OX40-IgG1融合基因重组表达载体的构建及鉴定

目的:构建含人OX40-IgG1融合基因的真核表达载体pDC315-OX40Ig,表达具有生物学活性的OX40Ig融合蛋白,为诱导异体复合组织移植免疫耐受的基因治疗作准备。方法:全基因合成目的基因OX40Ig,即人OX40胞外段序列及人IgG1 Fc段序列,将该片段插入到pUC57(+)载体后,亚克隆至真核表达载体pDC315(+),构建pDC315-OX40Ig重组质粒。构建的重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定后,用脂质体法转染于NI H/3T3细胞。以SDS-PAGE与Western Blotting检测细胞培养上清中OX40I g融合蛋白的表达情况;MTT法观察OX40Ig对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用。结果:合成的目的基因全长1320bp,构建的重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定正确。SDS-PAGE与West ern Blotting证实OX40Ig融合蛋白在3T3细胞中实现表达,表达产物相对分子量为48000左右,与理论预期值相符。体外实验证实OX40Ig蛋白能够抑制异基因淋巴细胞的MLR。结论:成功构建了人OX40-IgG1融合基因真核表达载体pDC315-OX40Ig,体外实验证实表达的OX40Ig蛋白可抑制淋巴细胞增殖,为干预同种异体复合组织移植排斥反应奠定了基础。

重组腺病毒载体AdOX40Ig的构建、表达及相关体外实验

目的:构建并鉴定含人OX40-IgG1融合基因的重组腺病毒载体,并感染人肝HL-7702细胞,筛选出最佳感染剂量并检测OX40Ig的表达情况,为进一步用于器官移植后的抗排斥治疗奠定基础。方法:根据基因库公布的人OX40和hIgG1 Fc片断序列设计特定引物,通过聚合酶链反应扩增并鉴定后,酶切插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中。随后与pAdeasy-1腺病毒质粒以氯化钙法共转化BJ5183感受态细胞,重组质粒经鉴定正确后,大量扩增为腺病毒载体。再经293A细胞包装、扩增并纯化后感染HL-7702肝细胞,筛选出最佳感染剂量,并采用间接免疫荧光法检测其中外源性OX40Ig基因的表达,采用ELISA法测定肝HL-7702细胞上清中OX40Ig蛋白的含量。结果:转移质粒pTOX40Ig经酶切及测序鉴定正确。重组腺病毒质粒经酶切鉴定正确,并成功转染了293A细胞。得到的病毒液经纯化扩增后进一步感染肝HL-7702细胞,经筛选,10 MOI为最佳感染剂量,并且可以检测到OX40Ig目的基因及其蛋白的表达。结论:成功构建了重组腺病毒载体AdOX40Ig,并且可在肝细胞HL-7702中表达相应的目的基因及蛋白。

人肿瘤坏死因子可溶性受体Ⅰ与人IgG∶Fc的融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

采用ＰＣＲ方法引入编码氨基酸残基序列为ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ的接头，将ｓＴＮＦＲ１ｃＤＮＡ与人ＩｇＧ：ＦｃｃＤＮＡ片段连接，构成融合基因ｆｕｓｉｏｎ１。将ｆｕｓｉｏｎ１克隆在ｐＢＳⅡＳＫ＋载体上。测定序列后，转入ｐＲＳＥＴＢ表达载体，在大肠杆菌中表达，得到分子量为４５ｋＤａ的蛋白，超声破碎后电泳证明表达的蛋白为包涵体，经免疫蛋白印迹证实为我们构建的融合蛋白。

OX40Ig修饰大鼠脂肪间充质干细胞的实验研究

目的构建含OX40融合蛋白(^(OX40Ig))基因修饰的大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)即ADSCs^(OX40Ig),探讨其在体外对淋巴细胞的免疫调节作用。方法构建pcDNA3.1(+)/^(OX40Ig)融合基因表达载体,采用核转染技术转染大鼠ADSCs,Western blot检测ADSCs中^(OX40Ig)表达水平。ADSCs与大鼠异基因淋巴细胞共培养后分为对照组(反应细胞+刺激细胞)、ADSCs组(反应细胞+刺激细胞+ADSCs)及ADSCs^(OX40Ig)组(反应细胞+刺激细胞+ADSCs^(OX40Ig)),MTT法检测淋巴细胞增殖抑制率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测淋巴细胞内干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-10及转化生长因子(TGF)-βmRNA表达。结果经测序鉴定验证,pcDNA3.1(+)/^(OX40Ig)质粒构建成功,转染ADSCs后^(OX40Ig)蛋白呈高表达;与ADSCs组比较,ADSCs^(OX40Ig)显著增强异基因淋巴细胞增殖抑制率(P<0.05);对照组、ADSCs组及ADSCs^(OX40Ig)组的IFN-γmRNA相对表达水平依次降低,而IL-10、TGF-βmRNA相对表达水平依次升高(P<0.05)。结论ADSCs^(OX40Ig)较单纯ADSCs能更好地发挥对异基因淋巴细胞的免疫调节作用。

体外阻断CD134对LN患者外周血单个核细胞T_H1/T_H2细胞因子表达的影响

目的探讨CD134/CD134L共刺激分子对TH1/TH2细胞因子表达的影响及在狼疮性肾炎(LN)发病机制中的可能作用。方法活动期LN患者10例,分别采取外周静脉血,用密度梯度离心法制备新鲜PBMC,分成6组:(1)对照培养组;(2)单纯刺激组;(3)抗CD134组;(4)抗IL-4组;(5)rh-CD134∶Fc组;(6)地塞米松(Dex)组。另选取10例健康体检者作为健康对照组。采用ELISA法分别测定培养液上清中IFN-γ、IL-4、IL-10表达水平。结果(1)在抗CD3ε单抗PrIL-2刺激前,活动期LN患者PBMC培养液上清分泌的IFN-γ、IL-4和IL210水平都明显高于健康对照组;(2)在抗CD3ε单抗PrIL-2刺激下,活动期LN患者PBMC分泌的IFN2γ、IL-4和IL-10又较刺激前明显增加;(3)抗IL-4单抗、抗CD134单抗均可使经抗CD3ε单抗PrIL22刺激的LN患者PBMC分泌IL24、IL210水平显著下降,导致IFN2γ水平显著增高,免疫应答朝TH1方向偏离;(4)Dex能显著抑制抗CD3ε单抗PrIL22刺激的原代培养PBMC中IL24、IFN2γ的分泌水平,但对IL210的产生并没有明显的抑制或促进作用;(5)rhCD134∶Fc能显著降低抗CD3ε单抗PrIL-2刺激的原代培养PBMC中IFN-γ及IL-4、IL-10的分泌水平,对TH1和TH2细胞因子的产生都有显著抑制作用。结论糖皮质激素的抗炎机制具有多重性,对TH1、TH2细胞因子的作用并不均衡;抗CD134单抗对减轻LN患者PBMC的异常活化有一定作用;CD134-IgG融合蛋白与抗CD134单抗相比,抑制作用更明显,对急性期LN有更好的治疗作用。