人恶性胸膜间皮瘤DNA从头测序及基因突变分析

通过DNA从头测序分析人胸膜间皮瘤发生的高关联度突变基因。提取恶性胸膜间皮瘤(MPM)组织和正常胸膜组织DNA,构建基因文库,用Illumina HiSeqX Ten PE 150平台测序,将测序结果与人类基因组数据库的参考序列进行比对、注释,并对测序结果进行过滤、错误率分布检查、GC含量分布检查分析。MPM组织DNA平均过滤37829946 bp,错误率小于0.12%,GC含量占41.17%,而正常胸膜组织DNA平均过滤39089681 bp,错误率小于0.1%,GC含量占41.7%,两者测序质量均在Q 30(≥80%)以上,MPM为87.43%,正常胸膜为88.36%。以上高质量测序数据通过BWA比对到参考基因组(GRCh 37/hg 19),得到最初比对序列,利用重复标记后的比对序列进行覆盖度、深度等统计,覆盖深度达到10 X以上该突变位点可信。结果显示,实验病例XL14覆盖深度达到10 X的占98.59%,覆盖率达到99.83%;对照病例Z5占98.50%,覆盖率达到99.79%。对该序列进行基因注释分析,发现一系列单核苷酸多态性、基因插入缺失、基因结构变异、基因拷贝数变异,筛选出总变异位点数29277个,可能致病的变异位点数22个,致病性的变异位点数5个,不确定变异有害性的位点数为3353个,其余变异位点均为良性。进一步对突变基因进行富集、关联性分析,预测出突变基因TXNDC2与人胸膜间皮瘤的发生高度相关,相关系数达到0.8以上;突变基因PIEN、ABCC1、UGT1A7、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A9、ALDH3B1、UGT1A5等与人胸膜间皮瘤有一定关联性,关联度在0~0.2之间。基因TXNDC2、PIEN、ABCC1、UGT1A7、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A9、ALDH3B1、UGT1A5的变异可能与人胸膜间皮瘤的发生发展有关。本实验为人胸膜间皮瘤分子诊断提供了参考。

串联质谱图谱从头测序算法研究进展

近年来,基于质谱技术的高通量蛋白质组学研究发展迅速,利用串联质谱图谱鉴定蛋白质是其数据处理中一个基础而又重要的环节.由于不需要利用蛋白质序列数据库,从头测序方法能够分析新物种或者基因组未测序物种的串联质谱数据,具有数据库搜索方法不可替代的优势.简要介绍高通量串联质谱图谱从头测序问题及其研究现状.归纳出几种典型的计算策略并分析了各种策略的优缺点.总结常用的从头测序算法和软件,介绍算法评估的各种指标和常用评估数据集,概括各种算法的特点,展望未来研究可能的发展方向.

人肝癌细胞系HLE细胞表面抗原多肽的纳升电喷雾串联质谱从头测序分析

肿瘤细胞表面的抗原多肽能够被细胞毒T淋巴细胞特异性识别而引起免疫应答,因此有可能用于研制基于多肽的抗肿瘤疫苗.用弱酸将人肝癌细胞系HLE 细胞表面抗原多肽和人正常肝细胞表面多肽洗脱后,经RP-HPLC分离,选择HLE细胞表面特异性多肽进行纳升电喷雾串联质谱（nanoESI-MS/MS）测序,共测定5个色谱峰中的20个多肽序列,分子量分布范围为1000～2000 Da.借助MasSeq软件分析出其中12个多肽的序列.经数据库查寻,其中的3个肽段分别来自钙调节蛋白、核蛋白S19和伴侣蛋白10.这些多肽的生物学功能及与肿瘤的关系值得深入研究.该研究表明nanoESI-MS/MS是测定微量混合多肽序列的最有效方法.

磺基异硫氰酸苯酯化学辅助方法对新蛋白质进行从头测序

利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间(MALDI-TOF-TOF)质谱结合磺基异硫氰酸苯酯化学辅助的方法对一种从拟青霉(Paecilomyces bainier)分离纯化到的新人参皂苷Rb1水解酶的部分肽段进行了从头测序.共获得了这个新蛋白质8条肽段的序列,一些磺化后信噪比非常低的肽段也获得了比较完整的序列.同时通过从头测序分析确定了一对甲硫氨酸非氧化和氧化肽段的序列.结果表明,磺化后的肽段离子化效率大大增强,在PSD(源后裂解)过程中只有肽键断裂产生的C端的碎片离子系列(y离子系列)出现在质谱图中,图谱背景清晰,信噪比高,单纯的y离子系列使得图谱解析变得非常容易.将这8条序列在NCBI(美国国立生物技术信息中心)数据库中进行BLAST(蛋白质序列比对工具)检索印证这种β-葡萄糖甘酶是一个新蛋白质,发现的两条相对保守的序列为进一步研究奠定了基础.

基于图卷积神经网络的串联质谱从头测序

在蛋白质组学中从头测序是串联质谱肽段测序的重要方法之一,其具有不依赖于蛋白质数据库的优势,并在测定未知物种蛋白序列、单克隆抗体测序等领域中起着关键作用。然而由于从头测序的复杂性,导致其测序的准确率远低于数据库搜索方法,制约了从头测序的广泛应用。针对从头测序准确率低的问题,提出一种基于图卷积神经网络(GCN)的从头测序方法denovo-GCN。该方法将质谱中谱峰之间的关系用图结构表示,并从每个相应的肽碎裂位点提取谱峰特征,然后通过GCN预测当前碎裂位点处的氨基酸类型,最后逐步组成完整的肽序列。通过实验确定了GCN模型的层数、离子类型组合和测序使用的谱峰数量这3个影响模型的重要参数,并将多个物种数据集用于实验对比。实验结果表明,该方法在肽水平上的召回率比基于图论的从头测序方法Novor、pNovo提高了4.0~21.1个百分点,比基于卷积神经网络(CNN)和长短期记忆(LSTM)网络的DeepNovo提高了2.1~10.7个百分点。

海洋琼胶降解菌FG15基因组从头测序分析

为充分了解琼胶降解菌FG15的基因功能和代谢途径,本研究使用SOAP de novo 2.04对Illumina Hiseq2000平台测序产生的基因片段进行了拼接和组装,同时利用Glimmer 3.02来预测基因的开放性阅读框,并采用蛋白质直系同源基因簇(COG)、基因本体数据库(GO)以及京都基因和基因组百科全书(KEGG)的数据来预测其基因功能,获得了代谢途径.结果表明:FG15的基因组大小为5.10 Mb,G+C含量为44.58%,共有38条Scaffolds,4 922个开放性阅读框,82个tRNA,2个rRNA;通过COG分析可将菌株FG15注释到22种COG功能类型,主要包括细胞代谢、细胞信号转导等;利用GO注释可将FG15注释到3大类39个GO功能亚类上;KEGG分析能将其定位到154个代谢通路中,包括物质代谢、次生代谢产物的生物合成等.次生代谢产物的合成代谢途径精确显示,FG15能合成青霉素和头孢菌素,且其与抗生素抗性实验的结果一致.研究结果为FG15功能基因组学的研究和相关次级代谢产物的生物合成途径以及异源表达的研究提供了理论基础.

中药植物川牛膝基因组从头测序及分析

川牛膝是我国重要大宗药材,但近年来品质退化严重,品种真伪混杂。为深入研究川牛膝有效成分积累的分子基础,采用第二代测序技术利用Illumina Hi-seq 2000测序平台对川牛膝进行全基因组测序,使用AByss进行初步组装,得到一个包含大量基因组序列信息的数据集,并对其进行重复序列及编码序列注释。在该测序结果基础上,初步预测得到川牛膝体内甾体合成途径,并对鉴定川牛膝真伪的SCAR分子标记进行了初步定位,为研究川牛膝主要有效成分杯苋甾酮的合成途径,改良川牛膝品质提供了基础。

肽序列从头测序算法

从头测序为蛋白质组研究提供了一种不用借助于任何蛋白质序列数据库信息,直接解读串联质谱数据的方法。其基本算法主要由4个部分组成:质谱图的构建,离子类型的确定,测序算法以及打分算法。质谱图的构建和离子类型的确定是从头测序算法的基础。测序算法是从头测序算法的关键,比较常用的是动态规划算法。打分算法是整个从头测序算法的核心部分,各种从头测序算法对基本算法的改进通常都是围绕着打分算法进行的。

红毛藻血管紧张素转化酶抑制肽的筛选及其稳定性评价

本实验以红毛藻为原料,利用酶解法及超滤分级制备获得不同分子质量的肽组分,经高效液相色谱法测定体外血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制活性发现F2组分(800~2000 Da)的ACE抑制率最高;采用液相色谱-串联质谱技术和PEAKS Studio软件的de novo从头测序对F2组分进行氨基酸序列鉴定,并结合分子对接筛选出与ACE稳定结合的6个ACE抑制肽。利用固相合成法制备预测肽并经体外ACE抑制活性验证,发现L1(LVLLFLFGE)的ACE抑制活性最高,半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))为14.22μg/mL。分子对接结果表明,L1对ACE的抑制主要归因于其能够与ACE的活性口袋形成氢键相互作用。最后,探讨温度、pH值、金属离子、光照类型和模拟胃肠道酶系消化对L1稳定性的影响,结果表明L1具有较好的热稳定性和离子强度稳定性,pH>2时抑制活性逐步减弱,紫外光处理会影响其抑制活性,体外模拟胃肠液处理后L1的ACE抑制率虽然显著降低,但仍具有较高ACE抑制活性。

序列组装在蛋白质测序技术中的方法

从头测序技术是应用于蛋白质组学的测序方法。与其他测序技术相比,从头测序技术的优势是在不依赖数据库搜索和无需PCR扩增的基础上对DNA或者蛋白质进行测序。目前,从头测序技术也广泛应用于蛋白质组学领域。研究人员为了将测序技术所得的短序列reads进一步组装成一条完整的序列,就需要使用序列组装方法。首先,介绍了测序技术的发展背景、从头测序技术的概念以及序列组装算法的出现;其次,总结了基于Overlap⁃Layout⁃Consensus策略、deBruijn图策略和Greedy策略的序列组装算法的具体概念和成果;最后,阐述了序列组装算法面临的挑战。

高通量DNA测序数据压缩研究进展

针对高通量DNA测序技术发展产生的DNA测序数据量猛增,数据压缩技术是解决存储和传输高通量DNA序列数据问题的重要方法之一.评述DNA测序数据传统压缩方法包括替代法和统计法,以及基于参考基因组的高通量DNA测序数据压缩方法,介绍并比较重测序数据压缩、从头测序数据压缩、质量分数压缩和压缩数据检索的代表性算法,研究高通量DNA测序数据压缩面临的挑战及对未来的展望.

串联质谱在多肽测序中的应用

采用纳升喷雾(Nano)技术和碰撞诱导解离(CIDcollisioninducddissociation)方法,在电喷雾-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOFelectrspectrometryionization-quadrupole-timeofflight)上,对两种序列部分未知的天然多肽进行从头测序(denovosequence),结果证明质谱的denovosequence可以方便有效的解决传统的Edman降解法测序中常见的实际问题,如末位残基的丢失,赖氨酸和亮氨酸难鉴定等,此方法的建立是对Edman降解测序法很好的补充.

利用磺基异硫氰酸苯酯化学辅助方法鉴定磷酸化肽修饰位点

利用MALDI-TOF质谱结合磺基异硫氰酸苯酯(SPITC)化学辅助的从头测序(de novosequencing)方法,将用固相金属离子亲和色谱(immobilized metal affinity chromatography,IMAC)选择性地从混合物中亲和提取的磷酸肽进行磷酸化位点测定,该方法只有肽键断裂产生的带C端的碎片离子系列(y+离子系列)出现在质谱图中,图谱背景清晰,信噪比高,单纯的y+片段离子系列使得谱图解析变得非常容易,对于多磷酸化肽的磷酸化位点,不需借助于任何软件,只需简单地计算两峰之间的分子量之差即可确定.

两种蜘蛛多肽毒素的电喷雾电离质谱法序列分析

虎纹捕鸟蛛毒素-(HWTX-)和敬钊缨毛蛛毒素-(JZTX-)是两种蜘蛛多肽类神经毒素。它们的大部分氨基酸序列已由Edman降解法测出,但仍有部分序列由于某些原因未能确定。为了鉴定未知部分的序列,利用电喷雾电离-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Qq-TOF-MS)对两种蜘蛛毒素的酶解产物进行分析,获得其酶解片段的一级(MS)和二级(MS/MS)图谱,在用软件和手工的方式对含有未知序列的肽段进行解析后,得到未知部分确切氨基酸序列。研究表明:利用质谱的从头测序(denovosequencing)方法获得HWTX-和JZTX-完整的氨基酸序列。该方法在蛋白质和多肽的结构分析和鉴定与传统方法相比具有高灵敏度和快速的优势,是对传统Edman化学降解法的一个很好的补充。

芋螺毒素cr5a的电喷雾四极杆飞行时间串联质谱分析

cr5a是从中国南海软体动物芋螺的毒液中分离出的一种新的芋螺毒素。为了验证已得到的氨基酸序列分析结果,利用纳升电喷雾四极杆飞行时间串联质谱对cr5a的碘代乙酰胺(IAM)衍生物进行了串联质谱从头测序分析,采用MassLynx 3.5系统进行数据采集与处理,通过MassSeq软件提取串联质谱所得的氨基酸序列。软件提取的序列CCKFQFLNFCCNE与N末端序列分析结果相符,使得cr5a的氨基酸序列得到进一步验证。

基于质谱的BLAST方法在金鱼胚胎蛋白质鉴定中的应用

未知基因组及蛋白质序列数据库有限的物种的蛋白质组学分析是当前一些非模式生物物种蛋白质组学研究领域的瓶颈之一.基于同源性搜索的BLAST方法(MSBLAST),是近年新发展起来的一种用于未知基因组的蛋白质鉴定的搜索工具,已成功应用于许多未知基因组物种的蛋白质鉴定.SPITC化学辅助方法是本实验室建立的一种改进的denovo质谱测序方法.采用MSBLAST方法对经Mascot软件数据库搜索未能鉴定到的19个金鱼胚胎蛋白质进行鉴定,其中12个蛋白质是直接测序后进行MSBLAST搜索得到的结果,另外7个蛋白质是联合MSBLAST和SPITC衍生方法得到的鉴定结果.实验结果证明,采用MSBLAST方法进行蛋白质的跨物种鉴定具有可行性和可靠性,给蛋白质的跨物种鉴定提供了一条新的途径.

串联飞行时间质谱的碎片离子相对强度在区分亮氨酸和异亮氨酸残基中的应用

研究肽段从头测序需要解决的问题之一是区分亮氨酸和异亮氨酸残基,利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）所产生的w型离子区分这两种氨基酸残基是目前最常用的方法。本研究以6对合成的同分异构肽段（由7～15个氨基酸构成）为例,来说明w离子信号强度较低且有时不能产生,在区分多肽中的亮氨酸和异亮氨酸时受肽段长度和序列的限制。而亮氨酸与异亮氨酸的变化会导致亚胺相关离子、内部断裂离子、b-型和y-型离子等相对强度的微小变化。通过比较这些骨架断裂变化所产生的微小差异,可为区分肽段中的亮氨酸和异亮氨酸残基提供新的线索和判据。

基于生物质谱技术的磷酰化修饰策略在多肽测序中的应用

该文建立了一种利用磷酰化修饰结合电喷雾质谱(ESI-Q-TOF)测定多肽氨基酸序列的有效方法。利用Atherton-Todd反应,以二丙基亚磷酰酯(DPP)为磷酰化试剂,应用生物质谱技术,对磷酰化修饰后的5种模型肽的磷酰化反应情况进行了系统研究,考察了磷酰化肽的二级质谱特征,并与未经磷酰化反应的肽的二级质谱特征对比。结果表明,经过磷酰化修饰后,肽的二级质谱中的a1离子信号强度明显增加,可以准确鉴定其N端氨基酸;b系列离子信息完整,信号强度增强,使得多肽C ID测序的谱图简单、清晰,有利于肽的氨基酸序列的测定;赖氨酸(K,128.10 u)和谷氨酰胺(Q,128.13 u)两种氨基酸质荷比相近,由于二者磷酰化修饰后的差异性,使其得到准确区分。经过5种已知氨基酸序列的模型肽的磷酰化后结合质谱技术进行氨基酸序列测定验证,结果表明该方法简单、快速、准确,提高了利用质谱技术进行多肽测序的准确度和灵敏度,可为蛋白质组学研究提供有效的技术手段。

基于nanoUPLC-MS/MS的螺旋藻游离肽组成分析

为了研究螺旋藻中的多肽成分,以钝顶螺旋藻为原料,采用超滤法提取螺旋藻中的游离肽,利用nanoUPLC-MS/MS和PEAKS Studio分析谱图信息,结合NCBI数据库进行比对和从头测序分析,获得游离肽的结构组成和百分含量信息。结果表明,利用数据库比对法和从头测序法,分别得到可信的游离肽4485个和20597个,匹配到的蛋白质有1036种。数据库比对结果中的游离肽主要为七肽到二十一肽,少量为二十一肽以上;从头测序结果中游离肽主要为二肽到十六肽,少量为十六肽以上。数据库比对结果中百分含量最高的游离肽是十肽,为15.95%;从头测序结果中百分含量最高的是五肽,达到24.09%。本研究结果为螺旋藻蛋白资源的进一步开发和利用提供了依据。

我国科学家绘成野生稻全基因组框架图谱

中科院昆明植物所高立志研究员团队日前完成普通野生稻基因组高覆盖的序列测定、拼接和组装工作,获得普通野生稻全基因组从头测序的框架图,