人canstatin基因的克隆及序列分析

目的 克隆人的canstatin基因并进行序列分析。方法 从人引产死胎肝组织提取总RNA ,以此为模板应用RT PCR法克隆canstatin该基因片段。结果 所得基因片段DNA序列分析由 6 84个碱基组成。

人canstatin基因转化新型生物反应器——杜氏盐藻(Dunaliella salina)的初步研究

采用RT-PCR技术从人的胎盘组织中克隆canstatin基因,定向连接到表达载体pUΩ上,然后与筛选标记bar盒连接得到真核表达载体pU Ω-Can-Bar。采用玻璃珠转化法将该表达载体转化杜氏盐藻(以下简称盐藻),通过草丁膦固体平板筛选得到转化株,进而对转化株进行阳性鉴定。PCR结果显示,在盐藻转化株中均能够扩增出约700 bp特异的条带,而在阴性对照中没有扩增出该条带。Southern blot结果进一步证明人canstatin基因已经整合到盐藻细胞的基因组中。此外,对盐藻转化株的遗传稳定性进行了分析,结果表明canstatin基因能够在转化藻株中稳定遗传。人canstatin转基因盐藻株的成功制备为利用盐藻反应器大规模生产人canstatin蛋白提供了实验依据,为及早实现canstatin蛋白在治疗肿瘤上的临床应用提供了前期工作基础。

人canstatin基因的克隆

为深化研究血管生成抑制剂canstatin的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性,针对canstatincDNA序列设计引物,运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人胚肝组织中钓取canstatincDNA,将其克隆入pMD18-T载体中,通过酶切鉴定出重组体并测序分析。结果表明获得684bp人canstatin基因,成功构建人canstatincDNA克隆载体pMD18-T/canstatin,为进一步进行canstatin蛋白表达及活性研究奠定了基础。

重组人canstatin真核载体的构建及鉴定

目的 构荧光蛋白和canstatin融合蛋白基因的真核表达载体pEGFP-N1／canstatin，以深化研究血管生成抑制剂canstatin的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性。方法 提取人胚肝总RNA，RT—PCR扩增canstatin基因片断，T—A克隆到pGEM—T中，从pGEM—T／canstatin克隆载体中，将人canstatin cDNA亚克隆入真核表达载体pEGFP-N1，构建含人canstatin cDNA的重组质粒pEGFP-N1／canstatin，通过酶切鉴定出重组体并测序分析。结果 成功构建pEGFP—N1／canstatin真核表达载体，双酶切及测序鉴定显示canstatin基因片断正确插入载体，与Genebank中报道的序列一致。结论 pEGFP—N1／canstatin真核载体的构建为进一步进行canstatin蛋白表达和活性研究以及canstatin用于基因治疗奠定了基础。

中国人Canstatin基因的克隆

目的 Canstatin是新近发现的血管生成抑制剂 ,具有很强的抑制肿瘤血管生成的功能 ,本研究拟克隆和鉴定中国人的Canstatin基因 ,为进一步研究Canstatin基因的功能奠定基础。方法 用RT PCT法从中国人肝组织中获得Canstatin的cDNA ,克隆到pCMV Script载体中测序 ,并在GenBank中进行同源性分析。结果 成功克隆了Canstatin基因cDNA编码序列并获得测序证实。结论 中国人Canstatin基因编码序列 ,经同源性分析与国外文献报道序列一致 ,初步证明该基因可能属于人类基因中序列保守的基因。

重组人canstatin的克隆、表达及其活性鉴定

目的:克隆并表达canstatin基因,初步检测其抑制血管生成的活性。方法:采用RT-PCR方法从人胚肝组织中钓取canstatin cDNA,克隆入pMD18-T载体中,并测序鉴定。在QIA表达系统中表达,Ni柱亲和层析纯化。进行生物学活性鉴定。结果:经序列分析所获684 bP人canstatin基因与报道一致,重组进pQE30表达载体,IPTG诱导表达并纯化成功,表达产物能明显抑制血管生成。结论:成功构建人canstatin cDNA克隆和表达载体并在大肠杆菌M15中高效表达。纯化回收产物在鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)实验中具有明显抑制血管生成活性。

人canstatin基因原核载体构建及其重组蛋白的表达纯化

目的:构建人血管能抑素canstatin基因原核表达载体,表达并纯化出其重组蛋白。方法:从人胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增canstatin cDNA,克隆进质粒pUCm-T,转化E.coliDH5α,测序正确后,酶切目的基因片段,插入质粒pET-22b(+),转化E.coliBL21,IPTG诱导蛋白表达,N i-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因canstatin长度一致。RT-PCR纯化产物与载体pUCm-T连接后,经蓝白斑筛选,挑出6个白色菌落做酶切鉴定。其中一个菌落被证实为阳性克隆,测定其基因序列,结果显示与Genbank公布的canstatin基因序列完全一致。将canstatin cDNA,插入质粒pET-22b(+),转化E.coliBL21,培养过夜后,挑选7个白色菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆。IPTG诱导其中一个克隆表达蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量24 000左右出现新的蛋白表达条带,诱导1、2、3、4 h后,表达蛋白分别占菌体总蛋白的18.2%、18.8%、23.0%和23.4%。将诱导3 h的菌体超声破碎后,N i柱亲和层析,125和250 mmol/L咪唑洗脱液SDS-PAGE电泳显示出清晰的单一条带。结论:成功构建人canstatin基因原核表达载体,表达并纯化出canstatin重组蛋白,为深入研究其临床应用打下基础。

重组人canstatin表达产物的抗肿瘤活性鉴定

目的 正确构建人canstatin原核表达载体 ,诱导表达重组人canstatin融合蛋白 ,并对其活性鉴定。方法 将人canstatincDNA亚克隆入 pQE30 ,构建重组质粒 pQE30 canstatin ;转化M 15 [pREP4] 中 ,IPTG诱导表达 ,纯化回收表达产物 ,复性后用Lewis肺癌移植瘤模型对其活性鉴定。结果 成功构建人canstatincDNA表达载体 ,纯化回收 ,获得高纯度canstatin重组蛋白。纯化产物在体内能抑制Lewis肺癌移植瘤血管的生成 ,从而抑制肿瘤生长和转移 ,抑瘤率 (% )为 6 0 .0 % ,转移抑制率 (% )为 74 .3%。结论 (1)成功构建了原核表达载体 pQE30 canstatin。 (2 )重组人canstatin融合蛋白在原核表达系统中高水平表达 ,并获得高纯度canstatin重组蛋白。 (3)重组canstatin融合蛋白可抑制Lewis肺癌移植瘤血管的生成 ,从而抑制肿瘤生长和转移活性。

人canstatin基因克隆及其重组蛋白的表达和纯化

目的克隆人血管能抑素canstatin基因,构建其原核表达载体,表达并纯化出canstatin蛋白。方法从人胎盘组织中提取总RNA,经RTPCR扩增出canstatin基因,克隆进质粒pUCmT,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET22b(+)相应位点,转化E.coliBL21,IPTG诱导蛋白表达。超声破碎菌体,NiNTA柱亲和层析纯化重组蛋白。结果从人胎盘组织中提取总RNA,显示3条清晰条带,分别对应28S,18S,5S,分光光度计法测得总RNA浓度为1.8g/L;RTPCR扩增出与预期目的基因canstatin长度一致的cDNA片段;构建出克隆质粒pUCmT/canstatin,基因测序结果与GenBank公布的canstatin基因序列完全一致;构建出表达质粒pET22b(+)/canstatin,BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实构建正确;IPTG诱导蛋白表达,SDSPAGE电泳分析表明在相对分子质量24kD左右出现新的蛋白表达条带,诱导后1h、2h、3h、4h表达蛋白占菌体总蛋白的百分比分别为18.2%、18.8%、23.0%和23.4%;诱导3h的菌体超声破碎后,Ni柱亲和层析,125、250mmol/L咪唑洗脱液SDSPAGE电泳显示出清晰的单一条带。结论成功克隆出canstatin基因,成功构建了其原核表达载体,并且成功表达、纯化出canstatin蛋白,为进一步研究其临床应用打下基础。

人canstatin腺病毒载体的构建及在卵巢癌细胞的表达

目的:构建并鉴定人canstatin基因腺病毒表达载体Ad-can及研究在卵巢癌的表达。方法:(1)提取人卵巢癌组织总RNA,设计带有特殊酶切位点的引物,用RT-PCR方法扩增canstatin片段,克隆入载体pMD-18T,并转化至大肠杆菌DH5α,大量扩增目的基因(pMD-can);(2)双酶切pMD-can和pAdtrack质粒,酶切产物在T4DNA连接酶作用下连接,获得pAdtrack-canstatin(pAdtr-can)穿梭载体;(3)PmeⅠ酶切pAdtr-can,使其线性化,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy共同转化大肠杆菌BJ5183,使其同源重组,获得pADeasy-canstatin(pAd-can)载体;(4)内切酶PacⅠ再次将重组子线性化,脂质体转染细胞株HEK293,借助GFP表达观察包装病毒Ad-can。重组腺病毒载体感染HEK293细胞扩增病毒,经4次扩增、纯化后,用空斑形成实验法测病毒滴度;(5)用包装的病毒转染卵巢癌细胞HO8910PM,借助GFP的荧光表达观察卵巢癌细胞转染情况;(6)RT-PCR检测转染后卵巢癌细胞中目的基因的表达。结果:各中间载体经酶切鉴定,DNA测序证实正确。转染的HEK293细胞2～3天产生病毒,7～10天出现病毒斑。最终包装的病毒中携带有目的基因canstatin,并能够在包装细胞中表达。用空斑形成实验法测定病毒滴度约为1.6×1011pfu/ml。将包装的病毒转染卵巢癌细胞,荧光显微镜下可观察到大部分卵巢癌细胞发出绿色荧光,经RT-PCR检测可发现canstatin基因扩增片段。结论:大肠杆菌内同源重组法能有效和较方便的构建canstatin基因腺病毒载体Ad-can。重组子Ad-can能转染卵巢癌细胞,并在卵巢癌细胞中表达,为进一步研究canstatin基因治疗卵巢肿瘤提供了良好的转导载体。

人canstatin基因转化盐藻反应器真核表达载体的构建

目的:构建人canstatin基因转化盐藻反应器的真核表达载体。方法:采用RT-PCR扩增得到人canstatin cDNA,克隆到pMD18-T载体形成pMD18-T/Can重组质粒。对pMD18-T/Can进行酶切鉴定和测序鉴定,将鉴定正确的canstatin基因定向连接到真核表达载体pUΩ上,然后连接上筛选标记bar盒,构建了含有人canstatin基因的真核表达载体pUΩ-Can-Bar。结果与结论:鉴定结果显示,转化盐藻反应器的真核表达载体pUΩ-Can-Bar构建成功。

人canstatin基因克隆及其重组蛋白表达

目的克隆人血管能抑素canstatin基因,重组表达canstatin蛋白。方法从人胎盘组织中提取总RNA做模板,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增canstatincDNA,转入克隆载体pUCm-T,再转化E.coliDH5α,挑选阳性克隆,测定基因序列。酶切克隆载体目的基因,插入表达载体pET-22b(+),转化E.coliBL21,诱导表达重组蛋白。结果RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实与目的基因长度一致。RT-PCR产物与pUCm-T的连接产物转化E.coliDH5α,篮白斑筛选后,选6个白色菌落做酶切鉴定,证实其中1个为阳性克隆,测序结果与GenBank公布的canstatin基因序列完全一致。将pUCm-T上目的基因片段酶切后插入pET-22b(+),转化E.coliBL21,挑选7个菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆。IPTG诱导其中1个克隆表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量24000左右出现新的蛋白条带。结论成功克隆出canstatin基因,重组表达出canstatin蛋白,为进一步研究其临床应用打下基础。

含翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体表达载体的构建

目的:构建含翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体重组表达载体。方法:采用RT-PCR的方法,获得含有人canstatin的cDNA片段以及分别在5'UTR下游和3'UTR上游添加了翻译增强序列(UUAACUUUA)的人canstatin cDNA片段,将得到的目的片段分别连接到PMD18-T载体上,利用该载体将目的片段连接到荧光素酶基因Lux Ct表达盒中并进行酶切鉴定。结果:RT-PCR分别得到约700 bp的cDNA片段并克隆到PMD18-T载体上。用PaeR7Ⅰ、SphⅠ双酶切Lux Ct质粒,得到2 100 bp和10 000 bp的2条片段。然后,将大片段回收后分别与上一步得到的cDNA片段进行连接,酶切鉴定结果显示含有翻译增强序列的人canstatin片段成功插入到Lux Ct质粒中。结论:成功构建了含有翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体重组表达载体。

人canstatin基因治疗人食管癌裸鼠移植瘤的实验研究

背景与目的:Canstatin是一种新内源性血管生成抑制剂,以往的研究显示canstatin能有效的抑制肿瘤的生长,作用甚至强于endostatin。本研究将探讨人canstatin基因对人食管鳞状细胞癌移植瘤模型的抑制作用。方法:应用人食管癌细胞株KYSE150建立移植瘤模型。将裸鼠随机分成3组:腺病毒携带的canstatin基因组(Ad-GFP-canstatin)、腺病毒携带的绿色荧光蛋白组(Ad-GFP)和磷酸盐缓冲液组(PBS)。治疗期间测量皮下移植瘤的长径和短径;30d后处死裸鼠,取下肿瘤行常规病理切片,观察药物的毒性反应;检测肿瘤组织中caspase-3、内皮细胞生长因子受体1(fetal liver kinase-1,Flk-1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达和微血管密度(microvessel density,MVD)。结果:第二次注射病毒后3d,canstatin基因治疗组肿瘤体积显著小于其余两组(P<0.05),治疗第6天抑瘤率达到61%;HE染色显示:各组肿瘤组织中都有坏死,尤其在canstatin基因治疗组坏死更加明显;canstatin基因治疗组caspase-3表达高于空载体组和对照组(P<0.05);Flk-1的表达低于空载体组和对照组(P<0.05);VEGF的表达3组相比差异无统计学意义(P>0.05);canstatin基因治疗组MVD低于空载体组和对照组(P<0.05)。结论:人canstatin基因对人食管癌移植瘤的生长具有抑制作用,作用机制可能是降低Flk-1的表达进而抑制肿瘤的血管生成,抑制肿瘤的生长。

人canstatin基因的克隆、表达、纯化及其生物活性测定

目的:克隆人Canstatin cDNA,在E.coli中融合表达和纯化,并测定表达产物抑制新生血管生成活性。方法:从中国人胎盘组织提取总RNA,RT-PCR扩增出Canstatin cDNA,克隆入pTYB1载体中并测序,构建原核表达载体pTYB1-hCAN,IPTG诱导表达,几丁质亲和纯化,鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成实验进行活性测定。结果:RT-PCR产物约为700bp,测序结果与文献报道序列一致。构建了人Canstatin原核表达载体pTYB1-hCAN,在大肠杆菌中表达。纯化的融合蛋白在CAM实验中能明显抑制血管生成。结论:克隆、表达了具有生物学活性的人canstatin蛋白。

人canstatin基因的克隆及其真核载体的构建

[目的]克隆人canstatin基因,构建并鉴定其真核表达载体pSecTag2/canstatin。[方法]采用RT-PCR方法从中国人胎盘脐带组织中扩增canstatincDNA,T-A克隆到pUCm-T载体中,酶切后将人canstatincDNA亚克隆入pSecTag2,构建真核表达载体pSecTag2/canstatin,重组质粒经限制性内切酶鉴定并进行测序分析。[结果]人canstatin基因片断正确插入载体,与Genebank中报道的序列一致。[结论]pSecTag2/canstatin真核载体的构建为进一步进行canstatin蛋白表达、活性鉴定和作用机制研究以及canstatin用于基因治疗奠定了基础。

人canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其病毒制备

目的：利用HEK293细胞内同源重组法构建带有绿色荧光蛋白报告基因的人血管能抑素（canstatin）重组腺病毒载体,扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法：PCR法扩增canstatin全长基因,克隆至pGEM-T载体,经酶切和测序证实后,亚克隆到穿梭质粒pAd5-CMV中,获得穿梭质粒pAd5-CMV/canstatin.用PacI酶单独酶切穿梭质粒pAd5-CMV/canstatin和腺病毒E3区带有绿色荧光蛋白表达元件的腺病毒骨架载体,采用标准的磷酸钙方法共转染HEK293细胞.7~10d后收获细胞裂解物,在HEK293细胞中扩增,病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后,分光光度计检测重组病毒滴度.结果：测序证实pEGM-T/canstatin基因片段与GenBank公布的can-statin基因序列一致.重组腺病毒质粒转染293细胞后24h观察到绿色荧光,病毒纯化后制备出高滴度重组腺病毒（病毒滴度为2.0×1015pt/L）.结论：成功构建了表达canstatin基因的重组腺病毒载体并制备了重组腺病毒颗粒,为研究该基因在肿瘤治疗中的作用奠定了基础.

重组Canstatin蛋白联合氟尿嘧啶治疗胰腺癌

目的:探讨血管生成抑制剂Canstatin与细胞毒药物5-FU联合应用治疗胰腺癌的效果,以期探索胰腺癌治疗新途径.方法:胰腺癌SW1990细胞(1×107/只)注射到32只裸鼠皮下,建立胰腺癌皮下移植瘤模型.当肿瘤长至2-3mm时,随机分4组,即PBS(0.3mL/d)对照组、5-FU(12.5mg/(kg·d)×5d)治疗组、Canstatin(10mg/(kg·d)×3wk)治疗组、及5-FU[12.5mg/(kg·d)×5d]+Canstatin[10mg/(kg·d)×3wk)]联合治疗组,给药途径均为ip.治疗期间,定期用圆规和游标卡尺测量皮下移植瘤大小.疗程结束时,取下瘤体,常规病理切片,观察药物毒性反应,CD34免疫组化染色,检测肿瘤内微血管密度(MVD).结果:Canstatin治疗组移植瘤体积从第10天起显著小于对照组(P<0.01),5-FU治疗组第7天起就显著小于对照组(P<0.05),而联合治疗组自第3天起,移植瘤体积就显著小于对照组(P<0.05).疗程结束时,联合治疗组小鼠移植瘤体积显著小于其余各组(P<0.01),抑瘤率最高,达83.2%.治疗期间,各实验组未观察到明显毒性反应.免疫组化染色显示,Canstatin组(25.2±3.7)和联合治疗组(22.0±4.8)治疗小鼠肿瘤组织内MVD显著低于对照组(36.8±9.4)和5-FU治疗组(31.6±4.0)(P<0.05),而5-FU治疗组与对照组间无显著差异.结论:重组人Canstatin蛋白能有效抑制人胰腺癌生长,无明显副作用,作用机制是抑制肿瘤新血管形成,与细胞毒药物联合使用,具有协同作用,为胰腺癌治疗提供了新的有力的治疗方法.

canstatin基因转染对肺癌A549细胞和血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

背景与目的 肿瘤的生长和转移需要大量新血管的生成,人血管能抑素(canstatin)是新近发现的高效内源性血管生成抑制剂,其抑制血管内皮细胞的作用已引起人们广泛关注。本研究的目的是探讨can statin基因在人肺癌A549细胞和人脐静脉内皮细胞HUV ECC中的表达及意义。方法 将canstatin基因通过电穿孔的方法转染人肺癌细胞A549和人脐静脉内皮细胞HUV ECC,行G418筛选获得转基因细胞克隆。用SDS PAGE电泳检测canstatin蛋白在转基因细胞培养上清液中的表达,以流式细胞仪分析细胞周期,并比较转基因和未转基因细胞的生长特性。结果 canstatin在转染组A549 细胞和ECC细胞表达并分泌至上清液中。canstatin基因转染组ECC的凋亡率(16.04%)显著高于空载体组(0.43%)和亲代细胞组(2.92%)(P<0.01),转染细胞生长明显受抑(P<0.01)。而转染组A549细胞的凋亡率(0.19%)与空载体组(0.13%)及亲代细胞组(0.07%)比较无显著性差异(P>0.05),细胞生长也未受明显影响。结论 canstatin能特异地抑制内皮细胞增殖,并诱导内皮细胞凋亡。

canstatin基因在体外培养血管内皮细胞中的表达及其意义

目的探讨canstatin基因通过电穿孔法在体外培养人脐静脉内皮细胞中的表达及对其生长与凋亡的影响。方法将canstatin基因通过电穿孔法转染人脐静脉内皮细胞HUV-ECC,行G418筛选获得转基因细胞克隆。用RT-PCR检测canstatin在转基因细胞mRNA中的表达,以流式细胞仪分析细胞周期,并比较转基因和未转基因细胞的生长特性。结果检测到canstatin在转染人脐静脉内皮细胞中的表达,canstatin基因转染内皮细胞组的凋亡率(16.90%)高于空载体组(1.47%)和亲代细胞组(2.85%)(P<0.01),转染细胞生长明显受抑。结论canstatin能特异地抑制血管内皮细胞增殖,并诱导细胞凋亡。