L-色氨酸生物合成的代谢流量分析

建立了谷氨酸棒杆菌合成L 色氨酸 (L Try)的代谢流量平衡模型 ,应用该模型计算出发酵中后期的代谢流分布并通过MATLAB软件线性规划得到Try理想代谢流分布。结果表明 75 1 5 %的碳架进入糖酵解 ,2 4 85 %的碳架进入HMP途径 ;但与理想代谢流相比 ,应从遗传改造和发酵控制方面降低TCA循环的代谢流 ,减少副产氨基酸的生成 ,摸索最适的溶氧控制对提高Try产率至关重要。

Actinobacillus succinogenes抗氟乙酸突变株的选育及其代谢流量分析

琥珀酸是一种用于合成树脂、可降解塑料及许多化学中间体的重要绿色化工原料。为了提高琥珀酸的发酵产率,基于Actinobacillus succinogenes的代谢流量分布情况对其育种机制进行了研究。以Actinobacillus succinogenes CGMCC1593为原始菌株进行NTG诱变,挑选在含有50～100mmol/L氟乙酸平板生长较快的菌落,经过初筛和复筛,发现SF-9菌株产生更多琥珀酸且积累乙酸较少。以50g/L的葡萄糖为碳源,在5L发酵罐上进行分批发酵,该菌株发酵32h时琥珀酸产量(34.8g/L)提高了23.4%,琥珀酸/乙酸比率为9:1,副产物乙酸量比原始菌株降低了约50%。代谢流量分析(MFA)结果表明,PEP是影响琥珀酸合成的关键节点,PYR是影响乙酸等杂酸生成比例的关键节点,并且这两个节点均非刚性节点。通过氟乙酸抗性诱变,成功地筛选出了流向乙酸、甲酸和乳酸等杂酸的流量相对减少,而流向琥珀酸的流量明显增强的突变菌株SF-9。

杂交瘤细胞的代谢流量分析

应用代谢流量平衡模型定量分析了杂交瘤细胞的代谢流量分布。结果表明 ,在连续培养的杂交瘤细胞中 ,当葡萄糖和谷氨酰胺的流加浓度分别为 13 8和 2 6mmol·L-1时 ,86 2 %的葡萄糖通过糖酵解生成乳酸 ,7 5 %的生成脂类 ,进入TCA循环的仅占 0 83% ;谷氨酰胺中的氮有 3%用于核酸的合成 ,5 4 5 %生成氨 ,另有 38 2 %生成非必需氨基酸 ,碳骨架 6 1 6 %生成非必需氨基酸 ,34 1%进入TCA循环。

L-精氨酸高产菌的选育及基于代谢流量分布的育种机制

从分析钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)的精氨酸合成途径入手,提出了一种通过选育脯氨酸结构类似物抗性突变株以提高其精氨酸合成能力的育种思路。采用亚硝基胍(NTG)诱变处理出发菌株YD8(His-,SGr1.2 mg/mL,D-Argr15 mg/mL),经含15 mg/mL的脯氨酸结构类似物S-甲基半胱氨酸(S-MC)的抗性筛选获得精氨酸高产突变株YDM403(His-,SGr1.2 mg/mL,D-Argr15 mg/mL,S-MCr15 mg/mL),产酸水平可达29.4 g/L,较出发菌株YD8的产酸高出55.0%。通过代谢流量分布分析了菌株YD8和YDM403代谢网络的变化,结果表明,菌株YD8可能存在顺序反馈抑制作用,出发株YD8解除了Arg对Glu到Arg的反馈抑制,而YDM403又解除了Pro对Glu到Pro的反馈抑制,从而使中间物Glu累积量下降而对-αKG到Glu不再有反馈抑制,其通量提高,与此同时从Glu向Arg的代谢通量也相应增加。

从代谢流量分析角度探讨培养条件改变下对放射型根瘤菌WSH2601合成辅酶Q_(10)的影响

分析了放射型根瘤菌 (R .radiobacter)WSH2 6 0 1生物合成辅酶Q1 0 的代谢途径网络 ,并在溶氧条件改变和培养基中添加玉米浆条件下对辅酶Q1 0 发酵细胞内代谢途径流量变化作定量的分析 ,结果表明 :提高溶氧浓度 (2 0 % ) 5_磷酸核酮糖 (Ru5P)物流 (r7)增加 2 6 6 ,即糖酵解途径 (EMP)途径向磷酸戊糖途径 (HMP)转移 ;添加 1%玉米浆r7增加17 2 ,EMP与HMP途径物流比值与三羧酸循环 (TCA)途径物流都下降 ,而癸异戊烯基焦磷酸 (DPP)生成物流通量 (绝对值 )变化都较小 ,即辅酶Q1 0 的生物合成更大程度地取决于辅酶Q1 0 生物合成途径中催化DPP的合成和 4_羟基苯甲酸(PHB)与DPP的缩合反应的两种关键酶活性。 6_磷酸葡萄糖 (G6P)节点是辅酶Q1 0 生物合成代谢途径的柔性节点 ,而丙酮酸节点是半柔性节点。细胞生物量的提高与HMP途径物流增加有关。

L-精氨酸生物合成的代谢流量分析

建立并完善了谷氨酸棒杆菌GWY020及其2个逐步叠加不同遗传标记的突变株HUI821和GUI089合成L-精氨酸的中心代谢网络。分别测定了它们在特定培养时段(50h^52h)L-精氨酸等代谢物的胞外浓度,由此计算这一时段这些代谢物在发酵液中积累(或消耗)的速率,分别作出这3株菌在拟稳态下的代谢流量分布图,进而研究育种过程中不同遗传标记的叠加对代谢网络中L-精氨酸合成流量分布的影响。结果表明遗传标记的引入使流量分配发生了重大变化,节点处的流量分配朝着有利于L-精氨酸合成的方向改变。从代谢流量分析角度上,证明结构类似物抗性和敏感性突变是代谢流导向和设计育种的有效手段,代谢流量分析将成为设计育种的提供新思路。

螺旋霉素生物合成代谢流量分析

通过对螺旋链霉菌的中间代谢产物及有机酸的分析 ,建立了螺旋霉素生物合成的动态流量分布图 ,并分析了螺旋霉素生物合成代谢网络的节点。分析认为 ,大环成环步骤和 FO- 1步骤在发酵中前期有一定的限速影响 ;同时由于 FO- 2、NSP- 2有一定的积累 ,若能减少两者的形成 ,将对提高发酵效率有积极的意义。摇瓶实验验证了添加葡萄糖对螺旋霉素生物合成代谢网络有影响 ,发酵效价提高了 2 6 .8%。

金属离子对1,6-二磷酸果糖合成代谢流量的影响

本文首次建立了1,6-二磷酸果糖(FDP)合成代谢途径流量模型，并应用该模型求解FDP合成过程中代谢流量分配。研究了NH4+、K+、Mg2+对1,6-二磷酸果糖合成代谢途径流量的分配的影响，结果发现NH4+、K+、Mg2+对代谢途径流量分配均有一定的影响；尤其是在这三者共存的情况下，代谢流量分配发生了重大改变，1,6-二磷酸果糖的累积流量达到41.9，为化学调节1,6-二磷酸果糖的超量生产提供了理论基础。

温度对Zymomonas mobilis糖代谢关键酶活力和代谢流量的影响

以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)ATCC31821为模式菌株,研究不同温度条件对其葡萄糖代谢关键酶活力的影响。采用全自动发酵罐,在整个发酵过程中通过充入氮气调节发酵液的溶氧量(DO)=0%,添加0·5mol/LNaOH溶液控制pH=5·5,发酵温度分别控制为25、30、35、40℃,发酵24h,测定其糖代谢网络中ED、HMP、TCA等途径的关键酶活力和代谢物成分。结果表明,在发酵温度为30～35℃时,乙醇脱氢酶(ADH)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)、丙酮酸脱羧酶(PDC)、葡萄糖激酶(GK)、丙酮酸激酶(PK)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GD-3-PDH)的活力较高,菌体的ED途径代谢活跃,碳素流量增加,乙醇生产量和糖转化率较高,而TCA途径的苹果酸脱氢酶(MDH)和异柠檬酸脱氢酶(ICDH)等活力较低,进入TCA途径的碳素流量明显减少;发酵温度为25、40℃时,TCA途径的酶活力升高,ED途径的酶活力减弱,生成乙醇的代谢流量减少,因此温度是Z·mobilis发酵过程中调控菌体细胞生长和糖代谢的一个重要因素。

采用代谢流量分析方法评估二噁英对细胞的代谢干扰

以肝癌细胞HepG2为供试细胞,选用5个不同浓度的二噁英(0、0.001、0.01、0.1和1.0 nmol.L-1),探讨2,3,7,8-TCDD对HepG2细胞的毒性效应.采用90%甲醇离心法实现蛋白与代谢产物的分离,建立了高效液相色谱-串联三重四极杆质谱(HPLC-MS/MS)分析胞外液中的23种代谢产物(20种氨基酸、乳酸、甘油和尿素)的方法.建立的HPLC-MS/MS分析方法对各化合物的加标回收率可达91%—105%之间,化合物浓度的标准偏差均小于10%.在此基础上,结合代谢流量分析系统研究了2,3,7,8-TCDD对HepG2细胞内代谢流的影响.结果表明,随着浓度的增高,2,3,7,8-TCDD对HepG2细胞代谢的干扰作用呈增强趋势.2,3,7,8-TCDD降低了细胞对葡萄糖的吸收,并进一步抑制了HepG2细胞糖酵解的速率.此外,2,3,7,8-TCDD导致了HepG2细胞乳酸代谢流的明显增加,由此使细胞产生了过量的乳酸.

L-缬氨酸合成的代谢流量分析

分别测定谷氨酸棒杆菌 (Corynebacteriumglutamicum)AS1 4 95及其 3个逐个叠加不同遗传标记的突变株AA36 1、AAT2 31和AATV341在特定培养时段 (2 6～ 2 8h)L 缬氨酸等代谢物的胞外浓度 ,由此计算这一时段这些代谢物在发酵液中积累 (或消耗 )的速率 ,分别做出这 4株菌在拟稳态下的代谢流量分布图 ,进而研究育种过程中不同遗传标记的叠加对代谢网络中L 缬氨酸合成流量分布的影响。结果表明遗传标记的引入使流量分配发生了重大变化 ,节点处的流量分配朝着有利于L 缬氨酸合成的方向改变。 6 磷酸葡萄糖节点处流入EMP途径和HMP途径的流量分配由 17 0∶83 0变为 2 4 3∶75 7;丙酮酸节点处流入L 缬氨酸合成途径和其他途径的流量分配由 15 8∶84 2变为 76 7∶2 3 3。L 缬氨酸合成的分支途径上的流量由最初的 5 37增大为 37 3,乳酸合成途径的流量从 11 1最后降为 1 16 ,L 缬氨酸产量由 4g L提高到 2 4 5g L。代谢流量分布的变化趋势与L 缬氨酸产量的变化趋势是互相吻合的。以 2 噻唑丙氨酸抗性突变 (2 TAr)和L 天冬氨酸氧肟酸盐超敏性突变 (L AAHss)有效地进行代谢流遗传导向的事实 ,在代谢流量分析的层面上 ,证明结构类似物抗性突变和结构类似物超敏性突变是代谢流导向和设计育种的十分有效的手段 。

青霉素生物合成与代谢流量控制

在δ-(L-a一氨基己二酰)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸合成酶(ACVS)、异青霉素N合成酶(IPNS)、酰基辅酶A异青霉素N酰基转移酶(AAT)等酶的作用下,产黄青霉将3个前体氨基酸经中间产物δ-(L-a-氨基己二酰)-L- 半胱氨酰-D-缬氨酸(ACV)和异青霉素N(IPN)生物合成为青霉素.这一过程在产生青霉素G或V的同时,伴随着6一氨基青霉烷酸(6-APA)、8一羟基青霉咪唑酸(8-HPA)、6一氧哌啶-2-羧酸(OPC)和青霉噻唑酸等副产物的生成.为了增加青霉素生物合成的代谢流量,减少中间产物的积累和副产物的生成,提高发酵过程的原料转化率.有必要进行代谢控制分析.在发酵前期,代谢流量的主要控制点即瓶颈位于ACVS上,而在发酵后期,这一瓶颈移向IPNS.因此,要想提高青霉素合成的代谢流量,必须在发酵的前期增加ACVS的活性,而在发酵后期要增加IPNS的活性.显然,用代谢工程方法同时增加编码ACVS和IPNS的基因剂量及表达水平,比起单一基因扩增来说、有可能取得更好的效果.由于IPNS需要氧作为底物,活化侧链前体的酶—乙酰辅酶A合成酶的活性也依赖于氧,故在发酵过程中保持足够的溶氧浓度可以增加青霉素生物合成的代谢流量,减少胞外ACV、IPN、6-APA、8-HPA、OPC等中间产物和副产物的生成,提高原料的转化得率.另外,溶解CO_2在8-HPA的生成中起着重要作用.因?

碳源对琥珀酸放线杆菌发酵产丁二酸的影响及其代谢流量分析

在厌氧条件下,Actinobacillus succinogenes能够利用单糖、双糖和糖醇等碳水化合物发酵生成丁二酸,其中以山梨醇为碳源时丁二酸的产量最高。代谢流量分析结果表明:与葡萄糖发酵相比较,由于代谢系统中积累了更多的NADH,使得代谢网络关键节点PYR和AcCoA处的代谢流量分配有了较大的变化,导致更多的碳源流向丁二酸和乙醇,而乙酸和甲酸的分泌相对减少。

应用代谢途径流量模型探讨FDP合成机理

首次建立了 1 ,6-二磷酸果糖 (FDP)累积的代谢途径流量模型 .应用该模型求解FDP累积过程中不同时期的代谢流量分配 ,详细分析了各时期代谢流量分配发生改变的原因 ,并探讨FDP累积的机理 .细胞膜通透性的改变是FDP积累于胞外的前提条件 ;而代谢网络中HK、PFK、Ald和PK等酶活的调节使主要结点处代谢流量分配发生重大改变 ,则是FDP在胞外大量积累的关键 .

代谢流量比率分析及其在代谢工程中的应用

细胞内代谢反应流量在系统理解细胞代谢特性和指导代谢工程改造等方面都起着重要的作用。由于代谢流量难以直接测量得到,在很多情况下通过跟踪稳定同位素在代谢网络中的转移并进行相应的模型计算能有效地定量代谢流量。代谢流量比率分析法能够高度体现系统的生物化学真实性、辨别细胞代谢网络的拓扑结构,并且能够相对简单快速地定量反应速率等,因此受到代谢工程研究者越来越多的重视。以下着重介绍并讨论了利用代谢物同位体分布信息分析关键代谢节点合成途径的流量比率、基于流量比率的代谢流量解析、以及应用于代谢工程等的相关原理、实验测量、数据分析、使用条件等,以期充分发挥代谢流量比率分析法的优势,并将其拓展推广至更多细胞体系的代谢特性阐明和代谢工程改造中去。

基于代谢流量分布信息理解大肠杆菌中异柠檬酸裂解酶调节因子的代谢调控作用

基因的表达受不同的转录调节因子调节。大肠杆菌中的异柠檬酸裂解酶调节因子(IclR)能够抑制编码乙醛酸支路酶的aceBAK操纵子的表达。本研究基于代谢物的13C同位体物质分布来定量解析代谢反应,主要研究了iclR基因在大肠杆菌生理和代谢中的作用。大肠杆菌iclR基因缺失突变株的生长速率、糖耗速率和乙酸的产量相对于原始菌株都有所降低,但菌体得率略有增加。通过代谢途径的流量比率分析发现基因缺失株的乙醛酸支路得到了激活,33%的异柠檬酸流经了乙醛酸支路;戊糖磷酸途径的流量变小,使得CO2的生成量减少。同时,乙醛酸支路激活,但草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸的流量基本不变,说明磷酸烯醇式丙酮酸-乙醛酸循环没有激活,没有过多的碳原子在磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶反应中以CO2形式排出,从而确保了菌体得率。葡萄糖利用速率的降低、乙酰辅酶A的代谢效率提高等使得iclR基因敲除菌的乙酸分泌较原始菌株有所降低。

四种肝(癌)细胞系糖代谢的流量解析

目的分析人正常肝细胞(HL-7702)、不同转移潜能的肝细胞癌细胞系(SMMC-7721、HCCLM3)以及肝癌门静脉癌栓细胞系(CSQT2)的糖代谢流量及相关基因表达。方法利用稳定同位素^(13)C标记的葡萄糖与谷氨酰胺作为营养源,结合酶活实验,对四种细胞进行糖代谢流量解析。结果 MTT与Transwell实验证实了HL-7702、SMMC-7721、HCCLM3、CSQT2细胞的增殖与迁移能力依次增加。酶活实验与标记实验结果均显示,糖酵解与三羧酸循环的代谢活性在四种细胞中依次增加,具体表现为葡萄糖消耗与乳酸产生的增加,代谢流量比率在多种糖代谢产物中的上升,尤其是在CSQT2细胞中达到最高。结论随着肝癌细胞的恶性程度及转移能力的增加,糖酵解与三羧酸循环的代谢活性增加。代谢流量分析可能用以判断肝癌的发生发展与转移。

^(13)C代谢流量分析发展30年

^(13)C代谢流量分析(^(13)C metabolic flux analysis,^(13)C-MFA),是通过标记实验分析蛋白氨基酸或胞内代谢物同位素标记异构体的分布情况,从而准确定量胞内反应速率。该技术在系统理解细胞代谢特性、指导代谢工程改造和揭示病理生理学等方面起着重要作用,引起研究者的广泛重视。文中重点综述了代谢流分析30年的发展历程,尤其在工业生物技术和生物医药领域的应用,并对未来的发展方向进行展望。

北京城市物质代谢的能值分析与生态效率评估

城市如同生命体一样,需要持续不断的代谢过程完成其正常运转.城市可持续发展研究的关键是城市物质代谢流量及其代谢效率研究,但物质代谢流量仅能反映代谢速率,而其生态效率则反映了支持社会经济发展的物质代谢能力.采用能值分析方法,引入“生态效率”概念,构建了城市物质代谢生态效率的度量模型,从代谢流量及其效率2个方面核算了北京市资源环境及经济发展的代谢状况.结果表明：1990-2004年,北京市可利用总能值非常丰富,经济发展程度较高;来自本土可更新自然资源相对匮乏,大部分来源于不可更新资源和系统购买的资源与服务;城市废弃物资源化水平有待提高,环境压力较大;生态效率指数呈现出增加的趋势,2004年生态效率指数比1990年提高了3.6倍,表明城市自组织能力、发展潜力以及再生循环能力不断提高.说明提高城市物质代谢生态效率的根本途径是经济效率、资源效率和环境效率的协同发展,以及逐步构建废物资源化的循环链条.

次级代谢产物的代谢工程

本文讨论了代谢工程的一些基本概念和基本原理，以及代谢工程原理在次级代谢产物的设计育种中的应用；并结合近年来在代谢工程领域所开展的一些次级代谢产物的育种工作，介绍了抗生素代谢途径分析和修饰的研究进展以及提高抗生素产量和改善菌种生产性能的新思路。