伊短菌素A标品的制备及HPLC定量分析

目的制备伊短菌素A标品并建立其定量分析方法。方法发酵液经过预处理后,采用阳离子吸附树脂富集和反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化,制备得到伊短菌素A。通过质谱、核磁共振谱等确证化学结构,高效液相色谱法测定样品纯度。定量分析方法采用XAqua C_(18)(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相:0.1%TFA水溶液-甲醇(90:10,V/V);流速:1 mL/min,检测波长:272 nm,柱温:35℃,进样量:20μL。结果制备了高纯度的伊短菌素A标品。优化定量条件下伊短菌素A在15~1200 mg/L范围内浓度与峰面积线性关系良好;加标回收率在92.61%~107.33%;测定峰面积的相对标准偏差为0.163566%(n=6),<1.0%;检测限和定量限分别为16.74 ng和55.79 ng。结论本文所建立的制备方法操作简单,易放大生产。定量方法简单快速,准确度和重现性良好。适用于伊短菌素A的定量分析。

双组分系统YvrG/YvrH调控伊短菌素生物合成的研究

伊短菌素(edeine)是短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)X23产生的线性非核糖体抗菌肽,具有抑菌谱广、抑菌活性强的特点。通过转录组测序,发现双组分调控因子yvrG/yvrH与伊短菌素生物合成基因簇(ede BGC)的表达模式相反,推测YvrG/YvrH可能参与ede BGC的转录调控。本研究利用Red/ET同源重组技术构建yvrG/yvrH的X23缺失菌株、回补菌株、过表达菌株,通过表型分析及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术研究YvrG/YvrH对伊短菌素生物合成的影响。结果显示,ΔyvrG/yvrH的抑菌活性显著降低,且ede BGC的表达水平下调,伊短菌素的合成受到了抑制,产量降低了46.75%。综上所述,YvrG/YvrH正调控伊短菌素的生物合成。本研究为伊短菌素代谢工程改造提供了基因调控元件。

双组分因子LiaRS调控短短芽胞杆菌X23伊短菌素生物合成的研究

双组分系统(two-component system,TCS)参与多种芽胞杆菌次级代谢产物生物合成的调控,但调控伊短菌素生物合成的TCS鲜见报道。前期转录组测序分析发现,在短短芽胞杆菌X23中,双组分因子LiaRS与伊短菌素生物合成基因簇(edeBGC)的表达趋势一致,推测其可能参与伊短菌素生物合成的调控,通过Red/ET同源重组法敲除野生型X23的liaS和liaR基因,构建了突变体菌株,平皿对峙培养、qRT-PCR定量分析和HPLC-MS靶向代谢分析等结果表明,在相同培养条件下,突变菌株的抑菌圈直径较野生型显著增加,伊短菌素生物合成基因簇的表达量显著上调,且伊短菌素的峰面积是野生型的1.3倍。本研究发现LiaRS是伊短菌素生物合成的负调控因子,为伊短菌素的代谢工程改造提供了候选基因元件。

Brevibacillus brevis B011次级代谢物中抗青枯菌活性物质的纯化鉴定及生物合成基因簇分析

青枯病是世界上最为严重的植物细菌性病害之一,生物防治是防控其危害的热点研究领域,而分泌抑菌活性物质被认为是生防菌抑制病原菌的主要作用机制。本研究在前期筛选到对青枯菌有良好拮抗活性的短短芽孢杆菌B011(Brevibacillus brevis B011)基础上,采用色谱法分离纯化到抗青枯菌的主要活性物质,通过串联质谱和核磁波谱分析方法鉴定了其结构,并根据B011菌株全基因组序列,预测了活性化合物生物合成相关基因及其合成途径。结果表明,B.brevis B011次生代谢物中抑制青枯菌的主效活性物质为伊短菌素A(edeine A),次效活性物质为N-乙酰基色胺[N-(2-(1H-indol-3-yl)ethyl)acetamide]。这两种化合物对青枯菌的抑制活性为首次报道。基因簇预测结果表明,B011菌株基因组中存在完整的edeine合成基因簇,共包括17个基因,即edeA~edeQ,且基因簇中的基因结构完整,基因序列高度保守。B011基因组中有多个N-乙酰基色胺的生物合成相关基因,包括17个脱羧酶编码基因和54个乙酰转移酶编码基因,可能分别参与色氨酸脱羧反应和色胺的乙酰基转移反应,但具体由哪些基因参与还需进一步的研究。研究结果可为该生防菌的应用提供理论指导,也可为后续解析其生物合成途径及通过合成生物学方法进行定向改造奠定基础。