二次脑损伤后大鼠脑皮层代谢型谷氨酸受体亚型4mRNA的变化

目的 研究弥漫性脑损伤 (DBI)及其合并二次脑损伤 (SBI)后大鼠脑皮层代谢型谷氨酸受体亚型 4(m Glu R4)的变化及意义 .方法 SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组、单纯 SBI组、单纯 DBI组及合并 SBI组 .在 Marmarou弥漫性脑损伤模型的基础上 ,制成 SBI模型 ,于伤后 1,6 ,12 ,2 4和 72 h进行 HE染色和代谢型谷氨酸受体 4亚型(m Glu R4) m RNA原位杂交 .结果 与正常对照组相比 ,假手术组和单纯 SBI组阳性神经元数以及信号灰度均无明显改变 (P>0 .0 5 ) ;与假手术组相比 ,单纯 DBI组和合并 SBI组 ,m Glu R4m RNA表达于脑损伤后 1h即有明显增加 (P<0 .0 1) ,单纯 DBI组在 6 h达到高峰 ,合并 SBI组于 12 h达到高峰 ,此刻与单纯 DBI组相比 ,合并 SBI组亦明显增加 (P<0 .0 1) .结论 m Glu R4参与了 DBI和 SBI的病理生理过程 。

弥漫性脑损伤后代谢型谷氨酸受体亚型4及其激动剂L-AP4的作用(英文)

目的 研究弥漫性脑损伤 (DBI)后大鼠脑皮质代谢型谷氨酸受体亚型 4 (mGluR 4 )及其激动剂L 2 氨基 4 膦酰基丁酸(L AP 4 )的变化及意义。方法 16 1只SD大鼠随机分为两组。A组包括正常对照组、假手术组及DBI组。用Marmarou弥漫性脑损伤模型 ,制成DBI模型 ,于伤后不同时间进行mGluR 4mRNA原位杂交。B组包括单纯、DBI后生理盐水治疗及DBI后L AP 4治疗组。所有DBI动物伤前进行行为学训练。伤后 1h、12h脑室内分别给予L AP 4 (10 0mM ,10 μl)或生理盐水。大鼠在伤后 1、3、7、14d分批处死前进行运动和行为学检查 ,处死后检测神经元损伤数。结果 与正常对照组相比 ,假手术组阳性神经元数无改变 (P >0 .0 5 ) ;与假手术组相比 ,单纯DBI组mGluR 4mRNA表达于脑损伤后 1h即有明显增加(P <0 .0 1) ,在 6h达到高峰。与DBI后生理盐水治疗组比较 ,DBI后L AP 4治疗组神经元损伤数减少 ,神经功能检查指数增高。结论 mGluR 4参与了DBI的病理生理过程 ,具有神经保护作用。

代谢型谷氨酸受体阻断剂α-methyl-(4-tetrazolyl-phenyl)glycine对大鼠海马脑缺血耐受诱导的影响

实验采用大鼠四血管闭塞全脑缺血模型 ,用硫堇染色法和胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)免疫组化法 ,观察右侧脑室内注射Ⅱ型代谢型谷氨酸受体 (metabotropicglutamatereceptor 2 / 3 ,mGluR2 / 3 )阻断剂α methyl ( 4 tetrazolyl phenyl)glycine (MTPG)对海马CA1区神经元缺血耐受 (BIT)诱导的影响 ,以探讨mGluR2 / 3在BIT诱导中的作用。 5 4只大鼠椎动脉凝闭后分为 5组 :( 1)假手术组 (n =8) :游离双侧颈总动脉 ,但不夹闭 ;( 2 )单纯缺血组 (n =8) :夹闭双侧颈总动脉 8min ;( 3 )缺血预处理组 (n =8) :夹闭双侧颈总动脉 3min作为脑缺血预处理 (CIP) ,再灌注 2 4h后再行夹闭 8min ;( 4)MTPG +缺血预处理组 (n =2 2 ) :CIP前 2 0min右侧脑室注射MTPG ,其余步骤同缺血预处理组 ;MTPG的剂量分别为 0 4、0 2、0 0 4和 0 0 0 8mg ,以观察其剂量效应关系 ;( 5 )MTPG +单纯缺血组 (n =8) :右侧脑室注射MTPG0 2mg 2 4h后 ,夹闭双侧颈总动脉 8min。所有动物均在手术后或末次缺血后 7d处死 ,取材观察。结果如下 :( 1)与假手术组相比 ,单纯 8min缺血组海马CA1区组织学分级升高、锥体神经元密度降低 ,GFAP阳性表达增加 (P <0 0 5 ) ;( 2 )缺血预处理组的组织学分级、神经元密度及GFAP表达与假手术组相似 ,未见单纯缺?

Ⅱ、Ⅲ组亲代谢型谷氨酸受体激动剂逆转1-甲基-4-苯基吡啶离子抑制星形胶质细胞摄取谷氨酸

目的 :探讨Ⅱ、Ⅲ组亲代谢型谷氨酸受体(metabotropicglutamatereceptors ,mGluRs)激动剂对 1 甲基 4 苯基吡啶离子 (1 methyl 4 phenylpyridinium ,MPP+ )抑制星形胶质细胞摄取谷氨酸 (Glu)的影响。方法 :应用同位素标记法测定星形胶质细胞对培养液中 [3 H] D ,L 谷氨酸的摄取 ,应用四氮唑 (MTT)比色法检测星形胶质细胞的活性。结果 :MPP+ 15 0、2 0 0 μmol·L-1可以明显抑制星形胶质细胞摄取Glu ,抑制率达 5 8.3%和 70 .1% ,但并不影响细胞活性 ;Ⅱ组mGluRs激动剂 (2S ,2’R ,3’R) 2 (2’ ,3’ dicar boxycyclopropyl)glycine (DCG IV ) 0 .1、 1、 10 ,10 0 μmol·L-1和Ⅲ组mGluRs激动剂L(+) 2 amino 4 phosphonobutyricacid (L AP4 ) 1、10、10 0 μmol·L-1可以逆转MPP+ 对星形胶质细胞摄取Glu的抑制作用。结论 :MPP+ 抑制星形胶质细胞摄取Glu可能与直接影响谷氨酸转运体 (GluTs)的功能有关 ,激活星形胶质细胞上的Ⅱ、Ⅲ组mGluRs可以通过促进GluTs摄取Glu、进而降低细胞外液的Glu浓度而发挥神经保护作用。

代谢型谷氨酸受体配体(s)-4C3HPG对红藻氨酸诱导性癫痫发作活动的调节研究

目的 探讨代谢型谷氨酸受体配体 (s) 4 羧基 3 羟苯基甘氨酸〔(s) 4C3HPG〕对红藻氨酸 (KA)诱导性癫痫发作活动的调节作用。方法 选用KA诱导大鼠复杂部分性发作模型 ,采用侧脑室注射 (s) 4C3HPG法 ,观察其对大鼠癫痫发作行为学、脑电图放电时间以及对大鼠海马的组织病理学影响。结果 (s) 4C3HPG +KA组大鼠行为学评分与盐水 +KA组相比明显减少 ,在KA注射 40min之后差异有显著性 (P <0 0 1) ,湿狗样运动 (WDS)数目也减少 ,于KA注射后 40、6 0、80、10 0、12 0min差异有显著性 (P <0 0 1)。 (s) 4C3HPG +KA组大鼠EEG虽有癫痫样波发放 ,但放电持续时间较对照组缩短 ,在KA注射 30min之后差异有显著性 (P<0 0 1)。(s) 4C3HPG +KA组大鼠海马CA1、CA3区正常细胞数较对照组大鼠增多 (P <0 0 1) ,死亡或损伤细胞数要减少 (P <0 0 1)。结论 (s) 4C3HPG可减轻KA诱导性癫痫发作的程度 。

代谢型谷氨酸受体4的真核表达及其在乳腺癌细胞增殖中的作用

目的:建立代谢型谷氨酸受体4(mGluR4)在乳腺癌细胞MCF-7中高表达的模型,探索mGluR4的亚细胞定位及其在乳腺癌增殖中的作用。方法:提取MCF-7细胞总RNA并逆转录为cDNA;PCR扩增mGluR4基因;利用无缝克隆技术快速构建以pENTER为载体的mGluR4重组表达质粒;通过Western印迹和免疫荧光实验检测mGluR4在MCF-7细胞中的表达及定位;利用CCK8实验观察mGluR4对MCF-7细胞增殖的影响。结果:构建了能够在MCF-7细胞中高表达的mGluR4真核表达质粒,免疫荧光结果显示mGluR4定位于细胞膜和细胞质,CCK8实验表明高表达mGluR4显著促进乳腺癌细胞的增殖能力。结论:为探索mGluR4的相关功能制备了必要工具,为研究mGluR4在乳腺癌增殖中的分子机制奠定了基础。

代谢型谷氨酸受体4通过Rab5抑制神经病理性痛

目的探讨代谢型谷氨酸受体4（mGluR4）激活后抑制神经病理性痛的机制。方法首先取24只SD大鼠，鞘内置管后随机分为空白对照组（n=6）、假手术组（n=6）和脊神经根结扎（SNL）组（n=12）。空白对照组只行鞘内置管术，其余大鼠均于术前和术后第1～6日测量50％机械缩足阈值（50％PWT）；其次，将SNL组大鼠于术后第7日起，随机分为SNL＋生理盐水组（n=6）和SNL＋VU0155041组（n=6），分别予以鞘内注射生理盐水和VU0155041（500nm01）10μL，2次／d×7d，注药前和注药后30min测量其50％PWT。最后，末次给药后1h取空白对照组、SNL＋生理盐水组和SNL＋VU0155041组大鼠左侧脊髓腰膨大处送检基因芯片并利用Western blotting检测mGluR4及Rab5各亚型的表达变化。结果SNL大鼠术后1～6d其手术同侧后肢50％PwT较空白对照组及假手术组明显降低（P〈0．01）；SNL＋VU0155041组大鼠手术同侧后肢50％PwT与SNL＋生理盐水组相比自给药第4日起逐渐升高（P〈0．01）；Agilent表达谱基因芯片结果显示：SNL＋生理盐水组的Rab5含量高于空白对照组，而空白对照组和SNL＋VU0t55041组相比无明显差异；Western blotting结果显示：SNL＋生理盐水组的mGluR4表达明显低于空白对照组和SNL＋VU0155041组（P〈0．05），而Rab5A和Rab5C的表达明显高于空白对照组和SNL＋VU0155041组（P〈0．05），Rab5B在3组中的表达差异无统计学意义（P〉0．05）。结论mGluR4激活后可能是通过Rab5A和Rab5C调控突触囊泡递质释放从而影响神经病理性痛。

Ⅱ、Ⅲ组亲代谢型谷氨酸受体激动剂逆转1-甲基-4-苯基吡啶离子抑制C6胶质瘤细胞摄取谷氨酸

目的：探讨Ⅱ、Ⅲ组亲代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors，mGluRs)激动剂对1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-metyl-4-phenylpyridinium，MPP^+)抑制C6胶质瘤细胞摄取谷氨酸(glutamate，Glu)的影响。方法：应用同位素标记法测定C6胶质瘤细胞对培养液中[~3H]-D，L-谷氨酸的摄取。结果：Ⅱ组mGluRs激动剂(2S，2’R，3’R)-2-(2’，3’-di-carboxycyclopropyl)glycine(DCG-Ⅳ)和Ⅲ组mGluRs激动刺L(+)-2-amino-4-phosphonobutyric acid(LAP4)100μmol·L^(-1)可以逆转MPP^+抑制C6胶质瘤细胞摄取Glu的作用，而Ⅱ组mGluRs拮抗剂(RS)-1-Amino-5-phosphonoinan-1-carboxylic acid(APICA)和Ⅲ组mGluRs拮抗剂(RS)-α-methvlserine-O-phosphate(MSOP)可以完全阻断其激动剂的逆转作用。 结论：激活C6胶质瘤细胞上的Ⅱ、Ⅲ组mGluRs可以通过促进谷氨酸转运体摄取Glu、进而降低细胞外液的Glu浓度。

代谢型谷氨酸受体4在ES细胞体外分化为心肌细胞中的表达研究

目的:探索代谢型谷氨酸受体4(metabotropic glutamate receptor 4,mGluR4)在小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES细胞)体外分化为心肌细胞中的表达情况。方法:采用悬滴培养法,体外诱导ES细胞分化为心肌细胞,分别以维甲酸(retinoic acid,RA)和溶剂二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)作为阳性对照和阴性对照;利用免疫荧光法和流式细胞术,鉴定ES细胞衍生心肌细胞团中心肌特异性蛋白α-actinin/Troponin-T和mGluR4共表达情况;用Western Blot法,考察ES细胞定向分化为心肌细胞过程中mGluR4蛋白表达水平;同时观察了小鼠胚胎心脏发育过程中mGluR4基因和蛋白表达变化。结果:ES细胞及其分化来的早期心肌细胞团均表达mGluR4,随着心肌细胞逐渐成熟,mGluR4蛋白表达水平下调。流式细胞术结果显示,贴壁分化11 d的细胞团中mGluR4与心肌特异性蛋白Troponin-T共表达细胞比率仅为(3.00±1.00)%。同时,小鼠胚胎心脏发育过程中mGluR4基因和蛋白表达也呈下降趋势,直至成体小鼠心脏中不表达mGluR4蛋白。结论:ES细胞体外分化为心肌细胞过程中mGluR4有表达并呈下调趋势,与小鼠体内心脏发育过程中mGluR4表达情况基本一致。

第三组代谢型谷氨酸受体亚型对神经病理性痛的影响

目的探讨第三组代谢型谷氨酸受体(mGluRs)亚型对神经病理性痛的调节作用。方法取30只SD大鼠,随机分为5组(n=6),于鞘内置管术后第5天分别给予单次鞘内注射等容量(10μL)生理盐水、L(+)-2-氨基-4-膦酰基丁酸(L-AP4)、VU0155041、AMN082和(S)-3,4-二甲酸苯基甘氨酸(DCPG),注药后每隔15 min和30 min分别测量大鼠50%机械缩足阈值(50%PWT)和缩足潜伏期(PWL)。另取30只SD大鼠,随机分为5组(n=6),鞘内置管并行脊神经根结扎(SNL),术后第7天给予单次鞘内注射生理盐水及同上药物10μL,注药后同法测量大鼠50%PWT和PWL。再取18只SD大鼠,随机分为空白对照组、SNL组、SNL+注药组(生理盐水、VU0155041、AMN082和DCPG)(n=3),注药组于30 min后与其余各组同取腰膨大处脊髓,Western blotting检测mGluR4、mGluR7和mGluR8的表达。结果 L-AP4、VU0155041、AMN082和DCPG对正常大鼠的痛域无影响(P>0.05);但对神经病理性痛大鼠有不同程度的镇痛作用(P<0.05),其中以VU0155041效果最为显著。与空白对照组相比,SNL组手术同侧脊髓只有mGluR4表达水平降低(P<0.05);与生理盐水组相比,其他注药组只有mGluR4表达水平升高(P<0.05);而mGluR7在各组中的表达水平差异无统计学意义(P>0.05),mGluR8在脊髓基本不表达。结论第三组mGluRs中主要是mGluR4对神经病理性痛有调节作用。

神经元型一氧化氮合酶在Ⅱ组代谢型谷氨酸受体介导的脑缺血耐受中的作用

目的:探讨神经元型一氧化氮合酶(nNOS)催化产生的一氧化氮(NO)在Ⅱ组代谢型谷氨酸受体(mGluR2/3)介导的脑缺血预处理(CIP)保护机制中的作用。方法:36只永久凝闭椎动脉的SD大鼠随机分为6组(n=6):sham、CIP、损伤性缺血、CIP+损伤性缺血、MTPG+CIP和MTPG+CIP+损伤性缺血组。采用硫堇染色和免疫组化观察海马CA1区迟发性神经元死亡(DND)和nNOS表达的变化。结果:与Sham组相比,CIP组海马nNOS表达出现一定程度的上调,而损伤性脑缺血组则出现nNOS表达的明显上调,预先给与CIP可一定程度上防止损伤性脑缺血所致的nNOS表达的过度升高。在MTPG+CIP组,预先侧脑室注射mGluR2/3阻断剂MTPG,可阻断CIP引起的nNOS表达增加,但对神经元的存活无影响。而在MTPG+CIP+损伤性缺血组中,出现大量锥体神经元DND,同时nNOS的表达较MTPG+CIP组明显增加,该增加为损伤性脑缺血所致,而非MTPG的作用。结论:nNOS催化产生的NO作为mGluR2/3的下游分子参与脑缺血预处理过程中mGluR2/3介导的脑缺血耐受的形成。

组代谢型谷氨酸受体通过抑制凋亡参与脑缺血耐受的诱导

目的观察组代谢型谷氨酸受体阻断剂α-methyl-(4-tetrazolyl-phenyl)glycine(MTPG)对脑缺血预处理(cerebralischemicpreconditioning,CIP)抗损伤性缺血所致海马神经元凋亡作用的影响。方法24只SD大鼠采用四血管闭塞法制造大鼠全脑缺血模型。采用Tunel法检测海马CA1区锥体细胞凋亡情况。结果假手术组几乎无阳性细胞表达;损伤性缺血组可见明显的阳性细胞表达和核固缩,阳性细胞数、总面积、平均光密度明显增加(P<0.05);CIP+损伤性缺血组阳性染色细胞数、总面积、平均光密度较损伤性缺血组明显降低(P<0.05);MTPG+CIP+损伤性缺血组阳性染色细胞数、总面积、平均光密度与CIP+损伤性缺血组相比明显增加(P<0.05)。结论mGluR2/3通过抑制凋亡,参与BIT的诱导。

Ⅱ组代谢型谷氨酸受体阻断剂对老年痴呆大鼠模型脑内nNOS及nNOS mRNA表达的影响

目的阐明Ⅱ组代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor2/3,mGluR2/3)对老年性痴呆(AD)发病过程中一氧化氮(NO)的影响。方法应用免疫组化和原位杂交方法,观察脑室应用Ⅱ组mGluR2/3阻断剂α-甲基-(4-四唑基-苯)甘氨酸(MTPG)对脑室β-淀粉样肽(Aβ)注射所致的AD大鼠神经型一氧化氮合酶(nNOS)及其mRNA表达的影响。48只SD大鼠随机分为假手术组、痴呆组、痴呆组+MTPG组,每组16只。各组大鼠均在Morris水迷宫测试后常温饲养1w后取材观察。结果假手术组海马CA1区锥体细胞轮廓清楚,排列整齐,胞浆有较弱的nNOS表达。痴呆组nNOS表达较假手术组明显增加,同时锥体细胞数目变少,锥体神经元的轮廓、形态出现明显的损伤性改变;脑室注射mGluR2/3阻断剂MTPG,可部分阻断AD引起的nNOS表达增加,对神经元的形态也有恢复作用。原位杂交与免疫组化显示相似的变化趋势。结论mGluR2/3参与AD发病过程,NO信号通路可能发挥重要作用。

诱生型一氧化氮合酶在代谢型谷氨酸受体参与老年性痴呆发病中的作用

目的观察诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric-oxide synthase,iNOS)在Ⅱ组代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor 2/3,mGluR2/3)参与老年性痴呆(AD)发病过程中的可能作用。方法将48只SD大鼠随机分为假手术组、AD组和AD+α-甲基-(4-四唑基-苯)甘氮酸(α-methyl-4-tetrazolyl-phenyl,MTPG)组3组,每组16只。AD组与AD+MTPG组经SD大鼠左侧脑室注入凝聚态Aβ25-35制做AD大鼠模型,假手术组以相同操作注射等量蒸馏水。1周后,AD+MTPG组于右侧脑室注射MTPG,AD组和假手术组注射等体积人工脑脊液。5周后取脑组织,应用硫堇染色、免疫组化和原位杂交方法,观察大鼠海马CA1区锥体神经元损伤情况,以及iNOS和iNOS mRNA表达。结果 (1)硫堇染色结果显示:假手术组海马CA1区锥体神经元轮廓清楚,排列整齐;AD组与假手术组相比,锥体神经元数目较少,轮廓欠清,形态不规则;AD+MTPG与AD组相比,神经元形态明显恢复,排列较规则。(2)免疫组化结果显示:假手术组神经元胞质有较弱的iNOS表达;AD组iNOS表达较假手术组明显增强;AD+MTPG iNOS表达较AD组减弱。(3)原位杂交结果显示:3组iNOS mRNA与iNOS表达呈相似的变化趋势。结论 iNOS在mGluR2/3参与AD发病过程中具重要作用。

代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4)高通量药物筛选模型的建立

为发现代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4)的调节剂,通过荧光检测胞内钙浓度的方法,建立一个基于细胞功能性检测的高通量筛选(HTS)系统。将人mGluR4基因转染稳定表达Gα15蛋白的人胚肾细胞(HEK-293),用Zeocin筛选获得稳定表达mGluR4的细胞株,并通过钙流检测试验证实该细胞系的生物学功能。优化了实验系统中荧光染料的孵育时间,溶剂二甲基亚砜(DMSO)耐受性,以及溶剂氢氧化钠(NaOH)耐受性,建立了可靠稳定的筛选系统。钙流检测试验数据表明,mGluR4细胞系对其激动剂的活性程度排序是:L-(+)-2-Amino-4-phosphonobutyricacid(L-AP4)>L-Serine-O-phosphate(L-SOP)>L-Glutamicacid(L-Glu);拮抗剂是:(RS)-α-Methylserine-O-phosphate(MSOP)>(RS)-α-Methyl-4-phosphonophenylglycine(MPPG)。在96和384细胞微孔培养板中,得到该筛选系统Z’因子分别是0.80和0.65。结果表明,该稳定细胞系拥有一个稳定的检测系统,适合于mGluR4激动剂/拮抗剂的筛选。

甲基苯丙胺依赖对大鼠纹状体RGS4和mGluR5受体信号传导的影响

目的:研究甲基苯丙胺依赖不同时间对大鼠脑纹状体内G蛋白信号调节因子4(regulator of G-protein signaling 4,RGS4)和代谢型谷氨酸受体5(metabotropic receptor 5,m GluR5)信号传导的影响。方法:建立大鼠甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)依赖一周组(1W)、两周组(2W)模型,Western blot技术检测大鼠纹状体内RGS4、m GluR5、G蛋白α亚单位蛋白Q(Gαq)、磷脂酶C-β1(phospholipase C-β,PLCβ1)表达水平。结果:METH依赖1W、2W组伴药箱停留时间比生理盐水对照组增加,提示METH依赖模型建成。模型组大鼠纹状体内RGS4蛋白表达水平较生理盐水对照组相比明显下调,而模型组m GluR5蛋白和Gαq蛋白、PLCβ1蛋白表达与生理盐水对照组比较均有不同程度上调,且2W组较1W组改变更明显。结论:METH给药可能导致大鼠脑纹状体内RGS4表达下调,m GluR5表达上调,还可使与m GluR5偶联的Gαq、PLCβ1表达均出现不同程度上调。且METH依赖时间越长,RGS4、m GluR5、Gαq、PLCβ1的表达水平变化越显著。

RGS4过表达对甲基苯丙胺依赖大鼠纹状体mGluR5信号传导通路相关蛋白表达的影响

目的 通过建立大鼠甲基苯丙胺(METH)依赖条件位置偏爱模型(CPP),研究脑纹状体内G蛋白信号调节因子4(RGS4)过表达引起的代谢型谷氨酸受体5(mGluR5)信号传导通路相关蛋白表达变化,以及对大鼠CPP行为的影响。方法将大鼠随机分为正常组、生理盐水(NS)组、METH组、Ad5-RGS4-EGFP组、Ad5-EGFP组。正常组不做处理,其余各组脑纹状体分别立体定位注射磷酸盐缓冲液(PBS)、PBS、过表达腺病毒载体Ad5-RGS4-EGFP和阴性对照腺病毒载体Ad5-EGFP,分析各组大鼠CPP行为,Western blot检测脑纹状体内RGS4、mGluR5、Gαq、PLCβ1等蛋白的表达。结果 Ad5-RGS4-EGFP组CPP差值低于METH组和Ad5-EGFP组(P<0.05),高于NS组(P<0.05)。Ad5-RGS4-EGFP组RGS4蛋白表达均不同程度高于其余4组(P<0.05,P <0.01),mGluR5、Gαq表达低于METH组和Ad5-EGFP组(P<0.05),略高于正常组和NS组( P >0.05),PLCβ1表达略有变化,但差异无显著性。结论纹状体内RGS4过表达可明显缓解METH成瘾性大鼠CPP行为,机制可能与RGS4过表达后,负性调控mGluR5介导的Gαq及PLCβ1信号传导通路相关。

RGS4在药物依赖受体信号通路中的调节作用

药物依赖形成机制复杂,涉及多脑区、多受体信号通路的共同调节。G蛋白信号调节因子4(RGS4)可通过作用于多巴胺、阿片、代谢型谷氨酸等受体系统参与药物依赖形成的调节。笔者以RGS4为靶点,通过对多巴胺、阿片、代谢型谷氨酸受体系统的影响阐述RGS4在药物依赖相关受体信号通路中的调节作用。

代谢型谷氨酸受体4胞内段的原核表达及纯化

目的原核表达代谢型谷氨酸受体4胞内段(metabolic glutamate receptor 4 intracellular,GRM4 intracellular,GRM4 intra),并用Ni柱进行纯化。方法采用PAS(PCR-based accurate synthesis)法合成GRM4 intra基因序列,将目的片段和质粒p Czn1双酶切后,经连接,构建重组质粒pCzn1-GRM4 intra;将重组质粒转化至Rosseta菌株,IPTG诱导GRM4 intra蛋白的表达,表达的蛋白利用Ni柱亲和层析法纯化。结果经测序和双酶切鉴定证明质粒pCzn1-GRM4 intra构建正确;在IPTG诱导下,质粒能够在Rosseta菌株中高效表达,表达的蛋白相对分子质量约18 400,主要以可溶性性形式存在,纯度> 90%。结论成功获得了原核表达的GRM4 intra蛋白,为利用体外pull down方法鉴定GRM4的相互作用蛋白提供了参考。

代谢型谷氨酸受体5亚型高通量筛选模型的建立

目的:利用荧光测钙的方法,建立了人源代谢型谷氨酸受体5亚型(mGluR5)的高通量筛选模型。方法:通过基因合成得到mGluR5的ORF区域,并将其构建到pCNDA3.1真核表达载体上。将此重组质粒转染HEK293细胞,利用抗生素筛选和钙流检测方法得到稳定表达mGluR5的重组细胞株。结果:对试验条件:接种密度,孵育时间,溶剂DMSO浓度进行了优化,建立了稳定可靠的实验系统。并使用该受体特异激动剂和拮抗剂进行了功能验证,其中激动剂EC50L-Quisqualic acid(67.8nmol/L)>L-Glu(2.73μmol/L),抑制剂IC50MTEP(3.3nmol/L)>Fenobam(23.5nmol/L)系统Z因子为0.68,证明建立了一个人源mGluR5抑制剂的细胞筛选模型。利用此重组细胞株对360种化合物进行了筛选,找到了若干对mGluR5有抑制效果的化合物。结论:此细胞模型适用于mGluR5抑制剂的高通量筛选。