC)标记的羊抗人抗体( GAHAb* )发生定量的特异性免疫反应 ,并保持了 FITC优良的室温磷光特性 ,据此建立了固体基质室温磷光免疫分析 ( SS-RTP-IA)测定人血清中人 Ig G的新方法 .在 0 .4μL(取样浓度为 1 .5 6～ 5 0 ng/m L)点样体积内 ,人 Ig G的含量在 0 .62 4～ 2 0 pg范围内 ,与室温磷光强度呈良好的线性关系 ,工作曲线的回归方程 ΔIp=31 .4 +4 6.2 lg[c( Ag) /pg],n=6.相关系数 r=0 .999,检出限 0 .32 pg.用于正常人血清中人 Ig G含量的测定 ,加标回收率为 96%～ 1 0 4 % ,结果满意 .

抗人IgG和抗人IgM单克隆抗体的特性鉴定及应用

目的:制备特异性高的抗人Ig G和抗人Ig M单克隆抗体,并应用于临床血清学检测试剂盒,为其提供优质的二抗。方法:以人Ig G和Ig M为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过传统杂交瘤融合和筛选技术制备抗人Ig G和抗人Ig M单克隆抗体;经体内诱生法制备腹水并纯化;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western印迹进行交叉筛选和特异性鉴定,并对筛选出的单抗进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,再与市售的检测病原微生物抗体试剂盒中对应的HRP标记的二抗(抗人Ig G和抗人Ig M)做对比分析。结果:筛选到2株可稳定分泌抗人Ig G单抗和2株抗人Ig M单抗,经交叉反应、Western印迹及对比实验分析,证明这4株单抗效价高、特异性好,比临床试剂盒中的酶标二抗特异性强、敏感度高。结论:获得4株特异性强、敏感度高的抗人Ig G和抗人Ig M单克隆抗体,可为各种病原微生物血清学的检测提供二抗试剂,具有良好的应用价值。

免疫亲和层析纯化兔抗人IgG

用人IgG-Sepharose 4B亲和柱,3mol/L氯化镁洗脱,一步纯化免抗人IgG血清,获得了SDS-PAGE电泳纯,免疫双扩散法效价达1/256,收率62.6%;用8mol/L脲洗脱,效价为1/128,收率34.1%.与硫酸铵多步沉淀法比较,纯度和效价大大提高,为获得高度特异、高亲和力兔抗人IgG提供了一条简便途径.

固相微球法人IgG放射免疫分析试剂盒的研制

采用氯胺 T法标记的人 12 5I- Ig G与人 Ig G(标准品或样品中人 Ig G)竞争结合人 Ig G微球抗体 ,直接离心分离 ,用于测定样品中的人 Ig G含量。经方法学鉴定 ,其灵敏度为 0 .3mg/ L,回收率为 10 0%～ 110 % ,零管结合率为 60 %～ 80 % ,非特异结合率 <2 .5% ,测量范围为 1.0～ 50 .0 mg/ L,批内变异系数为 3.1%～ 5.4 % ,批间变异系数为 4 .5%～ 7.2 % ,温育时间为 1h。

制备兔抗人IgG抗体的一种简便方法

我们采用中等剂量抗原免疫法，用加佐剂的纯化人IgG抗原对家兔足掌、皮下和肌肉多点注射进行基础免疫，用不加佐剂的单独人IgG抗原肌肉和皮下多点注射后，再经耳缘静脉注射进行加强免疫相配合，制备成高效价（1：32）兔抗人IgG抗血清。

抗人IgG-抗HRP双特异性单克隆抗体的研制及初步应用

用8－AG（8－氮杂鸟嘌呤）驯化的HRP－MCAb（抗辣根过氧化物酶单克隆抗体）杂交瘤细胞HAT（次黄嘌呤氨基喋呤胸苷）敏感株与人IgG免疫的BALB／c小鼠脾细胞进行二次融合，获得5株能稳定分泌抗人IgG－抗HRP的BsMcAb（双特异性单克隆抗体）杂交－杂交癌细胞，用其混合腹水经HRP亲和层析纯化的BsMcAb制备BsMcAbPAP（双特异性单抗过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物）试剂代替丙肝诊断试剂盒中酶标二抗，比较结果初步表明两者差异无显著意义，将为IgG的检测提供有用试剂。

N-琥珀酰亚胺-3-碘[^(125)I]苯甲酸酯标记人IgG

研究能有效降低抗体的体内脱碘的标记方法。碘标记N-琥珀酰亚胺-3-(三正丁基锡)苯甲酸酯(ATE)前体,得到N-琥珀酰亚胺-3-碘[125I]苯甲酸酯(S125IB),分别与人IgG和抗人肝癌单抗(Hepama-1)进行偶联,探索最佳标记条件,并测定标记物的稳定性和生物活性,研究直接标记和间接标记的Hepama-1在正常小鼠体内的生物学分布。结果表明,用N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)法125I标记ATE前体,在ATE用量为25～100μg、NCS用量为10～20μg、磷酸盐缓冲溶液(PBS)用量为10～20μL、反应时间为5 min时,标记率大于95%;S125IB和人IgG的偶联率最高可达75%,偶联产物稳定性、生物活性良好;与Hepama-1偶联率可达75%以上。生物分布的对比实验证明,1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯甘脲(Iodogen)直接标记的Hepama-1在甲状腺的放射性摄取率(脱碘显示)最高是S125IB间接标记的Hepama-1的87.9倍。这说明以ATE为前体的放射性碘间接标记蛋白质方法与传统的碘直接标记方法相比较,在解决体内严重脱碘问题上具有明显的优越性。

以人IgG作免疫原同时获取抗人γ重链及κ、λ轻链单克隆抗体的研究

本文报道用纯化的IgG免疫BALB/c小鼠,同时获得抗人γ重链及抗κ、λ轻链三种单克隆抗体。经鉴定,抗人γ重链McAb只与IgG反应,不与其它Ig及轻链反应。抗κ及λ链McAb除分别与游离的κ、λ轻链反应外,也与和Ig分子中重链结合的κ、λ反应。免疫电转印法测定,抗γ链McAb识别分子量为50KD的重链抗κ、λMcAb识别分子量为22KD的轻链。将所得抗κ、λ单克隆抗体分别与正常人周血单个核细胞进行反应,染色结果表明κ链表达与λ链表达细胞之比为2∶1;两种抗体配对混合后的反应结果与多克隆抗体Sm Ig一致。实验结果表明所获抗体符合抗γ、κ、λ单克隆抗体的特点。

电位型无标记IgG免疫探针测人IgG

以 Pt 为基体电极,用戊二醛交联法在 Pt 电极上固定兔抗人 IgG 抗体,制成 IgG 免疫探针。根据人免疫球蛋白(IgG)能与兔抗人 IgG 抗体发生定量的特异性免疫反应,利用电化学方法,找到了测定人血清中 IgG的简单方法。人 IgG 的含量在0.2～1.2μg/L 之间,与兔抗人 IgG 免疫探针的电位变化值(△E)呈良好的线性关系。工作曲线的回归方程△E=23.0 c+9.733,相关系数 r=0.9986,检测下限小于0.2μg/L。用于正常人血清中 IgG 含量的测定,加标回收率为95%～103%,结果满意。

抗人IgG-十八胺LB生物膜的制备及其应用

将抗人IgG溶液直接分散于含有十八胺(ODA)的亚相上制备抗人-脂类LB生物膜.通过实验结果得到最佳实验条件.将抗体-脂类膜作为选择元件,用石英晶体微天平(QCM)作为转换器制成免疫生物传感器.此传感器对人IgG的检测响应范围是200ngcm-3～1200ngcm-3.由于此方法用抗体量少且操作简单,可为制备经济方便的免疫传感器提供可能.

异硫氰酸荧光素发光纳米微球标记双抗夹心固体基质室温燐光免疫分析法测定人IgG

基于Sol-gel技术合成了粒径为20nm、包含了异硫氰酸荧光素（FITC）的SiO2纳米微球（简写作FITC-SiO2）.该发光纳米微球在聚酰胺膜（ACM）基质上可发射强而稳定的室温燐光.研究发现,由该发光微球标记的羊抗人IgG抗体（简记为FITC-SiO2–Ab1）,不仅能在ACM固体基质上与人IgG发生定量的特异性免疫反应,并能在免疫反应后保持优良的燐光特性,且室温燐光信号进一步增强.据此建立了固体基质室温燐光免疫分析（SS-RTP-IA）测定人IgG的一种新方法.本方法线性范围为0.08~20.0pg人IgG/斑（样品体积0.4μL/斑,对应浓度0.20~50.0 ng/mL）,工作曲线的回归方程△Ip=19.97＋15.92mIgG（pg/斑）、相关系数r=0.9997,按3Sb/k计算本方法的灵敏度,其检出限为0.015 pg/斑.与用FITC标记羊抗人IgG的方法相比,灵敏度有较大提高.分别对0.20和50.0ng/mL样品重复测定11次,RSD为3.45%和4.1%,表明本方法的重现性好.

CRM9与兔抗人IgG连接方法探讨

目的:用直接偶联法构建新型蛋白兔抗人IgGCRM9.方法:分别应用异型双功能连接剂(m Maleimido benzoyl N hydoxysuccinimideester,MBS)和N琥珀酰亚胺3(2吡啶二巯基)丙酸盐(SPDP)将兔抗人IgG多抗和白喉毒素突变体(CRM9)进行连接,制备出新的蛋白.结合后的蛋白经SephacrylS300分离纯化,用聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳证明二者的结合情况.采用酶联免疫法检测IgG与CRM9按不同比例反应后所构建的蛋白复合体中抗体部分的活性.结果:用MBS连接剂连接IgG与CRM9后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示出的条带明显滞后于IgG所显示的条带,而在琼脂糖凝胶电泳中IgG与CRM9混合反应的样品所显示的两条条带均与IgG和CRM9单独所在的条带一致.酶联免疫实验测得的各组A450nm值表明,IgG与CRM9按1∶1和1∶3两种比例制备的样品对抗体活性影响最小,而按1∶5和1∶两种比例制备的蛋白,抗体活性受到很大的抑制.结论:兔抗人IgG与CRM9可以通过MBS结合,二者在1∶1～1∶3之间的比例时,可以有较好的连接,而且对抗体活性的影响最小.SP DP则不适用于本实验中的两种蛋白的连接.这将为免疫毒素的新型连接提供有效的方法.

用酶标抗人IgG单克隆抗体直接ELISA法检测微量血痕种属的研究

用酶标抗人ＩｇＧ单克隆抗体直接ＥＬＩＳＡ法检测微量血痕种属的研究湖南省公安科研所（４１０００６）聂绍禄单克隆抗体问世以来，已在法医学中开始进行应用研究，它的主要特征是具有高度的特异性和敏感性，据Ｔａｉｎａｌｃｍ等（１９８４）报道指出，抗人ＭｃＡｂ与常...

甲亢患者红细胞结合荧光标记羊抗人IgG值的测定及其临床意义(附34例病例分析)

本文应用荧光免疫技术测定了34例甲亢患者的红细胞IgG值,同时观察了抗甲状腺球蛋白抗体及抗甲状腺微粒体抗体,结果显示:甲亢患者红细胞抗体结合值高于正常对照组(P<0.01),支持甲亢存在多种免疫异常的观点。

抗人IgG_4单克隆抗体用于ELISA法诊断血吸虫病与疗效考核的研究

目的探讨检测特异性IgG4诊断血吸虫病的效果及疗效考核价值。方法采用SEA间接ELISA法检测血吸虫病人血清中的特异性IgG和IgG4抗体及对肺吸虫、肝吸虫病人和健康人血清的交叉反应以及血吸虫病人治疗后不同时期特异性IgG和IgG4抗体的变化。结果血吸虫病人血清中IgG4敏感性为93.02%,特异性为100%,而IgG抗体的敏感性为95.35%,特异性为97.62%,IgG4与IgG无论其敏感性还是其特异性差异均无显著性(P>0.05),与其它寄生虫病的交叉反应,IgG4显著低于IgG且差异显著(P<0.05),血吸虫病人治后6个月IgG4抗体阴转率显著高于IgG(P<0.05),治后12个月IgG4的阴转率与IgG比较差异非常显著(P<0.01)。结论ELISA法检测特异性IgG的诊断效能与IgG4相似,而特异性IgG4抗体可能系一短程抗体,用于评价疗效更具实际应用价值。

将抗体库所获抗HBs Fab转换为全长人IgG

目的:将大肠杆菌表达的抗乙肝表面抗原(HBs)人Fab转换为真核表达的全长人lgG1.方法:用重叠PCR法将人工合成的人V_k前导序列拼接到抗HBs的VH和V_k上,构建人IgGl真核表达载体,转染真核细胞,通过ELISA、RT-PCR、免疫印迹检测抗HBs人IgG的表达.结果:用轻链和重链同时表达的单一载体在CHO细胞中获得了抗HBs人lgG表达.结论:通过噬菌体抗体库所获Fab段可通过拼接人V_k前导序列在真核获得功能性表达.