脂溶性HHRT与水溶性MMC、5-Fu对人Tenon's囊成纤维细胞抑制作用的研究

目的比较脂溶性高杉尖三酯碱(HHRT)与水溶新丝裂霉素C(MMC)和5-氟尿嘧啶(5-Fu)三种药物对人Tenon's囊成纤维细胞(HTFs)增殖率的抑制情况。方法采用冻存的人眼Tenon's囊成纤维细胞,常规复苏体外培养稳定后,接种于96孔板,分别加入不同浓度HHRT、MMC及5-Fu,继续培养;采用MTT法于加药后24h、48 h、72 h检测不同浓度HHRT、MMC及5-Fu对体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞增值率的抑制情况。结果一定浓度的HHRT、MMC及5-Fu,对HTFs的抑制作用呈现不同的剂量和时间依赖性,在药物浓度达到相应程度作用72 h后三者对HTFs的最大抑制率均可达70%以上,且组间对比差异有统计学意义。结论三种药物均对人眼Tenon's囊成纤维细胞增殖具有明显抑制作用,其最大抑制率均可达70%以上,三种药物对成纤维细胞抗增殖效应的时间浓度依赖性有所差别。

羟基喜树碱对人眼Tenon's囊成纤维细胞的抑制作用

目的:研究羟基喜树碱(HCPT)对人眼Tenon's囊成纤维细胞(human Tenon's capsule fibroblasts,HTFs)的细胞周期、细胞毒性的影响,探讨其抗纤维化作用机制。方法:取本院眼库新鲜眼球(<6h)的Tenon's囊组织,用组织块培养法进行成纤维细胞体外培养;流式细胞仪测定HCPT和丝裂霉素C(MMC)对HTFs细胞周期的影响;台盼蓝染色法鉴定HCPT和MMC对HTFs的抑制作用是否由药物的细胞毒性引起;RT-PCR检测HCPT、MMC作用24h后HTFs的Smad7 mRNA基因表达。结果:HTFs体外生长良好,可用于实验研究。不同浓度HCPT(0,0.25,1,4mg/L)作用后的HTFs细胞周期与对照组相比,G2期细胞百分数的组间差异均有统计学意义(P<0.05);不同浓度MMC(0,0.025,0.1,0.4mg/L)作用后的HTFs细胞周期与对照组相比,G1期细胞百分数的组间差异均有统计学意义(P<0.05)。不同浓度HCPT和MMC作用后的HTFs活细胞率和空白对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。4mg/L HCPT,0.4mg/L MMC作用HTFs 24h后,Smad7 mRNA表达水平与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HCPT将HTFs阻滞于G2期,MMC将HTFs阻滞于G1期;HCPT,MMC抑制HTFs的作用和药物的细胞毒性无关;HCPT抑制HTFs的增殖可能是通过上调Smad7mRNA的表达阻断TGF-β信号通路实现的。

银杏叶提取物对TGF-β_1诱导的人Tenon's囊成纤维细胞增殖的影响及其机制的初步探讨

目的:观察银杏叶提取物(GBE)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人Tenon's囊成纤维细胞(HTCFs)增殖的影响及可能机制。方法:体外培养HTCFs及鉴定;MTT法检测不同浓度的GBE(25、50、100、200mg/L)对TGF-β1(2ng/mL)诱导的HTCFs增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期;免疫细胞化学法观察α-平滑肌动蛋白(α-SMA)表达的情况。RT-PCR检测细胞结缔组织生长因子mRNA(CTGF mRNA)的表达。结果:TGF-β1可显著促进HTCFs的增殖,促进细胞由G0/G1期进入S期,上调α-SMA、CTGF在蛋白和mRNA水平的表达;GBE能够抑制TGF-β1的上述作用。结论:GBE具有抑制TGF-β1诱导的人Tenon's囊成纤维细胞增殖的作用,其机制可能是阻止细胞进入S期,下调α-SMA及CTGF的表达。

肝细胞生长因子对人Tenon's囊成纤维细胞低密度脂蛋白受体表达的影响

目的:探讨人Tenon's囊成纤维细胞(HTFs)在肝细胞生长因子(HGF)刺激下,其低密度脂蛋白受体(LDLr)表达的动态变化。方法:分别以0、10、20、40、80和160μg/L的HGF刺激人Tenon's囊成纤维细胞12、24和48 h;应用MTT法检测HTFs的增殖率;real-time PCR定量分析不同增殖状态的HTFs上LDLr mRNA的表达水平;Western blot法检测不同增殖状态HTFs上LDLr蛋白表达水平的变化。结果:HTFs上LDLr mRNA及蛋白的表达水平均与HTFs的增殖率呈正相关,HGF以时间和浓度依赖的方式促进HTFs的增殖,同时以时间和浓度依赖的方式促进LDLr的表达(P<0.05)。结论:在HGF刺激下,增殖活跃的HTFs上LDLr呈高表达状态,提示增殖异常活跃的HTFs上高表达的LDLr,可能成为一种新型的抗代谢药物作用靶点,尤其是在抗青光眼术后滤过泡瘢痕化的研究中可能得到广泛应用。

血管内皮生长因子对体外培养的人Tenon’s囊成纤维细胞的纤维化及其富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白表达的作用

目的·探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对体外培养的人Tenon's囊成纤维细胞(humanTenon's fibroblast,HTF)的纤维化及其富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)表达的作用。方法·取斜视手术患者的Tenon's囊组织进行培养,并采用免疫荧光技术对获得的HTF进行鉴定。采用不同浓度的VEGF刺激培养HTF,并依据刺激条件将HTF分为4组,即0 ng/mL组、25 ng/mL组、50 ng/mL组和100 ng/mL组。采用蛋白质印迹和实时定量PCR分析SPARC、Ⅰ型胶原蛋白(collagen-Ⅰ)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein 9,MMP-9)的表达以及胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路磷酸化活性的改变。采用细胞活力测定实验(MTS法)和划痕实验检测HTF的增殖和迁移能力。结果·通过免疫荧光技术及倒置相差显微观察可以鉴定,所培养的原代细胞为HTF。在VEGF刺激作用下,与0 ng/mL组相比,其他3组HTF中的SPARC、collagen-Ⅰ和MMP-9蛋白及其mRNA表达均有所增加,HTF中ERK通路的磷酸化活性均有所上调,HTF细胞的增殖及迁移能力亦均有所增加,且在50 ng/mL组中影响最大。结论·VEGF在促进HTF纤维化的过程中伴随着细胞基质蛋白SPARC的上调,提示SPARC可能是这一过程的潜在调控位点。

维拉帕米对人眼Tenon's囊成纤维细胞增殖的影响

为了探讨维拉帕米在防治眼部增殖性疾病中的价值 ,本文研究了维拉帕米对体外培养的人眼 Tenon s囊成纤维细胞增殖的影响及与 CAMP的关系。结果发现 :维拉帕米明显抑制人眼 Tenon s囊成纤维细胞的增殖 ,药物浓度和细胞数量呈负相关 ,其 5 0 %抑制率浓度 ( ID5 0 )为 2 8mg/ l;维拉帕米对人眼 Tenon s囊成纤维细胞的抑制作用不通过改变 CAMP来实现。提示

青光安颗粒剂对TGF-β1诱导的HTFs增殖影响的实验研究

目的探讨青光安颗粒剂抑制转化生长因子β1 (TGF-β1)诱导的人类Tenon 成纤维细胞(HTFs)增殖的可能机制。方法从接受青光眼滤过手术(GFS)的个体获得人结膜下Tenon 胶囊样品。实验设计分为3 组:对照组(HTFs 未经处理,n = 10);TGF-β1 诱导组(100 ng/ ml TGF-β1 诱导HTFs,构建GFS 术后细胞模型,n = 10);TGF-β1+青光安治疗组(TGF-β1 诱导+青光安颗粒剂血清处理HTFs,n = 30)。TGF-β1+青光安治疗组按照青光安血清的剂量进一步分为3 组:TGF-β1+青光安高剂量组(TGF-β1 诱导+青光安颗粒剂血清5 ml处理HTFs);TGF-β1+青光安中剂量组(TGF-β1 诱导+青光安颗粒剂血清2.5 ml 处理HTFs);TGF-β1+青光安低剂量组(TGF-β1 诱导+青光安颗粒剂血清处理1 ml HTFs);每组设10 个培养皿。通过CCK-8 检测青光安对TGF-β1 诱导HTFs 增殖的影响;通过流式细胞术评估青光安对细胞周期的影响;通过Cyto-ID 免疫细胞化学染色测定青光安颗粒剂对HTFs 细胞自噬的影响;采用RT-PCR 和Western Blot 法测定自噬体形成的必需蛋白质Beclin-1,ATG-5 和LC3-Ⅲ基因和蛋白的表达水平。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t 检验。结果青光安能够抑制TGF-β1 诱导HTFs 的增殖能力,TGF-β1+青光安高剂量组细胞增殖水平(13.52±1.24)较TGF-β1 诱导组(23.42±1.25)降低,差异有统计学意义(F = 12.347,P < 0.01);TGF-β1 诱导G0/ G1 期的比例(88.29±0.35)降低,而S 期的比例(9.04±0.25)升高,而青光安治疗能够导致G0/ G1 期的比例(91.18±1.04)增加,而S 期的比例(5.41±0.59)降低,差异有统计学意义(F = 13.857,P < 0.01);与TGF-β1 诱导组相比,用TGF-β1+青光安治疗组导致荧光染色强度(1.84±0.14)降低,HTFs 阳性细胞数目(112.46±12.11)减少,差异有统计学意义(F =12.347,P = 18.472);TGF-β1+青光安治疗组能抑制TGF-β1 诱导对自噬基因Beclin-1、ATG-5 和LC- 3 Ⅲ mRNA 和蛋白质表达增加(P < 0.05)。结论青光安颗粒剂抑制TGF-β1 诱导的HTFs增殖,且可能机制为青光安诱导HTFs 细胞周期停滞于G0/G1 期,而且青光安可减少TGF-β1 诱导的HTFs 自噬。