人Sox10基因启动子区高甲基化的预测和验证

目的运用生物信息学方法预测人Sox10基因启动子区甲基化情况并进行实验验证。方法从GenBank获取人Sox10基因序列,利用Methyprimer 11.0软件、Li lab、CpG Island Searcher预测其启动子区CpG岛。进一步运用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)和重亚硫酸盐测序(bisulfite sequencing PCR,BSP)方法检测人Sox10基因启动子区CpG岛在多形性胶质母细胞瘤和瘤周组织中的甲基化情况。结果经过生物信息学分析发现,人Sox10基因启动子区存在2个CpG岛,分别为165(1 241～1 405)bp和105(1 478～1 582)bp。针对这两个CpG岛设计引物行MSP和BSP实验,研究发现,在人多形性胶质母细胞瘤和瘤周组织中Sox10基因启动子区CpG岛均出现部分甲基化,其中在多形性胶质母细胞瘤中的甲基化率为90.5%,在瘤周组织中的甲基化率为28.5%。结论本研究证实了人Sox10基因启动子区CpG岛在多形性胶质母细胞瘤中出现高甲基化,提示其表达下调可能受甲基化调节。

绵羊脂肪组织AGPAT2基因启动子区DNA甲基化及其表达研究

为研究绵羊脂肪沉积过程与AGPAT2基因启动子区DNA甲基化水平及其表达的相关性,本研究以尾型不同的湖羊与广灵大尾羊的尾部脂肪组织为实验材料,通过生物信息学软件和亚硫酸氢盐测序(Bisulfite Genomic Sequencing PCR,BSP)分析AGPAT2启动子区序列的CpG岛和甲基化水平;以qPCR技术检测绵羊尾部脂肪组织中AGPAT2基因的表达水平。结果表明,AGPAT2启动子区存在CpG岛;在尾部脂肪组织中,湖羊与广灵大尾羊的AGPAT2基因启动子区的目的片段甲基化率分别为90.5%和76.2%;湖羊AGPAT2基因启动子区中的目的序列发生甲基化位点高于广灵大尾羊;广灵大尾羊AGPAT2mRNA的相对表达量在绵羊尾部脂肪组织中极显著高于湖羊;对AGPAT2启动子区的甲基化水平与其表达水平进行Pearson相关系数分析可知,二者呈中度负相关(r=-0.364,P=0.478)。综上所述,本研究揭示AGPAT2基因在转录水平的表达受启动子区甲基化的负调控,从而推测AGPAT2基因的DNA甲基化水平与绵羊的脂肪沉积过程具有一定的相关性。

肾细胞癌组织中RASSF10基因表达及其启动子区甲基化变化的意义

目的观察肾细胞癌(RCC)组织中RASSF10基因表达及其启动因子区甲基化的变化,并探讨其意义。方法采用RT-PCR技术、甲基化特异性聚合酶链反应检测52例RCC组织及其相应癌旁组织、正常组织中RASSF10 mRNA相对表达量及其甲基化率,并分析RASSF10基因表达变化、启动子区甲基化与RCC患者病理特征的关系,分析RASSF10基因启动子区甲基化与其表达的关系。结果 RCC组织中RASSF10 mRNA相对表达量、甲基化率与癌旁及正常组织比较,P均<0.05。RASSF10基因表达及其启动子区甲基化率与患者年龄、病理类型、肿瘤大小、Fuhrman分级无关(P>0.05),与肿瘤TNM分期有关(P均<0.05)。RASSF10基因启动子区甲基化的RCC患者RASSF10 mRNA相对表达量与未甲基化患者比较,P<0.05。结论 RCC组织中RASSF10基因低表达可能与其启动子区高甲基化有关;RASSF10基因低表达及其启动子区甲基化可能参与了RCC的发生发展。

乳腺癌发生模型MCF10各阶段细胞系中TIMP3基因启动子区甲基化分析

目的探讨抑癌基因TIMP3失活与乳腺癌发生和进展的关系。方法用甲基化特异性PCR技术和亚硫酸盐测序技术检测乳腺癌发生模型MCF10的增生细胞系MCF10A、癌前细胞系MCF10AT、导管内癌细胞系MCF10DCIS.com、浸润癌细胞系MCF10CA1a和转移癌细胞系MCF10CA1d、MCF10CA1h中TIMP3启动子区甲基化状态。结果甲基化特异性PCR分析显示,在上述各细胞系中,TIMP3启动子区均呈高度甲基化状态。亚硫酸盐测序显示,在上述各细胞系中,测序区内的68个CG位点几乎全部发生了甲基化,且甲基化累及了绝大部分等位基因。结论TIMP3基因启动子区甲基化在乳腺癌的发生和进展中起重要作用,可能成为早期诊断乳腺癌和判断乳腺癌预后的分子生物学标记。

MGMT基因启动子区甲基化测序分析与前列腺癌研究

目的研究前列腺癌组织中MGMT基因启动子区CpG甲基化表型情况,分析其与前列腺癌之间的关系,探讨前列腺癌早期筛选和诊断的方法。方法应用亚硫酸盐修饰后测序法检测30例前列腺癌组织及20例前列腺增生组织中MGMT基因启动子区CpG甲基化表型情况。结果基因测序结果显示MGMT基因在前列腺癌及前列腺增生组织中CpG位点甲基化率分别为22.9%、10.6%,两者甲基化率比较,P<0.05。结论前列腺癌组织中MGMT基因启动子区甲基化程度显著增高,应用BSP检测相关基因甲基化状态,有可能成为筛选和诊断前列腺癌的重要方法;MGMT基因启动子区甲基化率在不同前列腺癌的危险因素分期中差异无统计学意义。

骨髓增生异常综合征患者血浆DNA中FHIT基因启动子区甲基化状态及地西他滨的去甲基化作用

本研究旨在检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者血浆DNA中FHIT基因启动子区域甲基化状况及地西他滨对其甲基化的影响。采用甲基化特异性聚合酶链反应法检测1例初治的MDS患者、3例MDS转化而来的AML患者在地西他滨序贯半量CAG方案化疗前后血浆DNA中FHIT基因启动子区域CPG岛甲基化情况,并分析其临床疗效。结果表明,3例患者治疗前有FHIT基因甲基化。治疗1个疗程后其中2例患者FHIT基因甲基化得到逆转,4例患者中有2例获得临床缓解,2例无效。结论:MDS的发生可能与FHIT基因甲基化相关,地西他滨对MDS患者血浆DNA中FHIT基因高甲基化具有明显的去甲基化作用。血浆DNA的FHIT基因甲基化检测可能成为MDS辅助诊断和预后判断的分子标记。

急性白血病死亡相关蛋白激酶基因表达及启动子区甲基化状态研究

本研究通过对急性白血病病人及体外肿瘤细胞株的DNA甲基化及基因表达的实验,探讨死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)基因在急性白血病中的表达情况及其启动子区域甲基化的状态,并分析两者之间的相关程度。应用RT-PCR检测DAPK基因在白血病细胞及正常骨髓细胞中的表达;用巢式甲基化特异性PCR(n-MSP)法检测急性白血病患者及细胞株DAPK基因启动子甲基化状况;从第二轮巢式MSP扩增出的随机产物中挑选2个随机引物,交予专业机构克隆后进行序列分析。结果表明:DAPK基因在10例正常对照者骨髓标本中均有表达,DAPK mRNA在急性白血病病人骨髓标本中表达平均值为0.61±0.40,低于正常对照者,差异有显著性(P<0.05),其中52.94%(9/17例)的急性淋巴细胞白血病病人骨髓标本DAPK mRNA表达降低或缺失,急性髓系白血病病人数据为41.18%(42/102);细胞株U-937显示基因表达正常,HL-60表达缺失;102例急性髓系白血病病人骨髓标本中33例存在DAPK启动子区甲基化,甲基化率为32.4%(33/102);17例急性淋巴细胞白血病病人骨髓标本中8例存在DAPK启动子区甲基化,甲基化率为47%(8/17);7例正常人骨髓标本DAPK启动子区均为非甲基化;细胞株U-937 DAPK启动子区非甲基化,HL-60 DAPK启动子区甲基化。ALL组与AML组患者骨髓细胞DAPK mRNA表达与其启动子甲基化均呈显著负相关(ALL组r=-0.855,P<0.05;AML组r=-0.343,P<0.05),提示两者有密切的关联。结论:急性白血病患者中DAPK基因启动区甲基化与其mRNA的异常表达或失表达有关。

膀胱癌组织中上皮细胞钙依粘连蛋白基因启动子区CpG岛甲基化状态的分析

目的 探讨膀胱癌中肿瘤抑制基因上皮细胞钙依粘连蛋白(E cadherin)启动子区CpG岛的甲基化状 态及其与mRNA表达的关系。方法 收集30例新鲜的膀胱癌组织及其癌周正常组织;采用甲基化特异聚合酶 链反应(MSP)检测E cadherin基因启动子区CpG岛的甲基化状态;采用逆转录PCR检测E cadherin基因的mR NA表达。结果 E cadherin基因在膀胱癌组织中的甲基化阳性率(43.3%)显著高于在癌周正常组织中的甲基 化阳性率(6.7%,P<0.01);在复发性膀胱癌中的甲基化阳性率(64.7%)显著高于在原发性膀胱癌中的甲基化 阳性率(15.4%,P<0.05);在不同分级、分期膀胱癌中的差异无显著性。13例异常甲基化的膀胱癌组织中有10 例未检测到CDH1mRNA的表达,而13例未甲基化膀胱癌组织中有2例未检测到,二者差异有显著性(P< 0.01)。结论 E cadherin在膀胱癌组织中有一定程度的过甲基化,但与膀胱癌的临床分期和病理分级无显著相 关性,提示其可能参与了膀胱癌的发生;E cadherin基因CpG岛的过甲基化可能成为判断膀胱癌复发的指标之 一;E cadherin基因CpG岛的过甲基化可能是造成E cadherinmRNA不表达的原因之一。

胃癌组织hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化状态研究

目的 探讨hMLH1和hMSH2基因启动子区的甲基化状态与微卫星DNA不稳的关系。方法 采用甲基化特异性PCR方法检测hMLH1和hMSH2基因启动子区的甲基化状态 ,采用PCR为基础的方法检测微卫星DNA不稳。结果 正常胃粘膜未见hMLH1和hMSH2基因启动子区的高甲基化。 6 8例胃癌中检出hMLH1高甲基化 11例 ,占 16 .2 % ,而且均为去甲基化和高甲基化并存 ,未见有hMSH2高甲基化者。将MSI分为高频率MSI(MSI H ,≥ 2个位点 ) 8例、低频率MSI(MSI L ,仅为 1个位点 ) 9例和MSI阴性(MSS) 5 1例 3组 ,结果MSI H组hMLH1高甲基化的检出率显著高于MSI L和MSS组 (P <0 .0 1)。结论 hMLH1高甲基化可能参与了MSI病理途径 ,而hMSH2甲基化状态可能与MSI途径无关。

急性白血病LRP15基因启动子区甲基化及其表达分析

为了探讨LRP15基因在急性白血病(AL)患者中的表达情况及其与启动子区CpG岛甲基化的关系,采用甲基化特异PCR(MSP)方法检测AL患者LRP15基因启动子区甲基化状态,并用RT-PCR方法检测该基因在这些患者中的表达情况。结果发现,LRP15基因在缓解与非缓解状态白血病患者中的表达分别为47.6%和16.7%,其启动子区甲基化比例分别为38.1%和72.2%。LRP15基因的表达与其启动子区甲基化之间无相关(P=0.0087)。结论:AL患者LRP15基因启动子区的甲基化不完全是导致LRP15基因表达沉默的原因。

SLC2A9、SLC22A12、ABCG2、P2RX7基因启动子区甲基化与原发性痛风

目的探讨基因(SLC2A9、SLC22A12、ABCG2和P2RX7)启动子区甲基化在原发性痛风中的作用。方法于2016年1月至2017年1月在宁波市第二医院纳入原发性痛风患者50例,同期纳入50例健康体检者作为对照,采集所有受检者的外周血,采用焦磷酸测序技术检测SLC2A9、SLC22A12、ABCG2和P2RX7基因的甲基化率。采用SPSS 20. 0统计学软件对痛风组和对照组间的DNA甲基化率进行比较。结果痛风组患者SLC2A9 (pos 1、3、4、5、7)低于对照组、SLC22A12pos 2高于对照组,ABCG2 (pos 1、2、4、5、6)甲基化率明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0. 05)。其中痛风组与对照组SLC2A9基因各位点的甲基化率分别明显不同[pos 1:(0. 56±0. 05)%比(1. 27±0. 12)%,P=0. 042; pos 3:(0. 07±0. 01)%比(0. 82±0. 03)%,P=0. 012; pos 4:(1. 22±0. 23)%比(2. 69±0. 78)%,P=0. 043; pos 5:(0. 01±0. 00)%比(0. 76±0. 13)%,P=0. 003; pos 7:(0. 01±0. 00)%比(0. 87±0. 03)%,P=0. 003];基因SLC22A12 [pos 2:(94. 05±1. 13)%比(93. 15±2. 04)%,P=0. 008];基因ABCG2 [pos 1:(0. 76±0. 12)%比(1. 52±0. 34)%,P=0. 007; pos 2:(0. 12±0. 01)%比(0. 68±0. 11)%,P=0. 033; pos 4:(1. 06±0. 02)%比(1. 82±0. 32)%,P=0. 033;pos 5:(0. 10±0. 01)%比(0. 90±0. 02)%,P=0. 017; pos 6:(0. 04±0. 00)%比(0. 58±0. 03)%,P=0. 004]。但分析该3个基因的功能,只有基因SLC2A9的结果可解释痛风的发病机制。结论 SLC2A9(pos 1、3、4、5、7)低甲基化水平可能增加原发性痛风的风险。

BRCA1基因启动子区甲基化状态抑癌作用研究

目的研究BRCA1基因启动子区甲基化状态在乳腺癌组织中的抑癌作用。方法甲基化PCR法检测60例乳腺癌患者的癌组织、癌旁组织和20例乳腺良性组织中BRCA1-mRNA表达及启动子区甲基化状态,以及评价其作用。结果癌组织和癌旁组织中BRCA1-mRNA的表达水平分别为(0.6122±0.2344)、(0.6875±0.2576),在癌组织、癌旁组织、良性肿瘤组织中BRCA1表达的甲基化率分别为70.0%、48.3%、35.0%。癌组织的甲基化率明显的高于癌旁组织和良性肿瘤组织;经统计学分析显示,淋巴结转移、肿瘤分级在BRCA1-mRNA表达及启动子区甲基化中的差异均具有统计学意义(P<0.05),绝经、组织分型在BRCA1-mRNA表达及启动子区甲基化中的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 BRCA1-mRNA表达及启动子区甲基化状态在乳腺癌的发生发展中起着重要的作用,并且与组织分期和淋巴结的转移密切相关。

帕金森病患者时钟基因启动子区甲基化分析

目的分析帕金森病(Parkinson's disease,PD)患者和正常老年对照组时钟基因启动子区甲基化水平,探讨帕金森病患者时钟基因异常表达的机制。方法采用甲基化特异性PCR(MSP)法,检测206例帕金森病患者和181例正常老年对照者的7种时钟基因启动子甲基化水平。结果 7种时钟基因中,cry1和npas2启动子区存在明显甲基化。另5种时钟基因启动子(per1、per2、cry2、clock、bmal1)未发现明显甲基化。PD患者中npas2甲基化频率明显下降。结论 PD患者时钟基因的异常表达可能与时钟基因启动子区甲基化的改变有关。

白血病患者ID4、WT1、GLIPR1基因启动子区异常甲基化及mRNA表达的研究

DNA甲基化(methylation)作为最早发现的修饰途径一直属于生命科学的前沿课题之一,其能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达⑴。研究显示:白血病抑癌基因启动子异常甲基化与白血病的发病机制密切相关,抑癌基因启动子高甲基化抑制相关mRNA的表达水平可能为白血病发病的重要分子机制。

乳腺癌发生过程中NOEY2基因启动子区甲基化及mRNA表达

目的探讨乳腺癌发生过程中抑癌基因NOEY2启动子区甲基化状态及其对mRNA表达的影响。方法应用甲基化特异性PCR及双亚硫酸钠基因测序技术检测MCF10模型中乳腺增生细胞系MCF10A、癌前细胞系MCF10AT、导管内癌细胞系MCF10DC IS.com、浸润癌细胞系MCF10CA1 a、MCF10CA1d、MCF10CA1h及正常乳腺组织中NOEY2基因启动子区CpG岛I甲基化状态,然后用RT-PCR和实时PCR技术检测上述样品的mRNA表达水平。结果MCF10模型的增生细胞系、癌前细胞系、导管内癌细胞系、浸润癌细胞系均发生该基因启动子区CpG岛I高度甲基化;与正常乳腺组织相比,上述细胞系mRNA表达显著减少。结论NOEY2基因启动子区高度甲基化及相应的mRNA表达减少是乳腺癌发生过程中的早期事件,与乳腺癌发生有关,可能成为早期诊断乳腺癌的潜在分子生物学标记。

FOXP3基因启动子区甲基化与肾移植术后Th1/Th2水平和排斥反应的相关性分析

目的:分析FOXP3基因启动子区甲基化与肾移植术后Th1/Th2水平及排斥反应的相关性。方法:将2010年至2019年12月于新疆医科大学第一附属医院行肾脏移植治疗的120例患者纳入研究,根据患者术后3个月是否出现急性排斥反应(AR)将其分为AR组及Non-AR组,比较两组患者基线临床资料,辅助性T细胞1(Th1)、Th2、Th/Th2及FOXP3基因启动子区甲基化水平,采用多因素Logistic回归模型对影响AR的因素进行分析,并采用Pearson相关性模型分析FOXP3基因启动子区甲基化水平与Th1/Th2水平的相关性。结果:AR组患者Th1、Th1/Th2及FOXP3基因启动子区甲基化水平明显高于Non-AR组(t=2.888,2.055,2.984,均P<0.05),Th2及FOXP3蛋白水平明显低于Non-AR组(t=2.665,2.155,均P<0.05);多因素Logistics回归分析示高Th1及FOXP3基因启动子区甲基化水平是AR的独立危险因素(OR=1.390,1355.480,均P<0.05),而高Th2水平是AR的保护因素(OR=0.560,P=0.001);相关性分析显示,FOXP3基因启动子区甲基化水平与FOXP3蛋白呈负相关关系(r=-0.879,P<0.001),与Th1/Th2水平呈正相关关系(r=0.810,P<0.001),而FOXP3蛋白与Th1/Th2水平呈负相关关系(r=-0.881,P<0.001)。结论:FOXP3基因启动子区甲基化水平升高后,FOXP3基因蛋白表达水平降低,影响患者体内Th1/Th2细胞表达,从而使患者体内免疫状态发生变化,进而可能诱发排斥反应。

普鲁卡因酰胺诱导肝癌细胞启动子区甲基化的GSTP1基因重新表达

目的 研究HepG2肝癌细胞GSTP1基因启动子区甲基化与GSTP1基因表达的关系 ,并探讨普鲁卡因酰胺用于诱导因甲基化失活的GSTP1基因重新表达的可能性。方法 分别用 5 -杂氮 - 2′ -脱氧胞苷 (5 -Aza -CdR)和普鲁卡因酰胺处理HepG2细胞后培养 ,甲基化特异性PCR(MSP)检测细胞中GSTP1基因的甲基化状况 ,RT -PCR和Westernblot分别检测细胞中GSTP1mRNA和GST -π的表达。结果 HepG2细胞在去甲基化药物处理前 ,GSTP1基因完全甲基化 ,GSTP1基因不表达 ;药物处理后 ,普鲁卡因酰胺组和 5 -Aza -CdR组GSTP1基因有表达。结论 肝癌细胞GSTP1基因启动子区甲基化可抑制GSTP1基因表达 ,普鲁卡因酰胺与 5 -Aza

EC9706细胞和人食管鳞状细胞癌组织中MAL基因启动子区的甲基化状态

目的:探讨人食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)MAL基因启动子区的甲基化状态。方法:利用亚硫酸氢盐测序法检测人食管鳞癌细胞系EC9706中MAL基因启动子区CpG位点甲基化的发生情况。根据测序结果选用甲基化敏感性限制性内切酶酶切结合PCR技术进一步检测26例食管鳞癌组织及配对癌旁正常组织MAL基因启动子区的甲基化情况。结果:EC9706细胞中MAL基因启动子区检测出42个胞嘧啶位点的甲基化,占所有CpG位点的73.7%(42/57)。食管鳞癌组织中MAL基因的甲基化率为53.8%(14/26),远远高于配对癌旁正常组织的7.7%(2/26)(χ2=10.924,P<0.001)。不同临床病理特征食管鳞癌组织中MAL基因启动子区甲基化率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:MAL基因启动子区的甲基化可能是食管鳞癌发生的机制之一。

卵巢癌ES-2、SK-OV3和JHOS-3细胞系TSLC1基因启动子区甲基化状态与表达

TSLCl（tumor suppressor in lung cancer1，TSLCl）属肿瘤抑制基因，研究发现，恶性肿瘤中存在TSLCl基因表达降低或缺失，并且与肿瘤侵袭转移密切相关；并且TSLCl基因表达缺失多与启动子甲基化状态相关。卵巢癌是女性常见生殖系统肿瘤，较早发生侵袭和转移，严重威胁妇女的健康。本研究旨在探讨TSLCl基因在卵巢癌细胞系中CPG位点的甲基化状态及该基因的表达情况，为寻找卵巢癌基因治疗的靶点提供理论依据。