补骨脂素通过炎症和Ras/Raf1介导对类风湿关节炎大鼠的保护作用

目的:研究补骨脂素减少炎症和抑制Ras/Raf1表达保护类风湿关节炎大鼠的机制。方法:将SD大鼠分成对照组、模型组(类风湿关节炎大鼠模型)、补骨脂素低剂量组(22 mg/kg补骨脂素处理)、补骨脂素中剂量组(44 mg/kg补骨脂素处理)、补骨脂素高剂量组(88 mg/kg补骨脂素处理)、补骨脂素高剂量+NC组(88 mg/kg补骨脂素+阴性对照慢病毒载体处理)、补骨脂素高剂量+Ras组(88 mg/kg补骨脂素+Ras过表达慢病毒载体处理);采用Western Blotting检测大鼠的肾素-血管紧张素系统(RAS)、原癌基因丝苏氨酸蛋白激酶-1(Raf1)、成骨细胞特异性转录因子(Osx)、Ⅰ型胶原蛋白α1链(COL1A1)、骨钙素(OC)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)蛋白表达;检测关节肿胀度,HE染色对关节组织病理评分,ELISA法检测炎症介质白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平。结果:与对照组比较,模型组大鼠关节组织中Ras、Raf1、MMP-3、MMP-13蛋白表达以及关节肿胀度、关节组织病理评分和IL-2、TNF-α、IL-6水平均升高,Osx、COL1A1、OC蛋白表达均降低(均P<0.05);与模型组比较,补骨脂素低、中、高剂量组大鼠关节组织中除Osx、COL1A1、OC蛋白表达均升高外,其他指标均显著降低(均P<0.05);与补骨脂素高剂量+NC组比较,补骨脂素高剂量+Ras组大鼠关节组织中Osx、COL1A1、OC蛋白表达均降低,而其他指标均显著升高(均P<0.05)。结论:补骨脂素通过减少炎症和抑制Ras/Raf1表达减轻类风湿关节炎大鼠关节损伤,促进软骨修复。

与膜联蛋白A1抗炎作用相关的信号通路研究进展

膜联蛋白A1(AnxA1)是一类钙依赖的膜磷脂结合蛋白超家族,作为先天免疫系统和适应性免疫系统的关键调节蛋白,在调控抗炎反应、细胞分化、增殖、凋亡以及吞噬清除凋亡细胞等细胞生命活动中发挥重要作用。AnxA1与甲酰基肽受体家族受体结合后,通过调控磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、Gq/磷脂酶C(PLC)/蛋白激酶C(PKC)信号通路,调控炎症细胞的黏附、趋化、聚集以及凋亡细胞的吞噬,同时降低炎症因子的产生,在炎症发生、发展及消退过程中发挥重要作用。对AnxA1在抗炎方面信号通路的作用及机制的深入了解,有助于开发AnxA1调控的各种信号通路为靶点的药物,为临床治疗提供新的思路。

巨噬细胞过表达miR-125b促进其凋亡

目的探讨肺结核患儿外周血单个核细胞(PBMC)中miR-125b和靶基因Raf1原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RAF1)表达;观察miR-125b对巨噬细胞凋亡和细胞活力的调节。方法收集和分离肺结核患儿和健康儿童的PBMC,采用荧光定量PCR检测miR-125b和RAF1的mRNA表达水平,Western blot法检测RAF1的蛋白水平。THP-1巨噬细胞分别转染miR-125b模拟物(miR-125b mimic)、阴性对照模拟物(NC-mimic)、miR-125b抑制物(miR-125b inhibitor)以及阴性对照抑制物(NC-inhibitor),共培养48 h;利用Western blot法检测THP-1巨噬细胞中RAF1表达,异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡,CCK-8法检测细胞活力。结果在结核患儿PBMC的miR-125b表达下调,RAF1的mRNA和蛋白水平都升高。在THP-1巨噬细胞中过表达miR-125b时,RAF1表达下调,促进巨噬细胞凋亡,降低细胞活力;在THP-1巨噬细胞中miR-125b表达被抑制时,RAF1表达升高,抑制巨噬细胞凋亡,提高细胞活力。结论结核患儿PBMC中miR-125b水平降低,上调THP-1巨噬细胞miR-125b水平促进巨噬细胞凋亡并抑制细胞活力。

去卵巢大鼠海马CA1／CA2区ERK1／2的基础活性和诱导活性降低

目的:观察去卵巢大鼠空间学习记忆能力的变化与海马中胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)通路的关系。方法:雌性SD大鼠随机分为假手术组和去卵巢组,饲养4个月后采用Morris水迷宫测试空间学习记忆能力,于测试前将各组组内又分为训练组和非训练组,训练组用于测定经学习记忆训练诱发的ERK1/2的诱导活性,非训练组用于测定未经学习记忆训练时的ERK1/2的基础活性,Western blot方法检测海马CA1/CA2区p-ERK1/2蛋白及Raf激酶抑制蛋白(RKIP)的变化。结果:①与假手术组比较,去卵巢组大鼠的空间学习记忆能力明显下降(P<0.05)。②各组中的训练大鼠p-ERK1/2蛋白水平明显高于非训练大鼠(P<0.05)。③去卵巢组训练及非训练大鼠的p-ERK1/2蛋白水平均相应低于假手术组训练及非训练大鼠(P<0.05)。④去卵巢组RKIP蛋白表达水平明显高于假手术组(P<0.05)。结论:雌激素缺乏大鼠的空间学习记忆能力下降与海马CA1/CA2区ERK1/2通路的基础和诱导活性降低以及该通路的抑制蛋白RKIP的表达增加有关。

ERK1/2通路及其介导多发性硬化发病的研究进展

丝裂原活化蛋白激酶1/2(ERK1/2)通路是第一个被发现的细胞信号转导通路,由Ras、Raf、MEK1/2和ERK1/2组成。ERK1/2通路激活后可以将细胞外信号从细胞膜转到细胞核,参与了细胞的多种生理病理功能,如细胞的生长、增殖、分化和凋亡等,并且与多种疾病的发病有关,包括多发性硬化(MS)和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。ERK1/2通路的激活可以引起星形胶质细胞、MG、T细胞、巨噬细胞等活化,释放多种炎性因子,引起髓鞘损伤,导致MS/EAE的发病。多项研究表明,通过抑制ERK1/2通路可以减少炎性因子的释放,减轻髓鞘损伤,改善MS/EAE的病情,为治疗MS药物的开发提供了重要的靶点。

甲状腺乳头状癌BRAF基因突变及BRAF、MUC15、RKIP蛋白表达的临床意义

目的探究甲状腺乳头状癌(PTC)鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)基因突变及BRAF、粘蛋白15(MUC15)及Raf激酶抑制蛋白(RKIP)表达的临床意义。方法 PTC组织标本56例作为研究组(A组),另选滤泡状癌组织标本18例(B组)、甲状腺腺瘤组织标本13例(C组)、结节性甲状腺肿组织标本7例(D组)作为对照。应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)PCR产物测序检测上述组织中BRAF基因突变情况,应用免疫组化法分析组织中BRAF、MUC15、RKIP蛋白表达情况。采用四格表χ2检验(或校正χ2检验)和R×C表有序资料的线性趋势χ2检验进行关联性分析。结果 A组56例PTC组织中检测到24例BRAF 15外显子有T1799A杂合突变(BRAFV600E突变),突变率42.86%;在BRAF 11外显子上未检测到突变病例;B、C、D组患者组织中均未检测到BRAF基因突变。随着临床分期的增高(Ⅰ期→Ⅱ期→Ⅲ期→Ⅳ期),PTC组织中BRAF基因突变率逐步升高(7.14%→8.33%→61.11%→91.67%,χ2=27.255,P=0.000)。有淋巴结转移PTC患者BRAF 15外显子基因突变率(57.58%)较无淋巴结转移患者(21.73%)显著增加(χ2=7.108,P=0.008)。A组患者组织中BRAF、MUC15、RKIP蛋白表达阳性率分别为71.43%、76.79%、12.50%。BRAF、MUC15、RKIP蛋白阳性表达率在A、B、C、D组间比较,差异均有统计学意义(P均<0.01)。与无淋巴结转移患者比较,有淋巴结转移患者BRAF和MUC15蛋白阳性表达率显著增高(P均<0.01),RKIP蛋白阳性表达率显著降低(P<0.05)。PTC组织中BRAF和MUC15蛋白阳性表达率随临床分期的增高(Ⅰ期→Ⅱ期→Ⅲ期→Ⅳ期)逐步升高(χ2=12.658,P=0.005;χ2=20.047,P=0.000);RKIP蛋白阳性表达率的降低则与临床分期的增高无相关性(χ2=6.005,P=0.111)。BRAF蛋白表达与BRAF基因突变有关(χ2=14.439,P=0.000);而MUC15和RKIP蛋白表达与BRAF基因突变无相关性(P均>0.05)。结论 BRAF基因在PTC中易发生V600E型突变,其突变可能通过上调BRAF蛋白表达,参与PTC发生进展和淋巴结转移过程。PTC组织中MUC15蛋白表达的上调及RKIP蛋白表达的下调也参与PTC淋巴结转移过程。

人RAF1-RAS结合域蛋白的纯化及功能验证

目的纯化人RAF1(RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase)-RAS(rat sarcoma)结合域(RAF1-RAS binding domain,RAF1-RBD)蛋白并验证其功能。方法采用PCR法以人乳腺文库cDNA为模板扩增获得RAF1-RBD序列,将其插入至大肠杆菌表达载体pGEX-KG(带GST标签),获得pGEX-KG-RAF1-RBD重组质粒;转化该质粒至感受态细菌BL21(DE3),小量诱导并通过Western印迹法检测其表达;然后采用GST微珠纯化该蛋白;利用GST pull-down技术验证其与HRAS(Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog)蛋白相互作用。结果双酶切鉴定及基因测序结果均表明成功构建重组质粒pGEX-KG-RAF1-RBD;Western印迹分析及SDS-PAGE方法检测结果说明重组蛋白相对分子质量(Mr)约42 000,与预期大小一致;GST pull-down技术证明RAF1-RBD与HRAS在体外能够结合。结论纯化的人RAF1-RBD蛋白与HRAS在体外存在相互作用。

GRP75经由Raf/Mek/Erk1/2信号转导通路抑制缺糖诱导的细胞凋亡

本文旨在探讨促存活信号通路Raf/Mek/Erk1/2是否参与了葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated protein75,GRP75)对缺糖诱导的细胞凋亡的抑制作用。GRP75过表达的PC12细胞给予Raf/Mek/Erk1/2通路抑制剂U0126预处理之后,无糖培养6、12和24h,同时以DMSO预处理的GRP75过表达PC12细胞组为对照。Western blot检测Erk1/2的磷酸化和表达水平,MTT实验检测细胞存活率,Hoechst 33258染色观察凋亡细胞核的形态学改变,流式细胞仪检测细胞亚二倍体峰,免疫荧光检测细胞色素c(cytochrome c,Cytc)向胞浆的弥散情况。结果显示:U0126在没有影响Erk1/2表达水平的前提下,阻断了GRP75对Erk1/2磷酸化水平的维持;U0126处理组的凋亡率明显高于对照组;U0126处理组Cytc从线粒体向胞浆释放的时间明显早于对照组,同时Cytc向胞浆的弥散程度大于对照组。以上结果提示,U0126通过抑制Erk1/2磷酸化,阻断了缺糖状态下GRP75对Cytc释放和细胞凋亡的抑制作用,这表明GRP75是通过Raf/Mek/Erk1/2级联反应抑制缺糖诱导的线粒体凋亡途径的进程。

蛋白激酶A(PKA)介导的信号通路:正调节还是负调节?

蛋白激酶A是由 2个调节亚基与 2个催化亚基构成的异四聚体 .在不同的组织中 ,PKA可以起着不同的调节作用 ,如生长、分化和特定基因的表达 .在免疫系统中 ,PKA介导了一个普遍性的抑制性信号 ,对维持免疫系统的稳定起着重要的作用 .PKA通过对Raf 1的磷酸化抑制了Raf 1的激活 ,从而阻断了Ras/Raf 1 /MEK/MAPK信号通路的激活 ,抑制细胞的增殖 .在转录因子的调节方面 ,PKA可以激活CREB而促进了含CRE基因的转录 ;但它同时却抑制了NF kB的活性而介导了细胞因子等表达的抑制 .

稳定表达RKIP对新城疫病毒复制的影响

为了研究Raf激酶抑制蛋白(RKIP)对新城疫病毒(NDV)复制的影响,从鸡胚成纤维细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增RKIP基因,将其克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,经PCR、双酶切和测序鉴定,采用Fu-GENE HD法将阳性质粒转染Vero细胞,经G418筛选,有限稀释法获取单克隆细胞株,Western-blotting检测RKIP的表达。利用Real-time PCR测定病毒感染细胞后培养上清的病毒量。结果表明:成功构建鸡RKIP真核表达质粒;转染Vero细胞后经克隆化培养获得稳定表达鸡RKIP的细胞株Vero-RKIP;感染初期,NDV在Vero-RKIP上表现出了更强的复制能力。

内源性孤啡肽通过RKIP影响大鼠缺血性心律失常的发生

目的探讨内源性孤啡肽(N/OFQ)是否通过Raf激酶抑制蛋白(RKIP)影响急性心肌缺血大鼠心律失常及心肌细胞膜表面β1-肾上腺素能受体(β1-AR)的表达.方法①实验一:按随机数字表法将30只6周龄成年雄性SD大鼠分为假手术组〔Sham组,只开胸不结扎冠状动脉(冠脉)〕、心肌缺血模型组(结扎冠脉左前降支)、内源性N/OFQ拮抗剂UFP-101预处理组(UFP-101组,术前10 min经尾静脉注射1 mL/kg UFP-101),每组10只.记录各组大鼠术后15 min内心律失常结果;术后15 min取缺血心肌,采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测磷酸化RKIP(p-RKIP)表达.②实验二:按随机数字表法将30只4周龄雄性SD大鼠分为UFP-101对照组、RKIP过表达组、RKIP拮抗组,每组10只.UFP-101对照组每日腹腔注射玉米油,其余两组注射RKIP上调剂香蜂草苷(Didymin),3组大鼠饲养4周后均行冠脉结扎,并均于术前10 min经尾静脉注射UFP-101.其中RKIP拮抗组术前2 h腹腔注射RKIP特异性拮抗剂洛法他丁(locostatin).记录各组大鼠术后15 min内心律失常结果;Western Blot法检测术后15 min时心肌组织p-RKIP表达及心肌细胞膜表面β1-AR表达.结果①实验一:与Sham组比较,模型组和UFP-101组室性期前收缩(VEB)、室性心动过速(VT)、心室纤颤(VF)发生明显增多,心律失常评分明显升高;此外,与Sham组相比,模型组心肌组织p-RKIP表达升高,UFP-101组心肌组织p-RKIP表达下降.与模型组比较,UFP-101预处理可显著减少心律失常发生〔心律失常评分(分):1.5(0.3,5.0)比4.0(2.0,5.0),P<0.05〕,心肌组织p-RKIP表达明显下降(p-RKIP/总RKIP:0.20±0.11比0.43±0.11,P<0.05).说明拮抗N/OFQ能降低RKIP的磷酸化,减少心律失常发生.②实验二:与UFP-101对照组相比,RKIP过表达可显著增加心律失常事件发生,心肌细胞膜表面β1-AR表达也明显增多;而拮抗RKIP过表达可使心律失常的发生有所缓解〔心律失常评分(分):3.0(2.0,3.0)比4.0(2.0,5.0),P<0.05〕,并且明显减少心肌细胞膜表面β1-AR的表达(β1-AR/Na+-K+-ATP酶:0.88±0.09比1.02±0.08,均P<0.05),而总RKIP表达差异无统计学意义(总RKIP/GAPDH:5.40±0.21比5.36±0.19,P>0.05).说明内源性N/OFQ通过RKIP影响大鼠缺血性心律失常和心肌细胞膜表面β1-AR表达.结论内源性N/OFQ可通过增加RKIP磷酸化表达来影响大鼠缺血心肌细胞膜表面β1-AR的表达及心律失常.