小鼠抗人TNF-α Fab基因的定点突变及其在大肠杆菌中的表达

目的 :对小鼠抗人TNF αFab基因进行人源化改造 ,并获得人源化Fab段的可溶性表达产物。方法 :应用一步反向PCR法 ,分别对小鼠VH、VL 基因进行定点突变。将突变基因克隆入载体pComb3H并诱导表达。结果 :成功地将鼠抗VH88位Ser突变为Ala ,VL17位Glu和 18位Lys分别突变为Asp和Arg。成功地构建了人源化Fab的可溶性表达质粒 ,并用Western blot检测到其在上清液中有表达。结论 :得到人源化Fab的可溶性表达产物 。

基于戊二醛的氨基微球上DNA编码和抗体蛋白固定

用戊二醛和EDC/sulfo-NHS分别活化表面修饰了氨基和羧基的微球,在2种微球上分别固定相等摩尔浓度的氨基标记的发卡DNA和未经修饰的人TNF α捕获抗体,结果表明戊二醛的交联效果优于EDC/sulfo-NHS。从而选择戊二醛为交联剂将Cy3标记的发卡DNA和未经修饰的藻红蛋白(RPE)分别固定到微米球表面并进行了荧光观察,再通过调整蛋白和DNA的比例将FAM标记的发卡DNA和RPE同时固定到微米球上并观察荧光,为实现用DNA序列编码的微米球上多种生物标志物酶联免疫吸附检测奠定了基础。用RPE为荧光标记物采用双抗体夹心法在微球上进行荧光免疫反应,为商品化诊断试剂的研究提供一定的参考。