LC-MS/MS方法研究新型酪氨酸酶抑制剂UP302的大鼠皮肤吸收量和皮肤代谢稳定性

目的建立大鼠皮肤中UP302定量的LC-MS/MS方法,并应用于研究UP302乳膏在大鼠皮肤局部给药24h后的皮肤吸收量,以及离体大鼠皮肤中UP302的代谢稳定性。方法 UP302用甲醇溶解稀释,皮肤样品用2倍体积甲醇沉淀处理,内标法进行定量。采用Hypersil Gold C18色谱柱,柱温30℃;甲醇为流动相A,5mmol.L-1甲酸铵水溶液为流动相B,以0.2mL.min-1梯度洗脱,进行色谱分离,运行时间6min。采用负离子电喷雾离子化电离源和选择反应监测(SRM)模式进行串联质谱分析,用于定量分析的离子反应分别为m/z 301.1→135.2(UP302)和m/z 252.9→132.0(内标大豆苷元)。结果 UP302皮肤标准样品在5～2000ng.mL-1的浓度范围内线性关系良好(r=0.9998)。UP302在大鼠皮肤匀浆中的最低定量限是5ng.mL-1。本方法日内准确度在100.00%～105.23%,日内精密度小于5.82%。结论本LC-MS/MS方法专属性强、灵敏度高、重现性好、操作简便、结果准确,可用于UP302在皮肤组织中含量的测定,以及UP302在大鼠皮肤组织中的代谢稳定性研究。

Foretinib衍生物LWK-126在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性研究

目的:建立测定肝微粒体中Foretinib衍生物LWK-126质量浓度的方法,研究其在大鼠、比格犬、人肝微粒体中的代谢稳定性。方法:采用体外肝微粒体孵育体系,将LWK-126分别溶于由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸溶液启动的大鼠、比格犬、人肝微粒体孵育体系中,于37℃水浴下分别孵育0、5、10、20、30、60 min时加入含内标(1μg/mL甲苯磺丁脲)的乙腈终止反应,并采用超高效液相色谱-串联质谱法检测各孵育体系中LWK-126的质量浓度。以Waters BEH C_(18)为色谱柱,以水(含0.01%甲酸)-乙腈(含0.01%甲酸)为流动相进行梯度洗脱,流速为0.4 mL/min,柱温为30℃,进样量为2μL;离子源为电喷雾电离源,采用正离子模式采集,扫描范围为m/z 50→1 200。以孵育0 min时LWK-126的质量浓度为参照,计算其在不同孵育体系中的剩余百分率与酶动力学参数。结果:LWK-126检测质量浓度的线性范围为0.05~15μg/mL(R^(2)=0.999 2),定量下限为0.05μg/mL,最低检测限为0.01μg/mL,精密度、准确度、提取回收率和基质效应均符合生物样品定量分析的要求。LWK-126在人、大鼠、比格犬肝微粒体中孵育60 min后的剩余百分率分别为(33.17±4.52)%、(3.14±6.73)%、(1.38±5.85)%,半衰期分别为33.15、11.76、5.62 min,清除率分别为38.45、118.81、245.76μL/(min·mg)。结论:成功建立了肝微粒体中LWK-126质量浓度的测定方法。LWK-126在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性排序依次为人>大鼠>比格犬。

药物代谢稳定性筛选的研究进展

在药物发现过程中,药代动力学研究成本高、耗时长,已成为制约新药开发速度和成功的瓶颈。因此,有必要在药物发现过程的早期阶段进行代谢稳定性检测,及早淘汰代谢性质不良的化合物。随着组合化学和高通量药理活性筛选技术的发展,在药物发现早期阶段进行高通量代谢稳定性检测的需求日渐迫切,本文综述了新药筛选过程中代谢稳定性的研究进展。

抗球虫新药纳川珠利在大鼠肝S9中的代谢稳定性研究

以大鼠肝S9系统为体外代谢模型,利用高效液相色谱法检测抗球虫新药纳川珠利与大鼠肝S9孵育后的含量,研究纳川珠利在大鼠肝S9系统中的代谢稳定性及可能存在的代谢产物。结果显示,大鼠肝S9系统中,纳川珠利药物浓度在0～1h范围内呈线性消除,符合一级反应的特征,速率常数K=0.004 719min-1,半衰期t 1/2=146.88min,说明纳川珠利在大鼠肝S9系统中具有较高的代谢稳定性;此外,该系统中还监测到纳川珠利的一种代谢产物,它的量也随着时间的增加而增加,约占纳川珠利代谢总量的36%。

UFLC-MS/MS研究胡椒碱在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性和代谢表型

应用体外肝微粒体孵育体系,考察胡椒碱在人、SD大鼠、小鼠、恒河猴和比格犬5个种属肝微粒体中的代谢稳定性,比较代谢的种属差异,确定其在人肝微粒体中的代谢表型。通过UFLC-MS/MS检测方法,测定胡椒碱在各个种属肝微粒体中孵育后的剩余浓度,考察他们的代谢稳定性及体外代谢动力学参数。采用化学抑制法考察胡椒碱在人肝微粒体中的代谢表型。结果表明胡椒碱在人、SD大鼠、小鼠、恒河猴和比格犬的肝微粒体中,半衰期T1/2分别为31. 36、48. 46、138. 60、147. 45、165. 00 min;体外固有清除率CLint分别为0. 0442、0. 0286、0. 0100、0. 0094、0. 0084m L/(m L·mg);在人肝微粒体中,胡椒碱主要被CYP3A4和CYP2C9酶代谢。推测胡椒碱在各种肝微粒体中的代谢均相对较稳定,其中大鼠和人的肝微粒体代谢性质最相近,在后续的实验中可以考虑用大鼠的代谢结果预测人的代谢结果;人肝微粒体中参与胡椒碱代谢的酶主要有CYP3A4和CYP2C9。

鱼精蛋白模拟肽的体外代谢稳定性和代谢酶表型研究

目的建立鱼精蛋白模拟肽(简称R15)的超效液相色谱(UPLC)检测方法,并应用于其体外代谢性质的研究。方法 Bio Basic C18(2.1 mm×100 mm,5μm)色谱柱,流动相为0.05%三氟乙酸-水和0.05%三氟乙酸-乙腈(98∶2,V/V),使用10%三氟乙酸-乙腈-水作为沉淀剂;研究了R15在不同种属大鼠全血中及大鼠肝、肾匀桨中的体外稳定性;将R15与大鼠全血和17种蛋白水解酶抑制剂在体外温孵,研究参与降解R15的蛋白水解酶类型。结果 UPLC方法的批内、批间精密度(RSD)均<15%,准确度(RE)为±15%,全血中R15在25~1000μg/ml范围内线性关系良好(r>0.9996),R15的提取回收率为99.4%~100.4%,在各实验贮存条件下R15稳定。R15在大鼠肝、肾匀浆、大鼠全血、比格犬全血和人全血中的半衰期分别为27.4、9.1、15.6、11.9和21.0 min;与不加蛋白酶抑制剂的对照组相比,实验组中加入EDTA、抑肽素、盐酸苯甲脒蛋白酶抑制剂的抑制率分别为92.7%、41.3%和33.0%,表明金属羧肽酶是R15主要的代谢酶,AEBSF、亮肽素、胰蛋酶抑制剂等蛋白酶抑制剂组抑制率较低,推测其可能参与R15的代谢。结论该法专属性强、准确、可靠,R15在肾中代谢最快,R15在大鼠全血中的代谢与金属羧肽酶有关。

低清除率药物的代谢稳定性预测模型研究进展

药物代谢的稳定性测试是新药发现阶段的关键环节,实现药物的低清除率通常是药物代谢稳定性设计中的重要目标。如何准确评估低清除率药物的代谢稳定性参数,并用体外代谢数据预测人体药动学已经成为新药研发阶段的挑战。传统的肝微粒体模型和悬浮肝细胞模型的孵育时间短,低清除率药物无法产生足够的代谢转化,因此进一步模拟体内环境和延长肝细胞培养时间的新型模型逐渐发展起来。本文重点介绍了新型的低清除率药物代谢稳定性预测模型的原理和优缺点等,包括肝细胞传递式培养模型、单层贴壁肝细胞培养模型、共培养模型和微灌流模型等,同时对模型的发展趋势进行展望,以期为早期先导化合物的代谢稳定性检测提供借鉴和优化。

补骨脂酚在大鼠和人肝微粒体中细胞色素P450酶和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶代谢稳定性及性别差异

目的探究补骨脂酚在大鼠和人肝微粒体中细胞色素P450酶(CYP酶)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT酶)的代谢稳定性及性别差异。方法补骨脂酚分别与雄、雌性SD大鼠和男、女性人肝微粒体在37℃与不同辅酶因子孵育,应用高效液相色谱(HPLC)法测定补骨脂酚的剩余浓度,采用底物消除法观察补骨脂酚的代谢稳定性。结果补骨脂酚在雄、雌性SD大鼠肝微粒体中,CYP酶介导的Ⅰ相代谢固有清除率(Clint)分别是326.6±15.4和(77.2±4.8)mL·min-1·kg-1,雄性代谢显著快于雌性(P<0.01);UGT酶介导的Ⅱ相代谢Clint分别是164.5±8.4和(419.1±24.1)mL·min-1·kg-1,雌性代谢显著快于雄性(P<0.01);CYP酶和UGT酶共同代谢的Clint分别是1063.1±27.2和(781.2±16.5)mL·min-1·kg-1,雄性代谢显著快于雌性(P<0.01)。在男、女性人肝微粒体中,CYP酶介导的Ⅰ相代谢Clint分别是24.8±2.1和(17.6±1.0)mL·min-1·kg-1,男性代谢显著快于女性(P<0.01);UGT酶介导的Ⅱ相代谢Clint分别是176.4±26.5和(165.9±8.6)mL·min-1·kg-1,代谢无显著性别差异;CYP酶和UGT酶共同代谢的Clint分别是262.5±20.9和(236.2±10.5)mL·min-1·kg-1,代谢无显著性别差异。结论补骨脂酚在SD大鼠和人肝微粒体中,均发生CYP酶介导的Ⅰ相代谢和UGT酶介导的Ⅱ相代谢反应,且代谢稳定性具有一定的种属和性别差异。

喜树碱衍生物NCP4在不同种属肝微粒体中代谢稳定性研究

探讨喜树碱衍生物NCP4在人、SD大鼠、beagle犬肝微粒体中的体外代谢稳定性及代谢产物。应用体外肝微粒体孵育体系,采用HPLC-UV-MS(Q-TOF)法,考察NCP4的代谢稳定性,并推断其代谢产物结构。结果显示,NCP4在Beagle犬和人肝微粒体温孵代谢动力学参数T l/2(min)相当,而在SD大鼠肝微粒体温孵的T l/2(min)相差较大;此外,NCP4在SD大鼠肝微粒体中生成m/z[M+Na]^+为502、460、344的代谢产物,在Beagle犬、人肝微粒体中生成m/z[M+Na]^+为388、390、448的代谢产物。结果表明Beagle犬与人肝微粒体温孵体系中NCP4底物的代谢稳定性基本一致,且NCP4在beagle犬与人的肝微粒体代谢产物相同。可以为NCP4临床前安全性评价的实验动物选择提供依据。

新型胰岛素增敏剂ZG02在大鼠肝微粒体中的代谢稳定性研究

目的:建立测定大鼠肝微粒体孵育体系中新型胰岛素增敏剂ZG02质量浓度的方法,并探讨ZG02的体外代谢稳定性。方法:分别将ZG02溶解于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)启动的大鼠肝微粒体Ⅰ相孵育体系、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)启动的Ⅱ相孵育体系以及二者联合启动的两相孵育体系中,置于37℃水浴中进行孵育,分别于孵育0、5、10、15、20、30、45 min时终止反应;以吲哚美辛为内标,采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定ZG02的质量浓度。色谱柱为Waters BEH C18,流动相为水(含0.01%甲酸)-乙腈(含0.01%甲酸)(35∶65,V/V),流速为0.4 mL/min,柱温为35℃,进样量为2μL;离子源为电喷雾离子源,以多反应监测模式进行负离子扫描,用于定量分析的离子对分别为m/z 458.115 9→323.073 0(ZG02)、m/z356.069 0→312.080 4(内标)。以孵育0 min时ZG02的质量浓度为参照,计算其在不同孵育体系中的剩余百分比、酶动力学参数和各代谢酶的贡献率。结果:ZG02检测质量浓度线性范围为1～400μg/L,定量下限为1μg/L,最低检测限为0.25μg/L;日内、日间RSD均小于10%,准确度为87.26%～94.58%,提取方法和基质效应均不影响待测物的测定。孵育45 min时,ZG02在Ⅰ相、Ⅱ相和两相孵育体系中的剩余百分比分别为(73.33±1.53)%、(50.63±3.42)%、(45.81±2.56)%,半衰期分别为67.28、30.26、25.57min,清除率分别为20.60、45.80、54.20μL/(mg·min),Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶的贡献率分别为38.01%、84.50%。结论:本研究建立的UPLC-MS/MS法简便、快速、专属性强,可用于大鼠肝微粒体孵育体系中ZG02质量浓度的测定及体外代谢稳定性的研究。ZG02在Ⅰ、Ⅱ相孵育体系中的代谢稳定性中等,在两相孵育体系中的代谢稳定性较差,其代谢反应可能以Ⅱ相代谢酶介导的葡萄糖醛酸化结合反应为主。

腰痹通胶囊中主要成分在不同种属肝微粒体中代谢物谱及稳定性研究

本研究旨在应用肝微粒体孵育技术研究腰痹通胶囊中主要成分在不同种属肝微粒体(人、食蟹猴、比格犬、大鼠和小鼠)中I相代谢物谱及稳定性差异。采用UPLC-Q-TOF技术寻找腰痹通胶囊孵育样品中可能的代谢产物,采用UPLC-TQ技术测定腰痹通胶囊孵育样品中主要成分的含量变化。结果表明,腰痹通胶囊中蛇床子素在不同种属肝微粒中的I相代谢物谱和代谢稳定性均有明显差异,而其他主要成分在不同种属肝微粒体中代谢较稳定,代谢差异不明显。

PARP抑制剂的虚拟筛选、酶抑制活性及代谢稳定性研究

聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(Poly-ADP-ribose polymerase, PARP)通过“合成致死”效应对携带BRCA突变的患者疗效显著,现已成为癌症治疗的重要靶点。多款PARP抑制剂已批准上市,极大改善了当前卵巢癌的治疗现状,但其耐药性与低亚型选择性受到了研究人员的广泛关注。本研究采用虚拟筛选和生物活性实验验证,发现化合物Y041-8647对PARP的酶抑制活性IC_(50)值为1.4μmol/L。体外代谢稳定性研究表明,Y041-8647在人工胃肠液、血浆及体外肝微粒体中稳定性良好。此外,通过分子动力学揭示了Y041-8647与7KK5蛋白的相互作用模式。化合物Y041-8647可作为进一步改造的先导化合物,为新型PARP抑制剂的开发提供了新的思路。

DHDK肝微粒体代谢动力学研究

目的研究抗肿瘤候选药物DHDK在人和大鼠肝微粒体的代谢动力学特征,比较种属差异,为临床前研究提供依据。方法建立HPLC法测定DHDK在肝微粒体孵育体系中的含量,用于考察DHDK体外代谢稳定性和酶动力学,进而推算其在体内的肝清除率(CLh)与肝提取率(ER)。结果肝微粒体孵育试验表明DHDK在两个种属之间的体外代谢稳定性和酶动力学行为无显著性差异(P>0.05),但在人体内的肝清除率显著低于大鼠(P<0.05)。结论DHDK体外代谢主要依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和肝微粒体酶,属于中等程度代谢消除。

在小肠上皮细胞中稳定过表达ACE2的AAV血清型确立

血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2),是血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)的同源物,可将血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)裂解成血管紧张素1-7(angiotensin1-7,Ang1-7),后者通过G蛋白偶联受体Mas发挥作用,作为肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system,RAS)的调节轴,与经典级联信号ACE/AngII/AT1(AngII type 1 receptor)相拮抗[1]。ACE2/Ang1-7/Mas信号途径的激活对维持胰岛、肝脏、骨骼肌、脂肪组织的代谢稳定性至关重要[2]。

朝鲜淫羊藿潜在肝毒性成分在不同种属肝微粒体中体外代谢稳定性研究

目的:应用不同种属肝微粒体,研究朝鲜淫羊藿中潜在肝毒性成分箭藿苷A、淫羊藿次苷Ⅰ、宝藿苷Ⅰ体外代谢稳定性,探讨肝脏代谢对毒性成分的影响及体外代谢种属差异。方法:将朝鲜淫羊藿提取物分别与小鼠、SD大鼠、人、恒河猴、Beagle犬肝微粒体进行孵育,采用底物消除法考察箭藿苷A、淫羊藿次苷Ⅰ、宝藿苷Ⅰ剩余底物浓度随时间的变化,计算各成分体外消除半衰期(t_(1/2)),分析各成分代谢稳定性特征。结果:箭藿苷A以Ⅰ相代谢为主,人肝微粒体中最终剩余底物浓度占比为32.33%,t_(1/2)为37.26 min,淫羊藿次苷Ⅰ以Ⅰ相代谢为主,人肝微粒体中最终代谢完全,t_(1/2)为4.47 min,宝藿苷Ⅰ以Ⅱ相代谢为主,人肝微粒体中最终剩余底物浓度占比为10.39%,t_(1/2)为19.47 min;各成分在Beagle犬肝微粒体中的代谢特征与在人肝微粒体中的较为相近。结论:箭藿苷A受代谢消除影响较小,可发挥固有毒性,而淫羊藿次苷Ⅰ和宝藿苷Ⅰ的固有毒性因代谢消除而减弱,证实了肝脏代谢对朝鲜淫羊藿潜在肝毒性成分毒性的影响,并为体内代谢研究及动物模型选择提供参考。

治疗黑色素瘤的新型二芳基衍生物04022a在不同种属肝微粒体中的稳定性及代谢产物分析

目的采用SD大鼠、人、比格犬的肝微粒体酶,考察新型二芳基衍生物04022a在3个种属肝微粒体中的代谢稳定性,比较代谢的种属差异,并对产生的代谢产物进行筛选与结构表征。方法将04022a溶解在由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)启动的肝微粒体孵育体系中,孵育0、15、30、60、90、120 min后,加入等体积的冰甲醇终止反应。采用高效液相色谱法测定04022a的质量浓度,计算各个时间点的剩余药物百分比、体外半衰期(t_(1/2))和固有清除率(CL_(int))。采用超高效液相色谱串联飞行时间质谱法对04022a在肝微粒体中的代谢产物进行检测与分析。结果孵育120 min时,04022a在大鼠、人、比格犬肝微粒体中的剩余药物百分比分别为88.30%、82.15%、98.63%。t_(1/2)分别为770、364、3465 min,CL_(int)分别为0.0018、0.0038、0.0004 mL·(min·mg)^(-1)。初步判断04022a在3个种属共有5个体外代谢产物。结论04022a在各种肝微粒体中的代谢稳定性良好,主要代谢转化途径包括脱烷基化、羟基化、脱氢。

UPLC-MS/MS研究抗肿瘤化合物HK-7在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性和代谢酶表型

目的:应用体外肝微粒体孵育体系,研究抗肿瘤化合物HK-7在人、SD大鼠、昆明种小鼠、恒河猴和比格犬的肝微粒体中的代谢稳定性,确定HK-7在人肝微粒体中的代谢表型。方法:通过UPLC-MS/MS检测方法,测定在各个种属中孵育后的HK-7剩余浓度,考察它们的代谢稳定性及体外代谢动力学参数。采用化学抑制剂法预测HK-7在人肝微粒体中的代谢表型。结果:在人、SD大鼠、昆明种小鼠、恒河猴和比格犬的肝微粒体中,HK-7的体外代谢半衰期t1/2分别为44.91,83.42,72.70,48.93和66.21 min;体外固有清除率CLint分别为0.031,0.016,0.019,0.028和0.021 m L·min^(-1)·mg^(-1);在人肝微粒体中HK-7主要被细胞色素CYP2C9,CYP2E1和CYP3A4催化代谢。结论:HK-7在肝微粒体中的代谢存在种属差异,人肝微粒体中参与HK-7代谢的酶可能有CYP2C9,CYP2E1和CYP3A4,其中CYP2E1贡献最大。

先导化合物结构优化策略(一)——改变代谢途径提高代谢稳定性

先导化合物结构优化是新药研发的关键环节。通过改变先导化合物的代谢途径可以改善化合物的药代动力学特性,延长药物在体内的作用时间,增强代谢稳定性,提高生物利用度。本文主要综述了通过改变代谢途径提高代谢稳定性的先导化合物结构优化策略,包括封闭代谢位点、降低脂溶性、骨架修饰、生物电子等排以及前药等。

UPLC-MS/MS研究披针灰叶素B在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性及代谢酶表型

应用体外肝微粒体孵育体系,研究披针灰叶素B(lanceolatin B)在大鼠、人、比格犬、猴肝微粒体中的代谢稳定性及体外代谢参数,确定主要代谢披针灰叶素B的CYP酶表型。将披针灰叶素B与不同种属肝微粒体共同孵育,应用UPLC-MS/MS检测孵育液中披针灰叶素B的含量,考察其代谢稳定性与体外代谢动力学参数。将披针灰叶素B与各CYP450同工酶CYP2E1,2C19,1A2,2D6,2C9,3A4,2A1的特异性抑制剂共同孵育,确定其代谢酶表型。研究结果显示,披针灰叶素B在人、比格犬肝微粒体中不代谢,而在大鼠与猴肝微粒体中可代谢,它们的体外半衰期(T_(1/2))与固有清除率(CL_(int))分别为11.57,8.07min和0.12,0.17 m L·min-1·mg-1,结果没有显著性差异;披针灰叶素B在肝微粒体中的代谢存在种属差异,在大鼠肝微粒体中由多个酶共同参与代谢,其中CYP1A2酶的作用最强,是主要代谢披针灰叶素B的酶。

丹酚酸B及二甲酯在人肝微粒体中代谢稳定性研究及代谢产物鉴定

目的:对比丹酚酸B(SAB)和丹酚酸B二甲酯(DMB)在人肝微粒体中的代谢稳定性,并鉴定DMB的代谢产物。方法:应用体外人肝微粒体孵育体系,采用HPLC-MS/MS法测定两者的剩余浓度,考察SAB和DMB的代谢稳定性,并鉴定代谢产物。结果:SAB在人肝微粒体孵育中不代谢;DMB在人肝微粒体和空白孵育液中各得到了4个代谢产物,其中有2个产物相同。结论:SAB在人肝微粒体中稳定;DMB在人肝微粒体和空白孵育液中均不稳定,且人肝微粒体中的代谢速率比空白孵育液快,代谢主要途径为酯键水解。