cDNA代表性差异分析和抑制性减法杂交技术的比较

本文就cDNA代表性差异分析和抑制性减法杂交这两种技术的主要原理、基本操作过程和优缺点进行了介绍和比较,并展望了这两种技术在海洋生物技术领域的应用前景。

应用代表性差异分析法筛选人癌候选抑癌基因

运用ｃＤＮＡ代表性差异分析法（ｃＤＮＡｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ，ｃＤＮＡＲＤＡ），以正常人鼻咽上皮细胞及鼻咽癌ＨＮＥ１细胞作为比较的样品来源，分离了四个在鼻咽癌中缺失的ｃＤＮＡ片段．以此四个片段作探针，分别进行ＤＮＡ杂交、ＲＮＡ杂交，结果显示，这些差异性的ｃＤＮＡ序列确实来自正常人鼻咽上皮且只在其中表达和／或在鼻咽癌ＨＮＥ１中表达降低，并在鼻咽癌病人中存在不同程度的缺失．序列分析结果表明这些差异性表达的基因为具有相当抑癌基因功能的已知基因和可能与鼻咽癌相关的抑癌基因的新基因．从而说明ｃＤＮＡＲＤＡ是一种高效、敏感。

小菜蛾对杀螟丹抗性相关序列的代表性差异分析

采用代表性差异分析方法 ,以小菜蛾的敏感品系作为驱赶扩增子 ,抗杀螟丹近等基因系作为检测扩增子 ,通过 3轮消减杂交得到大小为 15 0～ 30 0bp的差异片段 ,经亚克隆测序并与GenBank等数据库同源比较 ,发现其中一个亚克隆序列与P4 5 0基因有部分同源性 ,其余亚克隆与已知基因序列的同源性较低 ,判断这些序列可能是新基因的片段。

代表性差异分析技术与疾病基因的克隆

本文结合代表性差异分析的技术原理和方法 ,介绍了近年来该方法在肿瘤基因克隆、新病原体的筛查和多态相关标志物的分离等方面的应用 ,并提出了存在的问题和今后的展望。

对代表性差异分析方法的改进

对常用的代表性差异分析(RDA)方法进行了改进.利用模式系统进行的实验结果表明:改进后的RDA方法不仅保留了原有的优点,而且大大降低了实验成本,简化了实验操作,只需1周即可完成原本需要3周的实验操作,增强了该技术的实用性.

一种基因克隆的新策略—cDNA的代表性差异分析法

ｃＤＮＡ的代表性差异分析法是近年发展起来并逐步得到广泛应用的一项基因克隆新策略。它以基因组代表性差异分析法为技术基础，并吸取了差异显示法的优点，具有灵敏、高效及假阳性率低等特点。在肿瘤基因克隆、病因分析和病源筛选、发育的基因调控以及不同细胞因子和受体对基因表达的调控等方面的应用，已日益引起人们的重视。

代表性差异分析法在基因克隆中的应用及其发展

分离特异性基因的研究是分子生物学研究的前沿课题。目前代表性差异分析法通过制备扩增子，消减杂交和动力性富集，使捕获靶基因的研究更加高效和完善。在此基础上，又发展了抑制性消减杂交、ｃＤＮＡ代表性差异分析法、ＭＳ－代表性差异分析法及ＭＳ－代表性差异分析法－ＷＥＥＣ。本文仅对这些方法的特点及其在肿瘤、基因表达、遗传性分析及致病因子的研究方面进行论述。

cDNA代表性差异分析法筛选二羟环氧苯并芘致癌相关基因片段

目的 采用cDNA代表性差异分析法 ,分离二羟环氧苯并芘诱导恶性转化的细胞与对照组细胞之间的差异表达基因。方法 先从细胞中提取mRNA并合成双链cDNA ,双链DNA以Sau3AI内切酶消化 ,连接接头并经PCR扩增。以BPDE诱导恶变细胞的cDNA为“检测子”、以对照组细胞cDNA为“驱赶子”进行消减杂交。结果 经 3轮消减杂交后分离出 5个cDNA片段 ,在琼脂糖凝胶上清晰显示 2 10bp以下的 5条条带 ,这些片段分别与总RNA作Northern印迹杂交证实它们均来自BPDE诱变的细胞。结论 cDNA代表性差异分析法是筛选化学致癌相关基因的有效。

代表性差异分析比较两株来自不同地区的猪源Lactobacillus菌株

【目的】对分离自猪肠道的乳酸杆菌S1菌株进行鉴定,并比较该菌株与同种的001T菌株的基因差异。【方法】对S1菌株进行16SrRNA基因序列分析和种特异PCR检测,并且对S1菌株和Lactobacillus sobrius 001T进行代表性差异分析(Representational difference analysis,RDA)。【结果】16SrRNA基因序列分析表明,与S1菌株最相似的已知菌为L.sobrius。变性梯度凝胶电泳分析显示,仔猪空、回肠细菌图谱中有一与S1菌株有相同迁移位置的优势条带,克隆、测序鉴定表明,与该条带相匹配的16SrRNA基因克隆(CloneS)的最相似已知菌也为L.sobrius。16SrRNA基因系统进化分析表明,S1菌株与CloneS和L.sobrius16SrRNA基因序列同源性分别为99.8%和99.6%。L.sobrius特异性引物也可以扩增S1株菌的16SrRNA基因的特定片段。因此S1菌株可被确定为L.sobrius。RDA对菌株S1和同种的猪源L.sobrius001T菌株的基因差异进行分析,未发现这两株菌的基因组差异。【结论】猪肠道乳杆酸菌S1菌株属于L.sobrius,其与猪源L.sobrius001T菌株为相似菌株。

甲基化CpG岛扩增联合代表性差异分析方法在筛查人非小细胞肺癌组织中高甲基化修饰序列的应用

目的探讨甲基化CpG岛扩增联合代表性差异分析(MCA/RDA)方法在筛查人非小细胞肺癌(NSCLC)组织中高甲基化修饰序列的应用。方法以92对NSCLC和癌旁对照组织DNA为研究对象,应用MCA/RDA方法筛查肺癌组织DNA中高甲基化修饰的CpG岛序列。应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和甲基化特异性PCR(methylation-sensitive PCR,MSP)技术,分析胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-4)基因启动子区CpG岛的甲基化修饰与基因表达的相关性。结果获得5个经Slot Blot验证在肺癌组织中高甲基化修饰的CpG岛序列(IGFBP-4、KLK10、ADAM23、GADD45G和DUOX1)。甲基化抑制剂5-aza-2'-deoxycytidine处理NSCLC细胞可明显上调IGFBP-4基因的表达。在41例(44.6%)癌组织中检测到IGFBP-4表达水平显著低于癌旁对照组织。47例(51.1%)癌组织检测到IGFBP-4高甲基化显著高于癌旁组织的检出率(16.3%,15/92;P<0.001)。IGFBP-4高甲基化与基因表达呈负相关(r=-0.396,P<0.001)。IGFBP-4高甲基化与TNM分期(P=0.013)和淋巴结转移(P=0.022)相关。结论应用MCA/RDA方法筛查到5个在NSCLC组织中高甲基化修饰的CpG岛序列,并证实IGFBP-4启动子区CpG岛的高甲基化可能通过抑制基因的表达参与了NSCLC的发生。

代表性差异分析技术及其应用

同一物种不同基因组的表达存在着差别,这些差别有的是通过遗传获得的,有的是某些病原引起的。代表性差异分析技术(representational difference analy-sis,RDA)正是这样一种分析DNA序列差别的有效方法,它能同时分析与某些疾病表型密切相关的基因变化或某些感兴趣的定点基因克隆。 分子生物学技术不断进步的今天。

抗双酰胺类杀虫剂小菜蛾的cDNA代表性差异分析

小菜蛾(Plutella xylostella L.)为世界性十字花科蔬菜的重要害虫之一,由于其繁殖力较强,世代重叠严重,加上一些地区生产上用药频繁,导致小菜蛾对多种杀虫剂产生了抗性。随着氯虫苯甲酰胺和氟苯虫酰胺等双酰胺类杀虫剂的大量应用,小菜蛾对该药剂的抗性问题也日益受到关注。为了研究小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性机制,本试验利用敏感品系cDNA作为"驱动子"(Drivers),小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺品系、抗氟苯虫酰胺品系cDNA作为"检测子"(Testers),通过改进的cDNA代表性差异分析法(cDNA rrepresentational difference analysis,cDNA RDA),在小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺品系、抗氟苯虫酰胺品系中获得2个与28S rRNA基因有较高同源性的序列,其中一个序列(DP3-1)与棉铃虫细胞色素P450类TBP蛋白同源性为97%,另外一个序列(DP3-2)与赤拟谷盗的TcasGA2_TC010626蛋白基因同源性为93%;此外,两个抗性品系中各获得一个未知序列。本研究为进一步探讨小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性机制提供了新线索。

代表性差异性分析 一种分析复杂但高度相关基因组间差异性的方法

本文介绍了一种新方法——代表性差异性分析,它是一种有效地发现复杂基因间差异的方法,已被广泛地应用于肿瘤、微生物、寄生虫等领域,如克隆肿瘤的缺失基因,新的致病基因的发现。它不需要基因图谱即可快速分离出相关的多态性标记物。

代表性差异分析和消减杂交差异显示分析方法在克隆差异基因方面的灵敏度比较

目的建立目的基因差异信息标量化的配对研究体系，比较经典的代表性差异分析（RDA）方法和消减杂交差异显示分析（SHDD）方法在克隆差异基因方面的灵敏度。方法以人类乳头瘤病毒（HPV）DNA为模板行PCR扩增获得376bp和869bp两个片段，作为差异目的基因掺入人血基因组DNA，获得5组目的基因拷贝数呈梯度差异的配对研究体系，比较RDA和SHDD方法的检测灵敏度。结果应用RDA方法可克隆得到上调6倍的376bp片段和上调8倍的869bp的HPV片段，而应用SHDD方法可克隆到上调4倍的两种差异片段。结论SHDD方法由于采用了两样本差异产物问的双向均衡消减杂交，避免了经典RDA方法不均衡消减杂交导致的差异信息的丢失，在克隆较弱的差异信息，尤其是较长差异信息方面，显著优于经典RDA方法。

代表性差别分析方法及其改进

代表性差别分析方法(RDA)以及改进的cDNA代表性差别分析方法(cDNARDA)是近年发展起来的新技术,在基因差异表达分析和筛选差异基因的研究中有着广泛的应用前景。本文较为详细地介绍了代表性差异分析方法的基本原理和技术流程,同时针对该技术存在的缺陷和不足,总结了近年来在具体应用过程中对代表性差别分析方法的一些优化改进。

基于PCR的基因差异表达分析技术

基因差异表达分析是研究许多生物学过程的分子基础的一条直接、有效的途径。自DDRT-PCR技术建立以来,一系列基于PCR的基因差异表达分析技术,如SAGE、SSH、RDA和DNA微阵列等相继发展起来,为分析和克隆差异表达的基因提供了更为快速、灵敏的工具。本文对这几种方法进行了简要综述,比较了不同方法的优缺点,并展望了今后基因差异表达研究技术的发展方向。

胸膜肺炎放线杆菌菌影疫苗免疫仔猪前后差异表达基因的鉴定与分析

为获得胸膜肺炎放线杆菌(APP)菌影诱导的仔猪淋巴细胞差异表达基因,本研究应用代表性差异分析技术构建APP菌影免疫前后正、反两个外周血淋巴细胞cDNA差减文库,并对文库中的差异基因进行克隆、测序和生物信息学分析。试验结果表明,正向文库中获得11个表达丰度上调的基因,其中7个基因与已知基因具有相似性,4个为未知新基因,经进一步功能注解发现,正向文库功能基因包括免疫信号传导相关蛋白RhoE、防御相关蛋白糖基转移样酶-1、上皮膜蛋白2、白介素-17和肿瘤免疫相关的周期素依赖性蛋白激酶抑制因子3等,这些功能基因表达丰度升高,可能有助于机体建立抗APP的免疫应答。

应用cDNA RDA联合cDNA阵列点杂交筛查差异表达基因的方法学分析

目的探讨采用cDNA代表性差异分析法(representational difference analysis,RDA)联合cDNA阵列点杂交筛查差异表达基因的可行性及局限性。方法将17β雌二醇(E2)干预MG63细胞cDNA分别制备成检测和驱赶扩增子进行消减杂交作为整个cDNARDA的内部质控,以干预组扩增子、对照组扩增子和第4轮双向消减产物为模板,行内对照基因GAPDH的RTPCR进行消减效率分析,Southern杂交证实消减产物来源,快速Northern杂交证实消减产物确实呈差异表达;克隆到pGEMTeasy载体,转化JM109感受态细菌并铺Amp+XgalIPTG琼脂皿得到差异表达文库,随机挑取白色单菌落培养后点成尼龙阵列膜,分别与干预组和对照组扩增子及第4轮消减产物杂交,得到差异表达克隆用于后续研究。结果内部质控结果显示,第3轮消减杂交后,PCR未见差异性产物扩增;cDNARDA共得到3个雌二醇诱导表达上调条带和2个表达下调条带。Southern杂交结果显示在检测扩增子及第1～4轮差异产物中均可见阳性杂交信号,而驱赶扩增子中无杂交信号;快速Northern杂交证实干预组细胞总RNA的两处杂交信号均较对照组强;阵列膜同一克隆两个点对应的杂交信号呈高度相关一致性,共得到120个差异表达克隆(56个表达上调,64个表达下调)。结论cDNA代表性差异分析法联合cDNA阵列点杂交方法能有效快速高通量筛查E2诱导MG63差异表达基因。

一种新的基因克隆方法——消减杂交差异显示分析方法

消减杂交差异显示分析方法(subtractivehybridizationdifferencedisplay,SHDD)是近年来在cD-NA代表性差异分析方法(cDNARepresentationalDifferenceAnalysis,cDNARDA)和mRNA差异显示分析方法(mRNADifferentialDisplay,mRNADD)的基础上发展而来的一种克隆基因的新方法。SHDD方法结合了cDNARDA的特异性特点与mRNADD在双向筛查差异片段和较高的检测灵敏度方面的优势。在具体技术路线设计上,SHDD最大的特点就是在两样本间双向一轮与二轮均衡、温和消减杂交基础上引入了同位素mRNADD差异显示技术,使得该方法在克隆低丰度信息及较弱差异信息、提高差异分析结果的特异性、减少假阳性、减少重复差异结果,提高差异分析的信息量同时又降低工作量等方面明显优于经典的mRNADD和cDNARDA方法。

差异表达基因分析法在肿瘤学研究中的运用

肿瘤发生与多种基因的表达及相互作用有关。自上世纪80年代以来，多项技术已应用于肿瘤的分子遗传学研究。本文就差异表达基因分析法(从cDNA或mRNA水平入手)包括差异显示PCR、cDNA代表性差异分析、抑制消减杂交、cDNA微阵列等概述其原理、技术路线、各自优缺点及在肿瘤学中的应用。