伏马菌素B_(1)脱毒研究进展

伏马菌素B_(1)(FB_(1))是由镰刀菌产生的水溶性代谢产物,存在于镰刀菌污染了的谷物、油料作物、坚果、饲草和饲料中,是常见的真菌毒素之一。FB_(1)会对神经系统、呼吸系统、消化系统和生殖系统产生不同毒性作用,给农牧业造成不可估量的经济损失。如何对FB_(1)进行脱毒,以降低其毒性作用,是目前研究的热点。因此,本文对FB_(1)的物理脱毒、化学脱毒、生物脱毒及其应用进行综述,重点对常用于FB_(1)生物脱毒的菌株和酶及其脱毒效果、脱毒机制进行了深入探讨,以期为提高FB_(1)脱毒效率和开发新的FB_(1)脱毒方法提供参考和思路。

基于氧化应激和线粒体功能障碍的伏马毒素B1诱导线虫神经毒性机制

为研究线粒体功能和氧化应激在伏马毒素B1(fumonisin B1,FB1)诱导神经毒性中的作用,以秀丽隐杆线虫为模型,对FB1处理后的线虫行为表型以及包括氧化应激和线粒体功能相关指标变化进行分析。结果表明,20~200μg/mL的FB1暴露24 h以剂量依赖方式诱导细胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)相关基因(cyp35A2、sod-1、sod-3、ctl-2和ctl-3)的异常表达。此外,100~200μg/mL的FB1处理降低了线虫线粒体密度,并显著降低了三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平和线粒体膜电位(P<0.05)。200μg/mL的FB1处理显著抑制了线虫线粒体呼吸链复合物I和Ⅴ的表达,提高了线粒体分裂基因drp-1的表达水平。相关性分析显示,氧化应激和线粒体功能相关指标的表达与线虫行为学表型具有显著相关性。综上,FB1可能通过参与线虫氧化应激、线粒体呼吸链和线粒体动力学过程诱导神经毒性。

谷物中伏马菌素B_1酶联免疫分析法的建立

以匙孔血蓝蛋白(KLH)为载体,采用碳化亚二胺法人工合成伏马菌素B1(FB1)抗原FB1-KLH,免疫大白兔获得特异性良好的抗FB1多克隆抗体;在多克隆抗体的基础上建立伏马菌素B1的间接竞争酶联免疫吸附分析方法,该方法IC50为11.7μg/L,最低检出限1.1μg/L,平均批内和批间变异系数分别为5.8%、10.2%;分析不同溶剂对标准曲线和加标回收率的影响,确定PBS溶液为样本最佳提取溶剂;在玉米、小麦、大米、高粱谷物样本中添加50～500μg/kg的FB1标准品,平均回收率在70.5%～105.6%之间。将该方法应用于40份谷物样本中FB1的检测,检测结果与高效液相色谱的相关系数(R2)为0.9547。该方法简单、灵敏、快速、准确,适用于谷物中FB1的检测。

伏马菌素B_1人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

本研究合成并鉴定伏马菌素B1(FB1)人工抗原,通过动物免疫制备敏感性高、特异性好的鼠源FB1多克隆抗血清。采用碳二亚胺(EDC)法将FB1分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,合成免疫抗原FB1-BSA和检测抗原FB1-OVA,经鉴定后,分别按10和30μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔3周,最后1次免疫30d后,断尾采血,制备多抗血清。利用间接ELISA方法测定抗血清效价,间接竞争ELISA测定敏感性和特异性。结果表明,免疫的6只小鼠效价均达1∶104以上,3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为61.3ng/ml,且具有良好的特异性。本试验成功合成了FB1人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的鼠源多克隆抗体血清,为FB1单克隆抗体制备及其免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。

抗伏马菌素B_1单克隆抗体的制备及试剂盒的研制

目的为了能够快速检测粮谷类食品中伏马菌素B1的污染水平,研制具有我国自主知识产权的针对伏马菌素B1快速检测试剂盒.方法制备了能分泌抗伏马菌素B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,建立了敏感、特异、快速的酶联免疫吸附试验检测方法,最终形成具有中国自主知识产权的伏马菌素B1快速检测试剂盒.结果该试剂盒所用单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,亲和常数为8.3×10^-8mol/L.该抗体与其他结构类似物无明显交叉反应,具有较高的特异性.试剂盒对伏马菌素B1最低检出限5ng/ml,标准曲线的线性范围（50～500ng/m1）,回归方程Y=-0.582X＋1.793（r=0.99,P＜0.05）;对玉米作50ng/ml,200ng/ml和500ng/ml 3个加标浓度的回收率在71.89%～112.95%之间;试剂盒在常温状态下有效期至少10个月;实验室内的变异系数和实验室间的变异系数均小于20%.

伏马菌素B_1免疫检测方法的研究

本研究建立了用于检测粮食、饲料中伏马菌素Ｂ１（ＦＢ１）的快速、灵敏、简便的免疫检测方法—建立在单克隆抗体基础上的直接竞争性酶联免疫吸附测定方法（ＤＣ—ＥＬＩＳＡ法）；其最低检出浓度为１０ｎｇ／ｍｌ，线性范围在１０ｎｇ～５μｇ／ｍｌ。对新疆、安徽、黑龙江、哈尔滨四省市玉米样品中的ＦＢ１含量进行了测定，结果表明１５６份样品中有３４份检出ＦＢ１，阳性率为２１．７９％，含量在０．１８～３１．３２μｇ／ｇ范围内，平均含量为１２．０４μｇ／ｇ。

伏马菌素B_1单克隆抗体的制备及免疫学检测方法初步应用

拟制备灵敏高、特异性强的抗伏马菌素B_1(FB_1)单克隆抗体,并初步应用于FB_1的检测,以期为FB_1的免疫学快速检测提供技术支持。采用碳二亚胺法(EDC)制备人工抗原FB_1-BSA和FB_1-OVA。以免疫原FB_1-BSA免疫BALB/c小鼠,每四周免疫一次。四免后,小鼠脾B细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,采用ELISA筛选,建立分泌抗FB_1抗体的单克隆杂交瘤细胞株;采用动物体内诱生腹水方法制备出抗FB_1单抗,并鉴定单抗的各种性能;初步建立FB_1免疫学检测方法。结果得到1株稳定分泌抗FB_1单抗的杂交瘤细胞株2E11-H3,该细胞株分泌的mAbs的效价高达1∶1.02×10~6,亲和力常数平均值为7.98×10^(10) L·mol^(-1),亚型为IgG_3。FB_1mAbs的工作浓度为1∶6.0×10~4,与FB_1发生特异性反应,间接竞争ELISA测得IC_(50)=43.65ng·mL^(-1);与FB_1结构类似物FB_2和FB_3的交叉反应率分别为385%和72.4%,与其他霉菌毒素及载体蛋白BSA和OVA均无交叉反应。样品回收率在85.85%~114.07%,平均值为98.81%;变异系数为10.11%。本研究制备出了灵敏度高、特异性强、亲和力高的FB_1单抗,并初步建立FB_1免疫学检测方法。

食管癌高发区玉米中伏马菌素B1的检测

目的：检测串珠镰刀菌主要代谢产物ＦｕｍｏｎｉｓｉｎＢ１在华北食管癌高发区玉米中的含量并比较高发区和低发区的含量差别。方法：反相高效液相色谱柱前衍生荧光法。结果：正常玉米ＦＢ１的阳性率为９０９０％，平均含量为１４０±０５０μｇ／ｇ。霉变玉米的阳性率为１００％，平均含量为８８９１±１３０７μｇ／ｇ。结论：高发区的串珠镰刀菌污染率和ＦＢ１含量比较高。

伏马菌素B_1特异单链抗体的同源建模及分子对接模拟研究

目的分析伏马菌素B1(Fumonisin B1,FB1)与其特异单链抗体的分子互作模式。方法通过同源建模构建和优化抗FB1单链抗体的三维结构,结合Procheck和Verify 3D等方法评价得到稳定的抗体模型,利用分子对接研究单链抗体与其抗原FB1的结合特性、疏水性和表面静电力作用。结果单链抗体的互补决定区参与同其抗原FB1的结合,抗体与抗原之间不仅形成稳定的氢键,疏水性和静电力的匹配也很好。结论氢键结合力、分子间疏水相互作用和静电力的共同作用,使得单链抗体形成一个能够与FB1高度互补的相互作用区域,并在抗体与抗原的特异性识别及结合稳定性等方面起着关键作用。

伏马菌素B_1免疫学检测方法的建立

目的 建立应用单克隆抗体的伏马菌素B1（fumonisin B1，FB1）间接竞争酶联免疫吸附检测方法。方法 利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗FB1单克隆抗体，建立FB1间接竞争酶联免疫吸附方法。结果 建立稳定分泌抗FB1毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分泌的抗体为IgG1亚类，分子量150KD，腹水稀释度为1：2．0×10^8，亲和常数为6．72×10^9L／mol。FB1间接竞争酶联免疫吸附方法的最低检出浓度为5μg／L，校正曲线的线性范围50～500μg/L，线性方程Y=-0．582X＋1．793（r=0．99，P〈0．05）；与脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素均无交叉反应。回收率71．89％～112．95％，平均回收率100．23％。结论 所建立的检测方法具有快速、简便、灵敏的特点，可满足实际工作需要。

抗伏马菌素B1单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备抗伏马菌素B1(Fumonisin B1,FB1)单克隆抗体(mAb),并对其进行特性鉴定。方法:人工合成免疫原BSA-FB1,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞融合技术制备抗FB1的mAb,通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选阳性克隆。以间接竞争ELISA法对mAb的敏感性、特异性、亲和力等特性进行检测,并对其效价、亚类、稳定性等特性进行鉴定。结果:获得了1株稳定分泌抗FB1mAb的杂交瘤细胞(命名为5H12-C6-C2),其亚类为IgG2b,腹水和上清效价分别为1∶1.28×106和1∶3.2×103,亲和常数为3.13×106M-1。mAb的间接竞争ELISA法灵敏度为0.09088mg/L,与FB1的类似物FB2有轻微交叉反应,与污染玉米的另外5种真菌毒素ZEN、AFB1、DON、T-2、OA以及载体蛋白BSA和OVA无交叉反应性,稳定性良好。结论:成功地制备了抗FB1特异性mAb,为开展FB1免疫学检测方法的研究提供了有力的工具。

伏马菌素B_1人工抗原的鉴定及抗体的制备

采用戊二醛(GA)一步法将半抗原伏马菌素B1(FB1)分别与鸡卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备2种具有免疫原性的FB1人工抗原FB1-OVA和FB1-BSA。分别采用凝胶电泳法、紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、基质辅助激光分析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)4种方法鉴定人工抗原偶联效果并测定偶联比。将FB1-BSA作为免疫抗原免疫BALB/c小鼠,FB1-OVA作为固相包被抗原,采用间接酶联免疫吸附法(i-ELISA)测定小鼠抗血清滴度。结果表明:4种方法均鉴定FB1人工抗原合成成功。凝胶电泳法测定FB1-OVA和FB1-BSA相对分子质量分别约为50 000和75 000。MALDI-TOF-MS测定FB1-OVA和FB1-BSA相对分子质量分别为48 009.212和74 355.301,并精确计算FB1-OVA和FB1-BSA偶联比分别为5∶1和10∶1。FB1-BSA免疫后小鼠的抗血清效价为1∶1.25×105,并具有较高灵敏度。

伏马菌素B1免疫学检测方法的研究

目的制备抗伏马菌素B1(Fumonisin B1,FB1)单克隆抗体,在此基础上建立一种可用于定量检测玉米中FB1含量的间接竞争ELISA方法。方法人工合成免疫原BSA-FB1和包被抗原OVA-FB1,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞融合技术制备抗FB1的单抗,并对其特性进行鉴定。以OVA-FB1作为包被抗原,FB1为竞争抗原,两者与一定量的抗FB1单抗竞争反应,建立检测FB1的间接竞争ELISA方法,对玉米样品进行初步检测应用。结果获得了1株稳定分泌抗FB1单克隆抗体的杂交瘤细胞(命名为5H12-C6-C2)。对间接竞争ELISA方法进行反应条件优化后,建立了检测FB1的标准曲线,回归方程为y=1.113-0.313x,相关系数R2为-0.990,最适可测范围为10ng/ml^1000ng/ml,灵敏度为90.88ng/nl,最低检测限为7.83ng/ml,方法的批内和批间平均变异系数分别为3.24%和2.45%,样品添加平均回收率为94.32%。结论成功地制备了抗FB1特异性单抗,建立了FB1的间接竞争ELISA检测方法,为进一步研制FB1检测试剂盒奠定了基础。

伏马菌素B_1单克隆抗体制备及化学发光免疫检测方法的建立

制备了高亲和力的伏马菌素B_1(FB_1)单克隆抗体,进而建立了谷物中FB_1的直接竞争化学发光酶联免疫检测方法(dc-CLEIA)。采用碳化二亚胺法成功合成了FB_1人工抗原,经杂交瘤技术获得分泌FB_1特异性抗体的细胞株,高碘酸钠法酶标单克隆抗体后,建立了FB_1的dc-CLEIA,本方法的IC_(50)值为1.43μg/L,线性范围为0.32～8.40μg/L,检出限为0.13μg/L,竞争反应时间仅需20 min。玉米样品加标回收率为100.2%～115.4%,相对标准偏差小于8.7%,谷物样品的检测结果与高效液相色谱法及商业化ELISA试剂盒检测结果相符。

伏马菌素B_1对人正常食管上皮细胞细胞周期相关基因mRNA表达的影响

本研究采用体外实验,分离鉴定人正常食管上皮细胞,用RT-PCR方法测定伏马菌素B1(fumonisin B1,FB1)对细胞周期相关基因Cyclin D1、Cyclin E、P16、P21、P27mRNA表达的影响。结果表明:FB1作用人正常食管上皮细胞后可以在转录水平上影响Cyclin D1、Cyclin E、P16、P21、P27基因的表达,导致Cyclin D1mRNA高表达,Cyclin E、P16、P21、P27基因mRNA低表达。提示,细胞周期相关基因的异常表达与癌症密切相关,该研究从体外实验进一步证实FB1可能与人类食管癌的发生有关。

伏马菌素B_1单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】真菌毒素可导致严重的食品安全问题。本试验旨在制备可用于检测伏马菌素B1的特异性单克隆抗体。【方法】制备伏马菌素B1人工抗原,杂交瘤细胞法筛选杂交瘤细胞株制备腹水型单克隆抗体,并对其特性进行鉴定。【结果】筛选得到杂交瘤细胞株F3,分泌的单克隆抗体亚类为IgG1,轻链类型为κ链;10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单抗蛋白重链分子质量约为50 kD,轻链分子质量约为25 kD;间接酶联免疫吸附法测定杂交瘤细胞F3细胞培养上清和腹水效价分别为1:3 200和1:51 200;亲和力常数为1.60×10-8 mol.L-1;IC50值可达3.589ng.mL-1;对其它真菌毒素不存在交叉反应;免疫转印法鉴定抗体具有高特异性。【结论】本试验制备FB1单克隆抗体具有较好亲和力和高特异性,具有良好的应用价值。

抗伏马菌素B_1单克隆抗体的制备及鉴定

选择钥孔虫戚血蓝蛋白（ Ｋ Ｌ Ｈ）和牛血清白蛋白（ Ｂ Ｓ Ａ）作为半抗原伏马菌素 Ｂ１ （ Ｆ Ｂ１ ）的载体蛋白，以戊二醛一步法分别制备免疫原 Ｋ Ｌ Ｈ Ｆ Ｂ１ 和固相抗原 Ｂ Ｓ Ａ Ｆ Ｂ１ 蛋白结合物。用 Ｋ Ｌ Ｈ Ｆ Ｂ１ 免疫 Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠后，应用细胞融合技术，筛选后获得了１株稳定分泌抗 Ｆ Ｂ１ 单克隆抗体的杂交瘤细胞株（ Ｆ Ｂ１ ４ Ｇ４ ），分泌的抗体属于 Ｉｇ Ｇ１ 亚类。腹水的抗体效价为１ｖ１×１０７ ，抗体与其它３种真菌毒素、 Ｆ Ｂ３ 和２种载体蛋白均无交叉反应，与 Ｆ Ｂ２有轻微的交叉反应。

伏马菌素B_1单抗ELISA检测试剂盒研制

目的研制快速检测粮食中伏马菌素B1(FB1)的试剂盒。方法在制备抗FB1单克隆抗体基础上,利用间接竞争酶联免疫吸附方法研制FB1快速检测试剂盒。结果该试剂盒最低检出浓度为5ng/ml,校正曲线线性范围50～500ng/ml,线性方程Y=-0.582X+1.793(r=0.99,P<0.05)。与脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素均无交叉反应。回收率在71.89%～112.95%之间,平均回收率为100.23%。试剂盒常温下可保存225d,实验室内的变异系数和实验室间变异系数均<20%。结论该试剂盒快速、简单、灵敏,可满足实际工作需要。

直接竞争化学发光酶免疫法检测谷物中的伏马菌素B_1

建立1种检测谷物中伏马菌素B1的直接竞争化学发光酶免疫方法。该方法的最佳检测条件为:抗原包被质量浓度0.4μg/mL,酶标抗体3000倍稀释,竞争反应时间20min;检测限为0.13ng/mL,半抑制浓度(IC50)为1.43ng/mL,批内变异系数2.4%,批间变异系数9.2%,以玉米为样品的加标回收率达到100.2%～115.4%。谷物盲样的检测结果显示,该方法与酶联免疫吸附检测试剂盒、高效液相色谱检测结果的相关系数分别为0.9793、0.9851,三者之间无显著性差异,所建立的直接竞争化学发光酶免疫方法可用于谷物样品中伏马菌素B1的大规模快速筛查。