miR-26对TGF-β_(2)诱导的人Tenon氏囊成纤维细胞迁移、细胞外基质蛋白表达的调控作用及其机制

目的观察miR-26对转化生长因子β_(2)(TGF-β_(2))诱导后人Tenon氏囊成纤维细胞(HTFs)的细胞迁移及细胞外基质(ECM)蛋白表达的调控作用,并探讨其可能的作用机制。方法切取青光眼手术患者的结膜囊组织,以组织贴壁法体外培养HTFs。取传至第3~5代的HTFs,随机分为空白组(不予转染)、TGF-β_(2)组(不予转染)、TGF-β_(2)+miR-26 mimics组(转染miR-26类似物)、TGF-β_(2)+mimics NC组(转染miR-26类似物阴性对照物),TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors组(转染miR-26抑制物),TGF-β_(2)+inhibitors NC组(转染miR-26抑制物阴性对照物),转染24 h后除空白组外均加入TGF-β_(2)5μg/L刺激48 h。采用划痕实验检测细胞迁移率,Western blotting法检测Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)、纤维连接蛋白(Fibronectin)、CTGF(荧光素酶报告基因实验证实miR-26和CTGF存在靶向关系)蛋白,实时荧光定量PCR法检测CTGF mRNA。将对数生长期的HTFs分为空白转染组(不予转染)、TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors组(转染miR-26 inhibitors)、TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors+si-NC组(转染miR-26 inhibitors+阴性对照siRNA)、TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors+si-CTGF组(转染miR-26 inhibitors+CTGF-siRNA),转染处理24 h后均加入TGF-β_(2)5μg/L刺激48 h,比较四组细胞迁移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白表达。结果六组细胞迁移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白表达:空白组、TGF-β_(2)+miR-26 mimics组<TGF-β_(2)组、TGF-β_(2)+mimics NC组、TGF-β_(2)+inhibitors NC组<TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors组(P均<0.05)。六组CTGF mRNA相对表达量:空白组<TGF-β_(2)组、TGF-β_(2)+mimics NC组、TGF-β_(2)+miR-26 mimics组、TGF-β_(2)+inhibitors NC组、TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors组(P均<0.05)。六组CTGF蛋白相对表达量:空白组、TGF-β_(2)+miR-26 mimics组<TGF-β_(2)组、TGF-β_(2)+mimics NC组、TGF-β_(2)+inhibitors NC组<TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors组(P均<0.05)。四组细胞迁移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白表达:TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors+si-CTGF组<空白转染组<TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors组、TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors+si-NC组(P均<0.05)。结论miR-26可以抑制TGF-β_(2)诱导后HFTs的细胞迁移及ECM蛋白合成,该作用可能是通过转录后水平靶向CTGF来实现的。

RGD多肽水凝胶对Tenon囊成纤维细胞活化和YAP信号的影响

目的 探究不同浓度的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽水凝胶,对Tenon囊成纤维细胞(HTF)活化和Yes相关蛋白(YAP)表达的影响。方法 制备0.5%、1.0%、2.0%三种浓度RGD多肽水凝胶,透射电子显微镜观察其内部微观结构,流变学检测弹性模量(E)。构建SD雄性大鼠结膜损伤模型后,分为空白组(不作处理)、低浓度RGD组(结膜下注射0.5%RGD多肽水凝胶)、中浓度RGD组(结膜下注射1.0%RGD多肽水凝胶)、高浓度RGD组(结膜下注射2.0%RGD多肽水凝胶),观察1周后取材,Masson染色观察大鼠结膜处胶原纤维增生情况,免疫组织化学检测大鼠结膜YAP、平滑肌肌动蛋白-α(α-SMA)表达情况。利用转化生长因子-β2(TGF-β2)刺激HTF活化构建瘢痕化细胞模型,按照实验要求分为对照组、 0.5%RGD水凝胶组、1.0%RGD水凝胶组、2.0%RGD水凝胶组、正常组,培养24 h后,Western blot检测HTF中YAP、结缔组织生长因子(CTGF)、α-SMA、纤连蛋白(FN)和I型胶原蛋白(Col I)的蛋白相对表达量;激光共聚焦显微镜观察细胞骨架蛋白(F-actin)和YAP蛋白表达定位。结果 电镜下观察可见,RGD多肽水凝胶内部纳米纤维交联密度随多肽浓度增加而升高,流变学测得0.5%、1.0%及2.0%RGD多肽水凝胶弹性模量(E)依次约为0.067 kPa、0.150 kPa、2.170 kPa。Masson染色结果显示,除中浓度RGD组大鼠结膜胶原纤维增生面积比明显低于空白组外(P<0.05),低浓度组、高浓度组与空白组差异均无统计学意义(均为P>0.05)。免疫组织化学结果显示,与空白组相比,低浓度RGD组、中浓度RGD组、高浓度RGD组大鼠YAP及α-SMA蛋白相对表达量均下降,中浓度RGD组下降最明显,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。细胞免疫荧光染色结果显示,与对照组相比,0.5%RGD水凝胶组、1.0%RGD水凝胶组、2.0%RGD水凝胶组HTF的F-actin绿色荧光减弱,YAP红色荧光从细胞核转位于细胞质表达。Western blot检测结果显示,与对照组相比,0.5%RGD水凝胶组、1.0%RGD水凝胶组、2.0%RGD水凝胶组HTF中YAP、CTGF、α-SMA、FN及Col I蛋白相对表达量均下降,1.0%RGD水凝胶组下降最明显,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 RGD多肽水凝胶的最佳作用浓度为1.0%,其通过抑制YAP蛋白的表达水平及其核转位,减少HTF的活化及其纤维化蛋白的表达,从而产生抗瘢痕效果。

EW-7197对TGF-β1诱导人Tenon囊成纤维细胞增殖和迁移的影响及机制

目的:探讨ALK5抑制剂EW-7197对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)增殖和迁移的影响及其机制。方法:采用MTS法检测细胞增殖率,并摸索EW-7197最佳的作用浓度和作用时间。之后将细胞分为3个组,分别为正常对照组、TGF-β1诱导组和TGF-β1+EW-7197处理组,采用Transwell小室观察各组细胞迁移情况,采用Western blot检测各组细胞Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3的蛋白表达水平。结果:MTS结果显示,不同处理条件的EW-7197以6.0μmol/L作用24h的细胞增殖率最低(均P<0.01)。Transwell小室实验结果显示,TGF-β1诱导组的细胞迁移数量为228.0±17.0个/视野,明显高于正常对照组(149.0±15.0个/视野)和TGF-β1+EW-7197处理组(46.0±8.0个/视野)(均P<0.01)。Western blot检测结果显示,TGF-β1诱导组细胞中Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3相对表达量高于正常对照组和TGF-β1+EW-7197处理组(均P<0.001)。结论:EW-7197能够通过TGF-β/Smad信号通路抑制TGF-β1诱导的HTFs增殖和迁移。

人眼Tenon氏囊成纤维细胞的体外培养

目的 探讨人眼Tenon氏囊成纤维细胞的体外培养方法,为防治眼部纤维增殖性疾病提供理想的细胞模型.方法 应用组织块和混合消化液培养法,取人角膜移植供体眼Tenon氏囊进行体外培养,并对培养的传代细胞进行液氮冻存复苏和形态学的鉴定.结果 人眼Tenon氏囊成纤维细胞体外生长良好,经HE染色和免疫组化观察证明该细胞为成纤维细胞.冻存复苏后的细胞能继续传代生长,其形态学特点与冻存前基本一致.结论 人眼Tenon氏囊成纤维细胞在体外生长良好,并可长期液氮冻存.

抗青光眼术后滤过泡瘢痕化组织人Tenon囊成纤维细胞的生长特性

背景 抗青光眼滤过术后瘢痕组织中的主要细胞成分是人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）,探讨滤过泡瘢痕组织中HTFs的生长特性可为抗青光眼滤过术后预防瘢痕形成的研究提供实验基础. 目的 研究抗青光眼滤过术后滤过泡瘢痕化组织中HTFs的体外生长特性. 方法 收集因抗青光眼小梁切除术后滤过泡瘢痕化行二次手术的患者8例8眼的Tenon囊组织（4 mm＆#215;5 mm）,同期以同样的取材方法收集行斜视矫正术患者8例8眼的正常Tenon囊组织.采用组织块贴壁法将Tenon囊组织进行原代培养,用鼠抗人波形蛋白细胞免疫荧光法鉴定培养的HTFs,并用巢式PCR法检测培养的HTFs中是否受到支原体的污染.分别于第0、4、7、11、14天以发光法细胞活力检测HTFs,并绘制各组细胞的生长曲线,计算细胞群体倍增时间（PDT）.比较瘢痕组和正常组HTFs形态学和PDT的差异;将瘢痕组第5代与第15代HTFs的形态及PDT进行比较,评价细胞传代生长特性的稳定性. 结果 HTFs原代培养1～2周达到融合,呈长梭形,形态符合HTFs,传代细胞4～6 d达到融合.瘢痕组与正常组HTFs的生长特性相近,对鼠抗人波形蛋白抗体呈阳性反应,PCR检测未见支原体反应条带.瘢痕组和正常组HTFs的PDT分别为（20.54±3.51）h和（18.86±2.91）h,差异无统计学意义（t=0.634,P=0.561）.细胞培养后第4、7、11和14天,瘢痕组HTFs的细胞数与正常组比较差异均无统计学意义（t=2.663,P=0.081;t=0.194,P=0.863;t=3.338,P=0.053;t=0.627,P=0.565）,2个组的HTFs随培养时间的延长显示出一致的增生曲线.瘢痕组第5代和第15代细胞PDT分别为（20.54±3.51）h及（22.84±4.15）h,差异无统计学意义（t=0.733,P=0.505）;第5代与第15代间细胞生长曲线可见其增生能力均稳定,两代间HTFs在各时间点的细胞数差异均无统计学意义（t=1.528,P=0.235;t=0.269,P=0.786;t=1.954,P=0.139;t=0.730,P=0.506）.结论 抗青光眼术后滤过泡瘢痕化患者的HTFs体外培养生长状态良好,增生能力稳定,是进行青光眼术后滤过区抗纤维化研究的良好靶细胞.

TGF-β_1对Tenon’s囊成纤维细胞增殖和结缔组织生长因子表达的影响

目的研究转化生长因子β1(TGFβ1)对Tenon’s囊成纤维细胞增殖和诱导表达结缔组织生长因子(CTGF)的影响。方法用MTT法检测不同质量浓度TGFβ1(0、0.1、1、10ng/mL)对Tenon’s囊成纤维细胞增殖的影响;免疫细胞化学染色法检测不同质量浓度TGFβ1(0、0.1、1、10ng/mL)对Tenon’s囊成纤维细胞诱导表达CTGF的影响。结果GFβ1能够剂量依赖性地促进Tenon’s囊成纤维细胞增殖(P<0.05);TGFβ1能够促进CTGF的表达,有随质量浓度的增加而增强的趋势(P<0.05),但1ng/mL和10ng/mLTGFβ1组之间无统计学差异(P>0.05)。结论GFβ1能够促进Tenon’s囊成纤维细胞增殖,并促进其下游介质CTGF的表达,可能是青光眼滤过术后滤过泡瘢痕形成的重要机制。

汉防己甲素抑制人眼Tenon囊成纤维细胞的凋亡效应

目的研究汉防己甲素(Tet)抑制人眼Tenon囊成纤维细胞(TCFs)的凋亡效应。方法用组织块混合消化液培养法体外培养人眼TCFs,并对培养的传代细胞进行形态学鉴定。通过透射电镜、TUNEL法和流式细胞仪观察Tet抑制人眼TCFs的凋亡作用。结果人眼TCFs体外生长良好。透射电镜下见Tet处理后的人眼TCFs细胞质固缩,呈现凋亡表现;TUNEL法可见Tet组出现大量的阳性凋亡细胞;流式细胞仪检测TCFs经Tet作用后G0/G1期细胞减少22.2%,S期细胞增加20.53%,G2/M期细胞增加1.6%,Tet抑制TCFs细胞周期于G1期,Tet组凋亡率明显高于对照组(P=0.000)。结论Tet可以诱导人眼TCFs发生凋亡,进而发挥其抑制增生的作用。

转化生长因子-β2诱导人Tenon囊成纤维细胞转化及其在瘢痕形成中的作用

背景研究表明转化生长因子-β2（TGF-β2）能够促进瘢痕形成，但其在青光眼滤过术后局部瘢痕形成中的作用机制值得研究。目的探讨TGF-β2对人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）转化以及在滤过术后瘢痕形成中的作用。方法在斜视手术中获取3例患者的Tenon囊组织，并用组织块培养法在含质量分数10％胎牛血清的DMEM中培养，培养的细胞贴壁后达到70％～80％亚融合状态时更换为无血清培养基饥饿培养24h，然后分别加入质量浓度1、2、5、10、20Ixg／LTGF-β2诱导HTFs24h，另用2tzg／L或5μg／LTGF-β2 诱导HTFs6、24、48、72h，阴性对照组培养基中不加TGF-β2 用Westernblot法检测HTFs中α-平滑肌肌动蛋白（n—SMA）和pSmad2蛋白的表达，采用细胞免疫荧光技术检测“-SMA及纤维状肌动蛋白（F—actin）表达的定位，采用凝胶收缩实验检测培养细胞收缩力的变化。结果不同质量浓度TGF—B，组HTFs中0I—SMA表达的强度均明显强于阴性对照组，2tzg／L、5μg／LTGF—B，作用24～48h后HTFs中d—SMA表达强度达峰值，10μg／L、20μg／LTGF-β2组较2μg／L、5μg／LTGF-β2组α—SMA蛋白表达强度减弱。对照组HTFs中有少量α—SMA及F—actin表达，1、2、5μg／LTGF-β2组d—SMA及F—actin荧光表达明显增强，阳性细胞数明显增加，10μg／LTGF-β2组α—SMA及F-actin荧光表达较低质量浓度组减弱。2μg／LTGF-β2作用后pSmad2表达强度明显强于PBS组和FBS组，在作用后30rain～2h表达较强，2h后开始出现下降。对照组HTFs收缩凝胶面积所占原面积的百分数为（78．00-3．13）％，1、2、5、10tzg／LTGF-β2组分别为（63．88±1．78）％、（20．69±O．65）％、（19．49±O．54）％、（16．24~0．84）％，HTFs收缩凝胶面积占原面积的百分数随着TGF-β2质量浓度的增加而明显增加（F组别=859．400，P=0．000）。结论TGF-β2可诱导成纤维细胞转分化，一定程度上其作用呈质量浓度依赖性和时间依赖性，且细胞收缩力随质量浓度的增加而增强，可能是青光眼滤过术后滤过通道建立失败的重要机制。

汉防己甲素对体外人眼Tenon囊成纤维细胞的抑制效应

目的:研究汉防己甲素(tetrandrine,Tet)对人眼Tenon囊成纤维细胞(Tenon’s capsule fibroblasts,TCFs)的抑制效应。方法:用组织块和混合消化液培养法体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞,并对培养的传代细胞进行形态学的鉴定。采用MTT法检测不同浓度的汉防己甲素(10-4,10-5,10-6,10-7mol/L)及0.2g/L丝裂霉素(MMC)对人眼Tenon囊成纤维细胞的抑制作用。结果:人眼Tenon成纤维细胞体外生长良好,经光镜和免疫组化观察证明该细胞为成纤维细胞。MTT法证实,随着Tet药物浓度的增大,TCFs增生活性降低,对应的TCFs抑制率升高。结论:Tet对人眼Tenon囊成纤维细胞的增殖具有明显的抑制作用。

重组γ-干扰素作用人Tenons囊成纤维细胞体外研究

目的 体外研究人重组γ－干扰素对人Ｔｅｎｏｎｓ囊成纤维细胞作用。方法 以人Ｔｅｎｏｎｓ囊成纤维细胞作为实验对象，分别加入０．１～１０＾６ Ｕ／ｍｌ人重组γ－干扰素（ＩＦＮ－γ）、０．００１～１０ｍｇ／Ｌ丝裂霉素（ＭＭＣ）、０．１～１０３ｍｇ／Ｌ５－氟尿嘧啶（５－Ｆｕ）孵育４８ｈ，然后以ＭＴＴ法进行检测。结果 高浓度和低浓度ＩＦＮ－γ实验组ＯＤ值较对照组升高（Ｐ〈０．０５）。

人眼Tenon囊成纤维细胞体外培养及生长特性的比较

目的观察在相同培养条件下不同组织来源的人眼Tenon囊成纤维细胞的生长特性,探讨不同组织来源对细胞培养的影响。方法分别取正常人、青光眼患者及翼状胬肉患者Tenon囊组织,均采用组织块贴壁法培养成纤维细胞,用含10%胎牛血清的DMEM培养基,于相同培养条件下进行离体培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况并拍照记录,分别取传代第3、4、5代的成纤维细胞,于接种后第3天行MTT试验检测细胞增殖活力。结果青光眼组、翼状胬肉组较正常人组Tenon囊成纤维细胞离体培养细胞生长无明显差异,培养细胞2 d至6 d处于对数生长期。结论青光眼、翼状胬肉患者Tenon囊组织离体培养成纤维细胞的生长及增殖特性较正常人无明显差异,提示对相关疾病的研究及药物治疗的评价应以体内实验为主要参考,才能准确进行评估。

HSV-tk/GCV系统对人Tenon囊成纤维细胞的旁观者效应及其机制研究

目的观察HSV-tk/GCV系统对人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的旁观者效应并研究其作用机制。方法将转HSV-tk基因HTFs(HTFs-tk)与正常HTFs于两种接种密度下以不同比例混合,加入5μg/m l更昔洛韦作用5 d,MTT法检测对HTFs的杀伤作用;染料传输法观察HTFs细胞间隙连接细胞间通讯(G JIC)的能力;免疫细胞化学检测Cx43分布;RT-PCR及W estern b lot检测Cx43表达。结果旁观者效应随HTFs-tk/HTFs比例增加而增强,高细胞接种密度组明显强于低密度组;染料通过G JIC传输6级以上;Cx43主要分布于HTFs细胞膜并检测到其mRNA与蛋白表达。结论旁观者效应需要细胞间密切接触,Cx43介导G JIC可能是HSV-TK/GCV系统对HTFs产生旁观者效应的主要机制,HTFs表达Cx43可能在结膜伤口愈合反应中发挥重要作用。

小檗胺抑制兔Tenon囊和滤过道内成纤维细胞增殖的实验研究

目的:研究钙调素拮抗剂小檗胺(berbamine,BER)对兔Tenon囊成纤维细胞和兔小梁切除术后滤过道内成纤维细胞增殖的抑制作用。方法:体外培养兔Tenon囊成纤维细胞,经不同浓度BER处理不同时间后,细胞计数Kit8(CCK8)法检测BER对兔Tenon囊成纤维细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪检测其凋亡率及细胞周期的变化。HE染色检测BER对兔小梁切除术后滤过道内成纤维细胞增殖的抑制作用。结果:兔Tenon囊成纤维细胞经不同浓度BER处理不同时间后细胞增殖受到抑制,并呈时间剂量依赖性。流式细胞仪检测发现BER处理后兔Tenon囊成纤维细胞呈现G1期阻滞,细胞凋亡率明显增加,20mg/LBER处理9h,细胞凋亡率从0.64%增加到31.86%。HE染色显示BER显著抑制兔小梁切除术后滤过道内成纤维细胞的增殖。结论:小檗胺在体内外均能抑制成纤维细胞的增殖,其可能是通过诱导细胞凋亡方式抑制兔Tenon囊和滤过道内成纤维细胞的增殖。

CCK-8检测法研究槲皮素对人Tenon囊成纤维细胞的抑制作用

目的观察槲皮素(quercetin,QU)对体外培养的(human Tenon’s capsule fibro-blasts,HTCF)增殖的抑制作用。方法体外培养HTCF。配制QU溶液,其浓度依次为20μmol·L-1、40μmol·L-1、60μmol.L-1、80μmol·L-1、100μmol·L-1,采用活细胞计数试剂盒CCK-8检测不同浓度QU作用下HTCF的增殖,并在光学显微镜下观察细胞的形态变化。结果不同药物浓度HTCF形态学检测显示:50μmol·L-1QU作用48h后,细胞收缩,胞核固缩,聚集在核膜边缘;100μmol·L-1QU作用48h后,细胞未见增殖,出现凋亡小体,细胞的增殖几乎完全被抑制。细胞生长抑制实验的结果显示:QU在各浓度组对体外培养的HTCF均有抑制作用,抑制效应呈剂量时间依赖关系。结论QU能抑制体外培养的HTCF的增殖,且该作用呈剂量和时间依赖性。

人Tenon囊成纤维细胞的体外培养及增殖能力研究

目的:离体培养人Tenon囊成纤维细胞(HTF)并观察细胞增殖能力。方法:取斜视患者手术切除Tenon囊组织进行成纤维细胞原代培养,培养的细胞通过免疫荧光染色法进行鉴定。CCK-8法描述细胞生长曲线,测定细胞活力。流式细胞术分析细胞周期,计算增殖指数。结果:通过组织块法成功培养出HTF。不同代次原代培养的HTF之间增殖能力无明显统计学差异(P>0.05)。结论:HTF在体外易于培养,经过数次传代,增殖能力稳定,是进行Tenon囊抗纤维化研究的良好靶细胞。

MTT法检测干扰素-γ对人眼Tenon囊成纤维细胞增殖的抑制效应

目的 :探讨重组人IFN γ对体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞增殖的抑制作用。方法 :用组织块培养法和混合消化液培养法体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞。采用MTT法检测不同浓度的重组人IFN γ对体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞的抑制作用。结果 :用上述两种方法成功培养出正常人眼Tenon囊成纤维细胞。重组人IFN γ对人眼Tenon囊成纤维细胞具有抑制作用 ,1× 10～ 1× 10 6IU/mlIFN γ浓度范围的抑制率为 2 0 2 %～43 5 % ,1× 10 6UI/mlIFN γ作用 48h后 ,与对照组相比 ,细胞数量明显减少 ,细胞皱缩 ,但未见细胞死亡或漂浮。结论 :IFN γ对人眼Tenon囊成纤维细胞的增殖具有明显的抑制作用。

汉防己甲素对人眼Tenon囊成纤维细胞中bax、bcl-2、TGF-β2 mRNA表达的影响

目的观察汉防己甲素(Tet)对体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞(tenon's capsule fibroblasts,TCFS)中bax、bcl-2、转化生长因子-β2(TGF-β2)mRNA表达的影响,探讨其可能的作用机制。方法将体外培养的第3代TCFS分别置于浓度为10-5mol/LTet的培养液和1640培养液中培养48 h,采用实时荧光定量PCR检测细胞中bax、bcl-2和TGF-β2 mRNA的表达变化。结果同对照组比较,Tet实验组中bax mRNA的表达量明显升高,bcl-2、TGF-β2 mRNA的表达量显著下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论一定浓度的汉防己甲素可以通过降低bcl-2、TGF-β2 mRNA的表达量,同时提高bax mRNA的表达量来抑制TCFS的增殖,并可诱导其凋亡,可能成为一种潜在的抗青光眼滤过瘢痕药物。

特异性转化生长因子-β_2 shRNA对人眼Tenon囊成纤维细胞的抑制作用

目的观察转化生长因子-β2(TGF-β2)特异性短发夹RNA(shRNA)对人眼Tenon囊成纤维细胞(TCFs)TGF-β2表达的影响及对人TCFs增生的抑制作用。方法根据小干扰RNA(siRNA)的设计原则,针对TGF-β2基因序列特征构建特异性shRNA载体,转染培养的人TCFs。MTT比色法检测细胞的增生情况;ELISA法检测shRNA对TGF-β2蛋白表达的抑制作用。结果 TGF-β2shRNA转染组的细胞增生及TGF-β2蛋白的表达均受到抑制。转染24、48、72h后MTT比色法检测显示,TGF-β2shRNA转染组培养的Tenon囊的成纤维细胞的增生值分别为0.5426±0.05、0.5210±0.03、0.4055±0.04,明显低于阴性对照组的0.5655±0.03、0.5378±0.03、0.5268±0.04,3个组和各时间点的总体差异均有统计学意义(F组=54.691,P=0.000;Ftime=66.888,P=0.000)。ELISA法检测显示,TGF-β2shRNA转染组TGF-β2蛋白的表达水平下降,24、48、72hTGF-β2蛋白的表达量分别为(543.58±25.32)、(400.26±30.74)、(202.72±23.24)ng/L,明显低于阴性对照组的(659.78±20.95)、(547.45±24.65)、(442.87±17.43)ng/L及空白组的(721.75±30.19)、(756.61±30.19)、(787.60±18.37)ng/L,3个组和各时间点的总体差异均有统计学意义(F组=163.082,P=0.000;F时间=31.498,P=0.000)。结论 TGF-β2特异性shRNA能显著抑制人TCFsTGF-β2的表达,载体介导的TGF-β2特异性shRNA对眼前节术后的抗瘢痕化治疗具有潜在的可能性。

人Tenon's囊成纤维细胞的离体培养及生长特性观察

目的离体培养人Tenon′s囊成纤维细胞,观察其生长特性。方法将人Tenon′s囊成纤维细胞进行离体培养及生长抑制实验,采用含10%胎牛血清的DMEM培养基,细胞计数法及MTT法描述细胞生长曲线。并通过免疫组织化学法对细胞进行鉴定。结果人Tenon′s囊成纤维细胞离体培养48 h至7 d处于对数生长期。细胞角蛋白染色阴性,波蛋白染色阳性。结论人Tenon′s囊成纤维细胞在体外易于生长,是细胞离体实验研究的良好材料。

转化生长因子-β1对人Tenon囊成纤维细胞表型转化的作用

目的探讨转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）对人Tenon囊成纤维细胞（human subconjunctival Tenon’s capsule fibroblast，HTCF）表型转化的作用。方法人白内障手术中取结膜下Tenon囊组织块培养成纤维细胞。用第5～9代细胞，以不同浓度TGF-β1（0μg·L^-1，2μg·L^-1，5μg·L^-1。，10μg·L^-1，20μg·L^-1）、不同时间（24h、48h、72h）诱导成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞。用蛋白质印迹免疫检测技术和免疫细胞化学技术鉴定细胞表型。结果体外用TGF-β1诱导HTCF，在0～10μg·L^-1，TGF-β1呈剂量依赖性增加平滑肌肌动蛋白在蛋白水平的表达，至20μg·L^-1时表达迅速下降；10μg·L^-1 TGF-β1诱导48h后其平滑肌肌动蛋白的表达与24h、72h相比，差异有显著性（P〈0．01，n=6）。结论一定浓度和剂量的TGF-β1能显著诱导HTCF表型转化为肌成纤维细胞，在人Tenon囊组织局部组织损伤修复及瘢痕形成中具有重要作用。