脱氧雪腐镰刀菌烯醇对BHK-21细胞的线粒体膜电位及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

为了探讨脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)对体外培养仓鼠肾细胞(BHK-21)的线粒体膜电位及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响,采用细胞培养、流式细胞术、免疫细胞化学染色等方法,研究DON对细胞早期凋亡率、线粒体膜电位及Bax和Bcl-2蛋白表达的变化。结果显示:不同浓度的DON均可诱导BHK-21细胞凋亡,各浓度组的凋亡率都显著高于对照组(P<0.05);DON可使BHK-21细胞线粒体膜电位下降,且表现出剂量和时间效应关系。免疫组织化学染色显示,DON处理细胞24 h,Bax蛋白表达显著高于对照组,而Bcl-2蛋白表达均低于对照组。上述结果表明:DON诱导了BHK-21细胞凋亡和线粒体膜电位下降,Bax表达增强而Bcl-2表达下降是DON诱导BHK-21细胞凋亡的分子机制之一。

利用慢病毒包装小窝蛋白-1过表达稳定细胞株的构建

目的利用慢病毒包装构建过表达小窝蛋白-1(Caveolin-1)的稳定细胞株。方法PCR扩增仓鼠肾细胞BHK-21中Caveolin-1基因,克隆至pTRIP-CMV载体中,构建重组表达质粒pTRIP-Cav1,将其与对照质粒pTRIP-EGFP分别经LipofectamineTM 2000介导转染HEK-293T细胞,收集包装的慢病毒并转导至BHK-21细胞,构建过表达Caveolin-1的细胞株BHK-Cav1及过表达绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的对照细胞株BHK-EGFP。Western blot、qRT-PCR、免疫荧光法验证细胞株的稳定性及过表达特性,同时检测细胞活力。结果经双酶切及测序鉴定,重组表达质粒pTRIP-Cav1构建正确。与BHK-21细胞比较,各代次BHK-EGFP细胞中EGFP荧光明显,BHKCav1细胞中Caveolin-1蛋白表达水平增加,mRNA水平显著增加(P<0.01),且表达水平不随细胞代次的增长而改变。BHK-Cav1和BHK-EGFP细胞活力与BHK-21细胞比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论成功构建了Caveolin-1过表达细胞株BHK-Cav1,其具有较好的稳定性,为下一步研究病毒通过Caveolin依赖型内吞途径感染BHK-21细胞奠定了基础。