基于农杆菌介导法将CP4-EPSPS基因转入玉米自交系B73的研究

【目的】建立玉米遗传转化体系培育抗除草剂玉米材料,解决玉米杂草危害问题。【方法】采用农杆菌介导法在玉米自交系B73幼胚中转入抗除草剂基因(CP4-EPSPS),通过PCR、qRT-PCR鉴定转基因植株;利用ddPCR技术筛选低拷贝转基因植株,并对低拷贝植株进行草铵膦抗性鉴定。【结果】在所获得的181株抗性植株中12株为阳性,转基因植株的外源抗除草剂基因(CP4-EPSPS)在转录水平上均能正常表达;转基因植株中筛选到低拷贝植株5株;抗性鉴定证明转基因植株均具有草铵膦抗性。收获T1代转基因低拷贝植株种子5份。【结论】建立了以B73为受体,基于农杆菌法介导的玉米遗传转化体系。

农杆菌介导法获得小麦转基因植株的研究

从 gus基因的瞬时表达入手 ,利用不同种类的农杆菌菌株感染小麦不同基因型和同一基因型的不同外植体 ,研究了农杆菌菌系、小麦基因型和外植体对转化效率的影响。从中优选出了对小麦愈伤组织感染力比较强的农杆菌菌系 AGL 0和 MOG10 1,以及高敏感受体基因型 Alondra和扬麦 15 8等。实验结果还表明 ,预培养 10～ 15天的幼胚愈伤组织具有较高的瞬时表达率和再生能力 ,是较好的转化受体。对愈伤组织与农杆菌共培养后的筛选程序进行了摸索 ,获得了 70多个 PPT(Phosphinothricin)抗性植株 ,经 PCR等分子检测分析 ,证明部分植株实现了外源基因的成功转化 ,为进一步的研究工作打下了基础。

建立青菜(Brassica chinensis)农杆菌介导法基因转化体系

以青菜地方品种矮脚黄、苏州青的子叶、子叶柄、真叶为外植体，在改良ＭＳ培养基上离体培养获得再生植株。在不定芽诱导培养基中添加２～２０ｍｇ／ＬＡｇＮＯ３可显著提高子叶不定芽诱导频率；添加０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ和１～２ｍｇ／ＬＣＰＰＵ既可提高不定芽诱导频率，又可获得较多数量的不定芽。用含ＣｐＴＩ基因和ＮＰＴＩＩ基因的农杆菌感染子叶，获得了具有卡那霉素抗性的再生植株。培养基中添加羧苄青霉素促进子叶再生不定芽，头孢霉素和卡那霉素则抑制子叶再生。卡那霉素敏感性测定结果表明，当培养基中含卡那霉素１０ｍｇ／Ｌ时。

通过农杆菌介导法将Bt(cryIA)基因导入大豆

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将Bt基因 (cryIA)导入大豆。从发芽 5 - 7天的大豆无菌苗切取子叶节外植体 ,经农杆菌感染和共培养后 ,在选择培养基上 4周左右出现抗性不定芽。将不定芽转移到芽伸长培养基上 ,4 - 6周后再生苗长至 2 .5 - 3cm高。再将再生苗切下转入生根培养基 ,2周左右生根。生根后的再生植株经逐步锻炼移入盆中 ,所有植株均能正常开花结荚。在移栽成活的 8株T0 植株中有 7株PCR检测呈阳性反应 ;在 7个T1株系中有 4个株系存在PCR阳性植株。取 4个稳定遗传的T1代株系内的阳性植株的叶片提取DNA ,用地高辛标记的Bt基因探针进行Southern杂交分析 ,结果 4个株系均呈现阳性 ,证明Bt基因已整合到受体大豆的基因组内并能传递给后代。

农杆菌介导法获得转可溶性淀粉合成酶基因籼稻

采用农杆菌介导法将胚乳特异性表达谷蛋白1(Glutelin1,Gtl)基因控制下的可溶性淀粉合成酶基因sss导入籼稻恢复系明恢86,共获得53个独立转化再生植株。PCR检测表明,sss基因已整合进水稻的基因组中。直链淀粉含量测定结果表明,转基因植株后代直链淀粉含量较对照有较大幅度的下降。

利用农杆菌介导法转化泗棉3号的研究

泗棉3号农艺性状优良,是20世纪90年代长江流域棉区的主栽品种,利用基因工程导入外源基因进行直接改良,可以迅速获得新的品种或育种材料。以陆地棉泗棉3号的下胚轴为外植体,建立了高效的转化体系,得到了大量的转基因植株。泗棉3号的出愈率和分化率显著高于模式品种Coker312,同时它出现分化中心的主要形态不同于Coker312,其胚性愈伤组织主要来源于两类初生愈伤组织。对泗棉3号的胚性愈伤组织进行GUS检测,以及对再生植株叶片进行PCR检测后,阳性植株嫁接于温室。在温室用2063.98μmolL-1的卡那霉素点涂叶片检测nptII基因的表达和取叶片进行gus基因的组织化学检测,同时通过Southernblot分析检测,证明目的基因成功地整合到泗棉3号基因组中。

应用农杆菌介导法的多年生黑麦草遗传转化研究

以草坪型多年生黑麦草LoliumperenneL.成熟种子为外植体,经过愈伤组织诱导和植株再生研究,建立了该草种的遗传转化体系,并成功地应用农杆菌介导法将克隆自辽宁碱蓬的甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)转移进多年生黑麦草,获得的转基因株系Gsc_LP5通过PCR检测证明了目的基因的存在,通过叶片离体检测法证明了作为检测基因随同质粒一同转入的抗潮霉素基因的表达,通过盆栽耐盐试验证明了转基因植株具有较强的耐盐能力。

农杆菌介导法将FPF1基因导入油菜的研究初报

将拟南芥早花基因FPF1(floweringpromotingfactor 1)插入双元高效表达载体pBI 12 1中 ,构建了植物表达载体pBIUbi-FPF1。以“双低”甘蓝型晚熟油菜品种 2 0 0 0F4 10 2 ,2 0 0 0F4 15 3的下胚轴为转化受体 ,通过农杆菌介导的遗传转化获得抗卡那霉素的再生转基因植株 ,并探讨了影响油菜再生频率以及遗传转化效率的几个因素。对部分经卡那霉素筛选得到的再生植株进行了PCR检测 ,其中 70 %以上的卡那霉素抗性植株表现阳性 。

通过根瘤农杆菌介导法获得菊花转基因植株

以带叶茎段为外植体，通过根癌农杆菌介导法，将兔防御素NP－1基因导入菊花品种“001”中。经梯度卡那霉素（kanamycin，Km）筛选，获得了大量Km抗性植株，其中部分Km抗性植株经Southem杂交鉴定为转基因植株。从而成功地建立了菊花遗传转化系统，为菊花分子育种奠定了基础。

农杆菌介导法与基因枪轰击法结合在植物遗传转化上的应用

根癌农杆菌介导法 Agrobacterium-mediatedtransformation 和基因枪轰击法 particlebombardmenttransformation 是植物遗传转化的主要方法.两种方法各有优缺点,农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低,遗传稳定性好;基因枪转化法不受材料基因型的限制.通过结合两种方法的优点,发展了3种农杆菌介导和基因枪轰击法相结合的遗传转化方法,分别为农杆枪法、基因枪轰击/农杆菌感染法、金粉或钨粉包裹菌体细胞作为微弹轰击法.对3种结合转化方法的技术途径、原理、转化受体及研究进展等方面进行了综述.

农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因sb401导入水稻

培育高赖氨酸的水稻品种是提高稻米营养品质的重要途径。本研究利用农杆菌介导法将水稻胚乳特异表达启动子PGlu驱动的马铃薯花粉特异水溶性蛋白基因sb401导入粳稻品种日本晴和籼稻恢复系501R的幼胚愈伤组织中,以期提高水稻胚乳中赖氨酸的含量。经PCR检测,从70株T0再生植株中筛选出18株转基因植株(日本晴13株,501R5株)。对转基因植株的Southernblotting分析表明,sb401基因已经转入并整合进了水稻基因组中。测定10株T0代转基因植株成熟种子的总蛋白含量和赖氨酸含量,结果表明,有8株的总蛋白含量,5株的赖氨酸含量皆提高了20%以上;其中,8号样品(日本晴转基因植株)的种子总蛋白含量和赖氨酸含量分别为10.5%和0.383%,与对照相比分别提高了32.74%和35.34%,表明sb401基因在大部分转基因植株中的翻译水平上得到了比较有效的表达。

谷子花粉介导法转几丁质酶基因的研究

以晋谷 2 1号A不育系材料为受体 ,以质粒pGLⅡ -RC - 1为供体 ,在 10 %浓度的蔗糖溶液中 ,加入花粉与含有质粒DNA ,应用YKH -I型液体快速混合器进行震荡处理得到花粉处理液 ,然后辅以人工授粉的方法将花粉处理液滴注晋谷 2 1号不育系的柱头上获得种子 ,将F1的种子经除草剂筛选和PCR检测 ,有目的基因特异带出现。实践证明 :利用花粉介导法进行谷子几丁质酶基因转移方法可行 ,为谷子转基因提供了一个新方法。

利用农杆菌介导法将查尔酮合酶基因导入大岩桐

本项研究通过植物基因工程技术,以改变花色为目的,对花卉进行遗传改良,以期产生新的花色品种,来改变现有花卉花色单一、品种缺乏的现状,丰富我市花卉品种资源。在应用转基因技术进行定向改良花色的研究中用的最多也最成功的基因就是:查尔酮合酶基因。查尔酮合酶(Chalconesynthase,CHS)是花色素合成途径中的一个关键酶,它在植物中表达的量可能影响花的颜色。本项目以查尔酮合酶(Chalconesyn-thase,CHS)基因作为目的基因,以大岩桐为研究对象。具体从矮牵牛(Petuniahybrida)特定发育阶段的花瓣的cDNA中,克隆到查尔酮合酶基因CHSA,进行质粒的重组后,插入到含有花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子的植物中间表达载体中pBI121中,转化农杆菌LBA4404。通过农杆菌介导法(之叶盘法)遗传转化大岩桐,具体过程如下:农杆菌LBA4404pBI121chsA的培养→农杆菌与大岩桐叶盘共培养→脱菌筛选→抗性芽的扩繁与继代培养→抗性株的生根筛选→移栽成活。经过研究,成功地得到大岩桐转化植株,其中8个株系的转基因植株经PCR检测呈阳性,证明外源基因已整合进入受体植物。有一株玫红品系植株的花瓣上出现了白色的不规则斑点。

农杆菌介导法获得优良玉米自交系转Bt基因植株

用根癌农杆菌介导法将携带有苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因(Bt)和PPT乙酰转移酶基因(bar)的质粒pGBIL04导入优良玉米自交系340和4112经预培养的幼胚初始愈伤组织,抗性植株平均发生频率为11.21%,经PCR、PCR-Southern和Southernblotting检测证明外源基因Bt已稳定整合到13株玉米基因组中,平均转化率为2.35%。降低共培养温度到22℃的转化率最高达4.44%,Basta抗性检测bar基因也同时转移进再生植株中,部分转化植株已经结实。

提高农杆菌介导法将PinII抗虫基因导入滇型水稻的转化效率

本论文对滇型水稻品种玉优一号、HT - 7的愈伤组织诱导、基因转化及植株再生进行了研究。通过实验 ,将质粒 pCAMBI130 0上带有的PinⅡ抗虫基因导入水稻愈伤组织细胞中 ,获得了一批Hyg抗性植株 ,185株抗性苗经过PCR检测和叶片对潮霉素的抗性试验 ,证明其中有 5 9株为转基因阳性植株。结果显示 ,受体、农杆菌状态以及共培养方式等是影响基因转化效率的关键因素 ;以叶片对潮霉素的抗性作为转基因植株的快速筛选是可行的 ,大大提高了检测效率。

利用农杆菌介导法将抗虫基因和高赖氨酸蛋白基因导入超级杂交水稻亲本材料1826中

超级杂交水稻的培育、推广和应用可显著提高水稻的单位面积产量,但许多超级杂交水稻存在抗虫能力较低、品质较差的问题。1826是一个优良的超级杂交水稻亲本材料,但抗褐飞虱能力低,必需氨基酸赖氨酸的含量低。本研究利用基因工程技术将CaMV 35S启动子引导的半夏凝集素基因(PTA)和水稻胚乳特异表达启动子(Glutelin-B1 promoter)引导的马铃薯高赖氨酸蛋白基因(SB401)同时转入1826成熟胚诱导的愈伤组织中,获得了同时含PTA和SB401的转基因植株。本研究为提高1826的抗褐飞虱能力和赖氨酸含量打下了基础。

花生CpTI基因转化—花粉介导法

利用花粉作为外源基因的载体将抗虫基因(CpTI基因)转入花生中。以花生仲恺01号为受体,以PCB302-3质粒外源基因为供体。在花生开花期,收集花粉与质粒DNA混合并附加超声波处理,然后以人工授粉的方法将外源基因导入受体中。利用花粉作为载体介导外源基因转化,避免了传统的基因枪法和农杆菌转化所要求的组织培养技术,转化方法简单、易操作,具有很强的实用性。

花粉介导法将萝卜抗菌肽基因导入野罂粟的影响因素研究

以野罂粟开放花蕾为受体,载有萝卜抗菌肽AFP(antifungal protein)基因的质粒pBIAFP为供体,在不同浓度的蔗糖溶液中,加入新鲜花粉与含有目的基因的质粒DNA,应用SKH250LH型超声波震荡器进行震荡处理得到花粉处理液,在不同的时间用带有Coolsnap的OLYPUS光学显微镜下观察野罂粟花粉萌发情况;在不同授粉时间后,辅以人工授粉的方法将花粉处理液滴注野罂粟柱头上,套袋后获得种子,测定其结实率。实验证明:利用花粉介导法进行萝卜抗菌肽基因转化,以蔗糖浓度11%,处理后10-15h后的野罂粟花粉萌发最好;在蔗糖浓度8%的溶液中,以5h的结籽量较好。后代经卡那霉素筛选和PCR检测,初步证明外源AFP基因整合到野罂粟基因组中,并获得转基因T1代。为特殊中药材育种提供一个新方法。

盆栽非洲菊基因枪介导法转化体系的建立

以非洲菊盆栽品种为材料,研究了BA和NAA不同浓度组合对不定芽诱导增殖的影响;基因枪介导法转化的不同轰击距离对转化率影响。结果表明:1.5 mg/L BA的培养基上增殖倍数最高,高达8.96倍;9 cm的目标轰击距离转化效率最高,达到10.9%。建立了非洲菊盆栽品种的再生和转基因体系,为非洲菊基因工程育种打下基础。