按痘苗病毒优势密码子改造HIV-1 gag基因提高表达水平的研究

为确定痘苗病毒密码子偏向性与基因表达的关系及其在痘苗病毒与宿主细胞相互作用过程中的作用,按痘苗病毒的优势密码子对HIV-1gag基因进行改造,并对合成基因与野生型HIV-1gag基因在痘苗病毒载体系统的表达水平进行了研究。结果显示:①各目的基因分别正向插入了痘苗病毒TK区7.5k启动子下游;②免疫荧光检测显示,改造前后的gag基因均能够很好地在痘苗病毒中表达;③Westernblot检测显示,在相同感染量时,改造后的gag基因具有更高的表达水平;④流式细胞术检测显示,密码子改造后的gag基因较野生型gag基因表达水平提高约17%。上述结果表明:按照痘苗病毒优势密码子进行外源基因改造,可作为提高外源基因在痘苗病毒中表达的策略,同时提示,密码子偏向性是痘苗病毒与宿主细胞相互作用的重要调控因素。

密码子优化的肺炎支原体P1蛋白在大肠杆菌中的克隆表达

目的：获得密码子优化的肺炎支原体P1黏附蛋白优势表位抗原基因,并在大肠杆菌中表达,为临床诊断试剂和疫苗研制打下基础。方法：采用生物信息学分析肺炎支原体P1蛋白的抗原表位,筛选特异性P1蛋白优势表位区;采用大肠杆菌优势密码子,设计上述P1蛋白优势表位基因序列;采用退火PCR技术合成上述基因,并利用载体pGEX-4T-2实现P1优势表位抗原在大肠杆菌中的表达;采用ELISA法对纯化的P1抗原活性进行测定。结果：肺炎支原体P1蛋白特异性抗原表位主要位于1154~1521 aa,获得的P1优化密码子基因平行突变37个稀有密码子和2个终止密码子;在大肠杆菌中表达的GST-P1融合蛋白的相对分子质量为65.9×103,纯化后重组抗原能与肺炎支原体感染者血清发生特异性的免疫反应。结论：采用密码子优化基因合成技术实现了肺炎支原体P1优势表位抗原在大肠杆菌中的高效表达,为肺炎支原体感染的诊断试剂研究提供了重要参考。

肺炎支原体黏附蛋白P30的高效表达及初步应用

目的:克隆表达肺炎支原体黏附蛋白P30,为临床诊断试剂和疫苗研制打下基础。方法:采用大肠杆菌优势密码子设计P30蛋白优化基因序列,采用Genscript软件评价设计基因的密码子适应指数(CAI),并利用载体p BVIL1实现P30优势表位基因在大肠杆菌中的表达,采用ELISA法对纯化的P30抗原活性进行测定。结果:野生P30基因的CAI为0.59,优化P30基因的CAI为0.84;在大肠杆菌中表达的IL1-P30融合蛋白的相对分子质量为43.5×103,纯化后的重组抗原能与肺炎支原体感染者血清发生特异性免疫反应,灵敏度和特异性分别为82.35%和89.36%,ROC曲线下面积为0.9088。结论:采用密码子优化技术实现了肺炎支原体黏附蛋白P30在大肠杆菌中的高效表达,获得的重组P30蛋白具有很好的抗原性,可用于肺炎支原体诊断试剂的研究。

木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌中的高效表达

参照Genebank中疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A基因序列,以引物拼接方式,人工合成采用大肠杆菌优势密码子的基因xynA,插入pET-20b载体,获得重组表达载体pET-20b-xynA。重组菌在16℃下诱导效果最好,10 h酶活达到42.05 U/mL,重组酶占全细胞蛋白的47%,粗酶在65℃和pH 5～8条件下很稳定。