海洋酵母培育仿刺参Apostichopus japonicus浮游幼体研究

采用海洋酵母（Rhodotorula sp.）作为单细胞藻类的替代饵料培育仿刺参（Apostichopus japonicus）浮游幼体。从生长速度（G）、浮游期成活率（SRP）、变态成活率（SRM）、特定生长率（SGR）和40%樽形幼体出现时间（T）等5个指标比较了海洋酵母组（Z9）与不同种类和比例单胞藻混合饵料组（8个组合,Z1~Z8）的投喂效果;并确定了不同发育阶段海洋酵母的最佳投喂组合。结果表明：海洋酵母能够促进刺参幼体的正常发育和变态。ANOVA分析表明,不同饵料组间的生长和变态率等指标差异显著,Z2和Z9两组间差异不显著,但显著优于其他单胞藻混合组。投喂不同数量的海洋酵母对浮游幼体也有显著影响。

土池网箱培育仿刺参Apostichopus japonicus(Selenka)幼参的试验

2006年8月～11月,在面积33亩的土池塘中,放置10个用60目筛绢围成的6m×6m网箱,每个网箱中放置115、145、175或200个网吊,每个网吊由6个50cm×50cm的聚乙烯网片串成。每个网箱放入体重5.0mg(20万头/kg)或12.5mg(8万头/kg)的稚仿刺参(Apostichopus japonicus)0.3～0.5kg。经85d的饲养,培育出幼刺参19.39kg,平均每个网箱1.9kg,规格为540～702mg,成活率4.1%～9.6%。文中讨论了土池网箱培育幼刺参的技术关键,强调应在水温8℃～15℃下尽早放养、适时投喂、加大水交换量。

唐山市刺参(Apostichopus japonicus)养殖情况和主要病害防治

刺参(Apostichopus japonicus)是唐山市重要的水产养殖品种,2022年养殖面积已超过5100 hm2,年产量超过7700 t。本文基于唐山地区多年的刺参苗种繁育和成参养殖的实践经验,总结了几种唐山地区常见的高温、细菌性疾病、霉菌病、寄生虫病的预防和治疗措施。

仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道源乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的分离鉴定及其益生特性分析

利用MRS固体培养基从南移仿刺参肠道中分离得到1株优势乳酸菌,命名为AJC-XP-15,其最适生长温度为30℃,最适生长pH为6.5;其表面疏水性和自聚率分别为34.56%和35.61%,经16S RNA基因序列分析,并结合形态学和生理生化特性将其鉴定为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。拮抗实验结果显示,菌株AJC-XP-15及其发酵上清液对塔氏弧菌(Vibriotubiashii)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus,VP)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等病原菌具有很好的抑制作用;体外益生实验表明,菌株AJC-XP-15对人工胃肠液的耐受性很好,在pH3.0的模拟人工胃液处理3 h后的存活率为71.43%,在pH 6.8的模拟人工肠液处理3 h后的存活率为92.1%;抗氧化能力结果显示,菌株AJC-XP-15的无细胞提取物对DPPH自由基和羟自由基的清除能力最强,分别为(82.67±6.92)%和(15.36±2.95)%,其发酵上清液对超氧阴离子自由基的清除能力最强,为(26.36±2.58)%;药物敏感性分析结果显示,菌株AJC-XP-15对四环素、恩诺沙星、盐酸多西环素等抗生素敏感,对氟苯尼考、复方新诺明、庆大霉素等抗生素不敏感。研究结果可为仿刺参肠道源乳酸菌的分离鉴定和候选益生菌种筛选提供参考依据。

2种颜色仿刺参Apostichopus japonicus中糖胺聚糖表达谱的差异性研究

目的基于液质联用和糖组学分析技术,比较2种颜色仿刺参中的糖胺聚糖(GAGs)组成,获得2种颜色仿刺参的糖胺聚糖表达谱,从而完善海参糖链表达谱信息,促进无脊椎动物的糖链组成研究。方法对2种颜色仿刺参进行脱脂和蛋白酶酶解处理,采用离子交换柱纯化以去除蛋白和高硫酸化聚糖等杂质并获得糖胺聚糖。采用GAGs酶解获得GAGs二糖并对其进行2-AMAC荧光标记,基于RP-C18-MS/MS-MRM方法进行GAGs表达谱差异分析。结果在2种颜色仿刺参中CS含量均最高,为2.5~4.5μg/g,HA含量次之,HS的含量最低。海参中GAGs总量远低于海参中岩藻糖基化硫酸软骨素和岩藻聚糖硫酸酯的含量,白色仿刺参的GAGs总量明显高于青色仿刺参。2种仿刺参中CS二糖以CS-0S、CS-4S、CS-6S为主,HS二糖主要是HS-NS6S和HS-TriS,但是两者在GAGs二糖含量、质量分数、硫酸化模式和硫酸化程度上均存在较大差异。结论首次获得2种颜色仿刺参糖胺聚糖表达谱信息,有助于了解2种颜色仿刺参来源内源性糖链结构信息,为海参活性成分的研究开发提供依据。

半裸舟形藻的优化培养及在仿刺参养殖中的应用

底栖硅藻营养丰富,是仿刺参养殖中重要的食物来源。分离获得单株底栖硅藻半裸舟形藻,并对影响其生长的pH、光照度、氮磷比、玉米素等环境条件进行优化。试验结果显示,培养基的最适初始pH 8.0,最佳光照度2500 lx,玉米素的最适添加质量浓度1.0 mg/L,最佳氮磷比12.5。在此条件下,半裸舟形藻的比生长速率和细胞密度相对最高,积累的生物量最多。通过饲养试验研究半裸舟形藻对仿刺参幼参生长、消化和免疫功能的影响。试验共设3组,分别为商业饲料处理组、筒柱藻处理组和半裸舟形藻处理组。饲养试验共持续30 d,每10 d取样测定仿刺参的消化酶和免疫酶活性。结果表明,与筒柱藻和商业饲料相比,半裸舟形藻不但能够促进仿刺参生长,还可以更有效地提升仿刺参的消化酶和免疫酶活性。这表示饲喂半裸舟形藻对仿刺参的益生效果更明显,可以更有效地提升仿刺参的消化功能和免疫应答,抑制氧化损伤,提高磷酸酶响应能力和机体防御能力。试验结果可为底栖硅藻的培养和在仿刺参养殖中的应用提供参考。

有害藻华治理过程中改性粘土对仿刺参(Apostichopus japonicas Selenka)稚参的影响

本文以仿刺参(Apostichopus japonicas Selenka)稚参为实验对象,研究了改性黏土治理有害藻华技术对仿刺参稚参的影响。96h急性毒性试验结果表明,改性黏土对仿刺参稚参的半致死浓度(LC50)为6.01g/L;安全浓度为0.601g/L,高于在现场时的使用浓度0.1g/L;慢性毒性试验显示改性黏土对仿刺参稚参成活率和体重增长率无明显影响;不同浓度的改性黏土添加组中,发现仿刺参稚参的体壁组分(水分、灰分、总糖、总脂和粗蛋白)含量变化不大,改性黏土的加入对减少仿刺参稚参的种内竞争有一定积极作用。另外,针对仿刺参稚参食用包括改性黏土在内的底层颗粒物的现象,考察了不同实验组仿刺参稚参体壁中铝的含量,分析结果显示各实验组与对照组没有显著差异。在此基础上,考察了改性黏土有效去除有害藻华的体系中仿刺参稚参的生长情况,发现与对照组相比,改性黏土有效地去除了有害藻华,还明显降低了仿刺参稚参的死亡率。因此,改性黏土是一种有效治理仿刺参养殖水体有害藻华、对养殖生物无负面影响的藻华治理技术。

不同干燥方式对仿刺参性腺脂质、营养价值及挥发性物质的影响

为探究仿刺参性腺较优的干燥方式,分析对比热风、冷风、微波、真空冷冻4种干燥方式对样品脂质组成、脂质稳定性、脂肪酸营养价值、挥发性物质等的影响。结果表明,经干燥处理后,总脂、磷脂、甘油三酯、虾青素含量均不同程度降低,过氧化值均显著降低,硫代巴比妥酸值均显著升高(P<0.05)。在脂肪酸营养价值方面,动脉粥样硬化指数、血栓形成指数在干燥处理后不同程度降低,低胆固醇脂肪酸/高胆固醇脂肪酸指数显著升高(P<0.05)。电子鼻分析结果显示不同干燥方式样品的气味特征有明显差异。气相色谱-离子迁移谱从新鲜和干燥样品中鉴定出28种挥发性物质,其中2,5-二甲基吡嗪仅在微波干燥样品中被检测到,而戊醛、乙酸乙酯是冷风干燥样品中特有的气味活性物质。综上,真空冷冻干燥有效减缓了脂质氧化的速率,但样品气味相对平淡;热风、冷风、微波干燥均促进了脂质氧化,但提高了脂肪酸的营养价值,丰富了样品的气味特征。研究结果可为仿刺参性腺的加工利用提供理论基础。

仿刺参(Apostichopus japonicus)mtDNA三个基因片段的序列分析

采用PCR技术对中国烟台、威海和莱州三个地点仿刺参的16S rRNA、COI、IrRNA-COI三个mtDNA基因片段进行了扩增和测序,分别得到了长度约为570bp、640bp和900bp的三段序列,分析了三个采样点样品的遗传多样性。结果表明,每段基因序列扩增均获得两种单倍型,已在Genbank中注册(注册号码:AY852278—AY852283)。通过比较,三个地点样品的序列差异不显著,无缺失、插入、颠换的现象,只有个别位点出现转换,其中16S rRNA序列最为保守,16S rRNA、COI、IrRNA-COI三段序列A+T的平均含量为56·2%、59·2%、61·8%,均大于G+C含量。三个采样点样品同源性为99·84%—99·96%。将获得的仿刺参DNA序列和Genbank中的来自东太平洋8个外群进行基因序列比较,结果发现,不同目、科的海参的序列差异显著。采用DNAsp统计了各类位点数;MEGA2·1分析了碱基组成和遗传距离,构建了系统树。系统树体现的分类关系与这些物种的形态学分类关系完全一致。

响应面法优化大孔树脂纯化仿刺参中皂苷工艺研究

为优化大孔树脂纯化皂苷Holotoxin A_(1)(HA_(1))的最佳工艺条件,选择常用于纯化海参皂苷的4种不同结构的大孔树脂(AB-8、HP-20、D101和NKA-9),以皂苷HA_(1)为标准品,采用高效液相色谱法测定HA_(1)的含量,通过比较其静态吸附-解吸能力和静态吸附曲线,筛选合适树脂后,以粗皂苷质量浓度、乙醇体积分数和醇洗体积为因素,在单因素试验的基础上,采用Box-Behnken响应面试验确定最佳动态纯化工艺条件。试验结果显示,AB-8树脂对HA_(1)纯化效果最好,最佳纯化工艺为:粗皂苷质量浓度25mg/mL、流速1mL/min、上样体积25mL、水洗体积2倍柱体积、乙醇体积分数73%、醇洗体积7倍柱体积,此条件下,HA_(1)回收率为91.40%,纯度由0.16%提高至0.58%。本试验得到的纯化工艺适用于仿刺参中皂苷HA_(1)的纯化。

季节变化对仿刺参Toll样受体信号通路基因表达的影响

为探明季节变化对仿刺参先天性免疫系统中的重要免疫通路——Toll样受体(TLR)信号通路相关基因表达的影响,2018年1—12月,每月中旬从辽宁省海洋水产科学研究院引育种中心的仿刺参单养池塘采集仿刺参样品9只,通过实时荧光定量PCR技术测定仿刺参TLR信号通路主要因子的转录表达水平,同时测定池塘的主要水环境参数,通过皮尔逊相关性分析方法分析仿刺参TLR信号通路主要因子的转录表达与环境因子季节性变化的相关性。试验结果显示,6月Toll、IRAK4、P105、TAK、IκKβ、Rel、TLR3、TBK及IRF8基因的表达水平较低,表明仿刺参体内TLR信号通路的应答能力在夏初较低。通过相关性分析发现,MyD88和TRAF6基因转录表达的季节性变化与溶解氧水平的季节性变化呈显著正相关、TAK基因和TBK基因转录表达的季节性变化与水环境的氧化还原电位呈显著正相关、IRF8基因转录表达与水温呈显著负相关、SARM基因转录表达与水温呈显著正相关,表明池塘环境因子的季节变化影响仿刺参TLR信号通路相关因子的表达。氧化还原电位影响MyD88依赖途径,且是关键环境因子,溶解氧是影响MyD88依赖途径的关键环境因子,而水温是影响MyD88非依赖途径的关键环境因子。

仿刺参内脏的化学成分研究

采用正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、半制备型高效液相色谱和Sephadex LH-20凝胶柱色谱等分离技术对仿刺参(Apostichopus japonicus)内脏中的化学成分进行分离和纯化。通过1H NMR、13 C NMR、HSQC、HMBC、1H-1H COSY、HR-ESI-MS等波谱技术,结合文献数据比对,从仿刺参内脏95%乙醇提取液中鉴定出14个单体化合物,分别为(E)-dec-5-en-1-yl sulfate(1)、(Z)-dec-5-en-1-yl sulfate(2)、7-methyloctyl sulfate(3)、(S)-2,6-dimethylheptyl sulfate(4)、N-lactoyl-phenylalanine(5)、(1 S,3 S)-1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid(6)、(1 R,3 S)-1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid(7)、L-phenylalanine(8)、tyramine(9)、tryptamine(10)、L-tryptophan(11)、8-oxo-tryptamine(12)、3-(2-aminoethyl)-3-hydroxyindolin-2-one(13)、β-carboline(14)。其中,化合物1为新化合物,化合物5~14首次分离自仿刺参内脏。

池塘养殖仿刺参(Apostichopus japonicus)肠含物、附着基和底泥中的菌群结构及其相关性

2014年10月,利用PCR-DGGE技术分析了标准化养殖池塘中仿刺参(Apostichopus japonicus)肠含物及附着基和底泥中细菌的菌群结构及其相关性。结果显示,仿刺参肠含物、附着基、底泥中细菌多样性较高,分别平均获得30.00±1.00、15.33±1.70、21.67±2.62条带,肠含物中细菌种类数显著高于附着基和底泥。聚类分析和戴斯系数表明,不同池塘的仿刺参肠含物样本单独聚为一支,相似性达到0.785,附着基和底泥样品聚为一支,平均相似性达到0.532。不同样品DGGE图谱中20条优势条带的切割、克隆、测序,共获得了20条细菌序列,表明肠含物细菌种类以聚球藻属(Synechococcus sp.)、脱硫杆菌属(Desulfobacterium)、脱硫叠球菌属(Desulfosarcina sp.)、极地杆菌属(Polaribacter)、Algibacter sp.为主,附着基中主要以Robiginitalea sp.和Silicibacter sp.为主,底泥样品中主要以假单胞菌属(Proteobacterium)、噬胞菌属(Cytophaga)、Desulfosarcina sp.为主,肠含物中细菌特有种类的分离与鉴定为仿刺参养殖潜在益生菌的开发提供基础数据。

仿刺参(Apostichopus japonicus)摄食和运动器官的结构与功能

触手、管足是仿刺参(Apostichopus japonicus)的摄食和运动器官,对食物选择和生境斑块选择有着重要影响。本研究利用组织学、组织化学、透射电镜和扫描电镜技术对仿刺参触手、管足的组织结构,粘液细胞类型进行了研究,并探讨了触手和管足结构与功能的关系。研究查明了仿刺参触手柄部组织结构由外至内为角质层、上皮、疏松结缔组织、致密结缔组织、神经丛、纵肌层、间皮;触手末端与柄部结构组成基本相同,仅乳突腹面上皮加厚。管足吸盘由外自内依次为角质层、上皮、神经丛、结缔组织、端板、间皮。触手和管足细胞多含酸性粘多糖。触手乳突腹面分布有一种含有颗粒囊泡的粘液细胞,管足吸盘腹面存在有纤毛的非分泌细胞(CNS)、支持细胞(SC)、无纤毛细胞(NCS)。

仿刺参(Apostichopus japonicus)和海地瓜(Acaudina leucoprocta)体壁多肽的响应面法酶解和N末端测序

为充分开发利用海参资源,优化海参体壁酶解工艺,鉴定海参多肽,本文以水解度为指标,设计了3因素(时间、温度和加酶量)3水平的响应面实验,得到海参水解的最优条件是:仿刺参(Apostichopus japonicus)体壁在加酶量1.97%、温度55.7°C、水解136.8min的条件下,水解度为83.39%;海地瓜(Acaudina leucoprocta)体壁在加酶量1.70%、温度55.4°C、水解115.6min的条件下,水解度为63.68%。之后通过使用超滤膜、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)技术和蛋白测序仪等分析手段从水解产物中分离鉴定出4种多肽。其中,经N端序列鉴定出仿刺参多肽S1、S2氨基酸残基序列分别为Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Gln-Gly-ProGln-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ser-Ala-Leu和Trp-Pro-Pro-Gly-Asn-Ser-Gly-Ile-Gln-Gly。海地瓜多肽A1和A2氨基酸残基序列分别为Gly-Ala-Asn-Gly-Asn和Trp-Leu-Pro-Gly-Asp-Thr-Gly-Pro-Gln-GlyVal-Thr-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly。

间歇投喂添加蛋氨酸硒饲料对仿刺参(Apostichopus japonicus Selenka)幼参生长和免疫指标的影响

在水温9℃～13℃下,将平均体质量0.745±0.3 g的仿刺参(Apostichopus japonicus Selenka)随机投放到50cm×40cm×30cm的塑料水槽内,每箱10头,共分为五组,每组3个平行,采用不同间隔时间投喂每kg添加0.5 mg蛋氨酸硒的饲料:第1、2、3、4组分别间隔0、5、10和15 d投喂一次,第5组投喂不含硒的饲料(对照组)。60d的饲养结果表明:间歇投喂含硒饲料各组仿刺参的成活率和特定生长率差异不显著,但都明显高于对照组;每隔5 d投喂一次含硒饲料的刺参体腔液中SOD活力(78.34U/ml)显著高于其他组(P<0.05);谷胱甘肽的浓度(2.87×10-5mol/L)对照组差异不显著,但显著高于其它组(P<0.05);连续投喂含硒饲料的仿刺参体内的酸、碱磷酸酶活性(2.42U/ml,5.76U/ml)显著高于其他组(P<0.05)。建议在生产中宜每日或最多间隔5 d投喂含硒饲料。

仿刺参(Apostichopus japonicus)多倍体诱导的初步研究

报道了仿刺参 (ApostichopusjaponicusLiao)多倍体诱导的结果。采用经紫外线照射后的海水成功地使仿刺参分别单独产卵、排精 ,从而准确地控制了仿刺参的多倍体诱导的开始时间。使用 0 2、 0 4mg/L细胞松弛素B (CB)在授精后 5、 1 0min开始处理受精卵抑制第一极体 (PB1 )放出 ,用 1 0、 2 0、 30、 40mg/L的 6-二甲基氨基嘌呤 ( 6-DMAP)分别在授精后 5、 1 0、 2 0、 2 8、 35min开始处理抑制受精卵PB1 、第二极体(PB2 )放出的方法诱导了刺参的多倍体。研究了诱导的药物浓度、处理时间与诱导效果的关系 ,同时对幼体的成活率等进行了探讨。结果表明 ,2种药物均可诱导仿刺参产生三倍体和四倍体。采用CB抑制PB1 诱导 ,到达小耳幼体时 ,可产生 2 1 3%的四倍体。用 6-DMAP抑制PB2 放出诱导三倍体 ,三倍体率可达 2 5 8%。在幼虫浮游期中 ,处理组和对照组幼虫的摄食、生长、浮游时间以及变态率等方面没有明显差异。

不同密度的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)与仿刺参(Apostichopus japonicus Selenka)混养的研究

在水温13.0-23.0℃、容积50L（45cm×31cm×30cm）的塑料水槽中,分别放养5、10和20个重（2.7±0.7）g的皱纹盘鲍（Haliotis discushannai Ino）,多量投喂海带,再分别混养0和5头重（1.8±0.5）g的仿刺参（Apostichopus japonicus Selenka）,不投喂。153d的饲养表明,在相同密度下,混养鲍的特殊生长率（SGR）和成活率依次比单养高16.6%、5.7%;7.1%、7.1%;1.9%、10.4%;饲料系数降低了11.7%、5.8%、2.4%。与单养池相比,混养池水中氨氮含量低而稳,溶氧量高。文中讨论了鲍与仿刺参混养的适宜比例和方式。

仿刺参不同部位ACE抑制活性分析及活性肽制备工艺优化

本文对仿刺参具有高降血压活性部位进行筛选并优化其活性肽制备工艺。采用酶解法对仿刺参不同部位(体壁、肠、卵)进行水解,以血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)抑制率为指标筛选最适蛋白酶,通过对各酶解物ACE抑制率的半数抑制浓度(IC_(50))测定比较筛选出最优抑制活性部位。经单因素实验与响应面试验优化确定活性肽最佳酶解制备条件,对蛋白酶解物进行分子量测定确定其分布范围,经超滤膜分离后对不同组分的ACE抑制活性分析。结果显示,选用碱性蛋白酶为最适水解酶,体壁、肠、卵各蛋白酶解物的ACE抑制率的IC50分别为1.11、4.02、0.65 mg/mL,仿刺参卵具有更好的ACE抑制效果,为最优抑制活性部位。其最佳的酶解制备工艺参数为:酶解时间5 h,加酶量3.5 U/mg,酶解温度65.26℃,底物浓度3.51%,酶解pH9.02,在该条件下仿刺参卵酶解产物的ACE抑制率为80.65%±0.52%,与预测值接近。蛋白酶解产物的分子量集中分布在3000 Da以下,占总含量的98.37%,其中1000~3000 Da占比9.50%,小于1000 Da占比88.87%。超滤膜分离所得低聚肽组分ACE抑制活性(IC_(50)=0.30 mg/mL)显著(P<0.05)强于经工艺优化后酶解物及截留液组分。本研究结果为仿刺参副产物高值化利用提供理论依据,可作为分离纯化制备降血压肽的优质资源。

不同形状的附着基对仿刺参(Apostichopus japonicus Selenka)幼参生长的影响

在水温9.0-16.0℃下,将体质量0.5g±0.2g的仿刺参(Apostichopus japonicus Selenka)放养在放置了混凝土制的中空型(A类)、楼层型(B类)和井字型(C类)附着基的塑料水槽(45cm×31cm×30cm)中,投喂配合饲料,采用每周清洗一次附着基(A’组、B组’和C’组)和不清洗附着基(A组、B组和C组)的方法饲养80d,研究了3种形状附着基对仿刺参生长的影响。结果表明,清洗对仿刺参特殊增长率有极显著影响(P<0.01),清洗与附着基形状的交互作用对仿刺参特殊增长率有显著影响(P<0.05)。清洗的楼层型附着基组(B’组)特殊增长率最高,不清洗的楼层型(B组)最低,两者之间差异显著。饲养的前60d,放置不同形状附着基的水槽水中亚硝酸、氨氮和COD等的含量低而稳,各组间差异不显著。但后期各组上述水化学指标急剧上升;定期清洗的水中均低于不清洗组。放置附着基而不清洗的水槽中的仿刺参体腔液中超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LYS)的活性分别比冲洗的水槽中高32.28%、9.17%和5.71%。A组仿刺参体腔液中SOD的活性与A’组差异极显著(P<0.01),B组与B’组差异显著(P<0.05),C组与C’差异极显著(P<0.01)。文中从生态作用和空间面积比例等讨论了附着基结构与功能对仿刺参生长影响的机理。