伊尼奥小单孢工程菌S_(96)深层优化培养特性研究

目的 :伊尼奥小单孢工程菌S96的深层优化培养特性。方法 :借助于国内外学者的经验 ,并结合微生物生长和生产营养原理 ,粗筛出一组较合适的生产配方 ,然后应用正交试验和数理统计法 ,优化出适合于工程菌S96的发酵生产配方 ,其组成为 :淀粉 5 5 % ,黄豆粉 3 5 % ,K2 HPO40 0 4 % ,花生粉 1 5 % ,蛋白胨 0 3% ,葡萄糖 0 1% ,CoCl2 10r/ml,消沫剂适量。根据溶氧曲线 ,优化发酵工艺 ,获得一套较适合于工程菌S96的代谢曲线特性图 ,按照该曲线特性图进行调控 ,可使西索米星的生产水平接近于实验室生产水平 ,充分发挥了工程菌S96的抗生素生物合成潜力 ,达到了较为理想的效果。

伊尼奥小单孢菌2-脱氧蟹肌醇胺脱氢酶基因sisP的克隆与表达

目的:克隆西索米星生物合成基因——2-脱氧蟹肌胺(DOIA)脱氢酶基因。方法:以庆大霉素生物合成基因簇(AY524043)中的DOIA脱氢酶基因gntP作为参考模板设计引物,从伊尼奥小单孢菌(Micromonospora inyoensis)中,通过PCR方法扩增参与西索米星生物合成的DOIA脱氢酶基因,经测序鉴定、序列分析,并通过表达载体对该基因进行异源表达。结果:PCR扩增到一条长约1 035 bp的条带,包含一个开放阅读框长1 023 bp,推测其编码含340个氨基酸残基的蛋白质(相对分子质量约36×103),与已报道的DOIA脱氢酶同源性很高,该基因在IPTG诱导下,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)实现过量表达,表达产物的相对分子质量与预测值一致。结论:通过PCR技术从伊尼奥小单孢菌中克隆到参与西索米星生物合成基因——DOIA脱氢酶基因,命名为sisP,GenBank登录号为EU200975。

伊尼奥小单孢菌产生的西索米星抗性基因克隆及其特性

西索米星是一种广谱氨基糖苷类抗生素,对革兰氏阳性、阴性菌以及分枝杆菌有效。Reimann报道,西索米星具有拟三糖结构,存在一个氨基环醇配基,α—脱氧链霉胺通过糖甙键与α—氨基—α—脱氧—D—葡萄糖和D—木糖相连。尽管西索米星的生物代谢途径未作详细研究,有人用西索米星阻遏突变株分析了突变合成产物和中间体。

ARTP诱变结合抗性筛选选育西索米星高产菌株

目的利用等离子体诱变,结合抗生素抗性筛选,获得西索米星高产菌株。方法首先通过链霉素抗性筛选,获得一株比出发菌株产抗能力高的S4;随后以S4为出发菌株,经等离子体处理40s,借助巴龙霉素抗性筛选,得到双重抗性菌株。最后对突变株进行再次诱变,并结合高浓度链霉素抗性筛选。结果获得一株高产突变株M. inyoensis SAAP22,比出发菌株效价提高了38.18%,具有稳定的遗传性能。结论通过等离子体诱变,结合抗生素抗性筛选,可有效提升伊尼奥小单孢菌的西索米星合成能力,所得高产菌株具有潜在应用价值。

西索米星生产菌株的诱变选育及工艺优化

利用原生质体常压室温等离子体(ARTP)诱变方法选育西索米星高产菌株,经诱变筛选获得一株高产菌株I4-10,其西索米星的生物效价达到1389 U/mL,较原始菌株提高了35.4%。通过对高产菌株I4-10进行碳源、氮源优化,确定可溶性淀粉和牛肉粉是突变菌株I4-10的最适碳源和氮源。进一步采用响应面实验设计方法优化发酵培养基,结果表明黄豆饼粉和DL-蛋氨酸的添加量为显著影响因素,经优化其最适添加质量浓度分别为32.78 g/L和1.75 g/L。在此最适工艺下,西索米星的生物效价提高至1849 U/mL,较原始菌株提高了80%。最后对原始菌及高产突变株中西索米星代谢途径及菌株生长相关的关键酶进行转录水平比较分析,初步解析了突变菌株I4-10高产西索米星的机制。

西索米星分批发酵过程动力学模型

采用伊尼奥小单孢菌F003为产生菌的西索米星发酵过程具有典型的非生长耦联特征,西索米星浓度大于0.50g/L将明显抑制产物合成.建立了符合不同时期微生物代谢特性的西索米星分批发酵动力学模型,并对模型参数进行了估计和回归,模型拟合偏差平方和≤6%,模型能很好地描述西索米星发酵过程菌体的生长、底物的消耗和产物的合成.菌体生长期动力学模型参数μm、Ks、Kx、m分别为：0.058 h-1、4.046 g/L、0.433 g/g、0.0001 g/（g·h）;产物合成期动力学模型参数μKx、K2、N、Yx、Yp、m分别为：0.058 h^-1、60.556 g/g、1.198 g/（g·h）、0.606、0.090 g/g、0.095 g/g、0.00173 g/（g·h）.验证实验表明,所建立的模型能较好地预测初始淀粉浓度为50.0～70.0 g/L时西索米星的发酵过程特性.