海南雷公笋的SCoT-PCR体系优化及有效引物筛选

[目的]分析DNA、引物,dNTPs、Taq DNA聚合酶4种因素对雷公笋SCoT-PCR扩增结果的影响,通过最优的SCoT-PCR反应体系筛选多态性引物,为雷公笋种质资源分子标记研究提供条件。[方法]以海南雷公笋为材料,采用单因素试验和正交试验方法。[结果]Taq酶对雷公笋SCoT-PCR扩增的影响最大,其次是模板DNA和dNTPs,最后是引物;最优反应体系为20μL体系中40 ng DNA,0.30μmol/L引物,0.25 mmol/L dNTPs,3.00 U Taq酶。经验证,该体系获得的扩增产物清晰稳定;应用该体系从40条SCoT引物筛选出8条多态性好,且适合雷公笋扩增的引物,多态性条带占62.64%。[结论]该研究为使用SCoT分子标记技术对雷公笋开展深入研究提供了重要的理论基础和技术支持。

水稻RAPD反应体系的正交优化

以焦旱1号总DNA为材料,首先对影响RAPD-PCR反应的模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶浓度等因素进行了初步优化,分析了各因素对RAPD-PCR扩增结果的影响。在此基础上对影响RAPD-PCR反应的Mg2+、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶浓度等4个主要因素进行正交优化,研究结果表明:在25μlRAPD-PCR反应体系中,模板DNA20ng;Mg2+浓度1.5mmol/L;dNTP的浓度0.2mmol/L;引物量15pmol;TaqDNA聚合酶1.0U。在此最佳条件下,利用引物B8对18个北方粳稻品种进行了成功的扩增。

松材线虫RAPD-PCR反应体系的优化与分子鉴定标记的筛选

应用随机引物S344、S356和S360比较分析了PCR热循环复性温度、Mg^2＋浓度和模板浓度对松材线虫基因组DNA的RAPD扩增结果的影响，旨在建立松材线虫的最佳反应体系，并以此进行松材线虫的分子鉴定标记筛选。结果表明：37℃的复性温度、3．0mmol·L^-1Mg^2＋、10μL反应体系中松材线虫基因组DNA模板1～25ng是研究松材线虫RAPD特征的最佳反应体系。利用此反应体系，通过对100个随机引物的分析，获得了3条松材线虫区别于拟松材线虫的分子鉴定标记。

甜瓜DAMD反应体系优化及指纹图谱分析

以甜瓜DNA为模板,以小卫星DNA YNZ22核心序列为引物,在甜瓜上建立了DAMD的优化反应体系,并用该优化体系分析了28份甜瓜的遗传多样性,开发了一种揭示甜瓜种质间遗传差异的新型分子标记.

葛根SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

【目的】优化葛根SCoT-PCR反应体系,筛选适用于葛根的SCoT引物,为利用SCoT分子标记进行葛根种质资源鉴定、遗传多样性分析及分子标记辅助育种提供技术支持。【方法】采用正交设计对SCoT-PCR反应体系中的DNA模板量、dNTPs浓度、Mg^(2+)浓度、Taq DNA聚合酶量和引物浓度5个因素进行优化,利用最佳SCoT-PCR反应体系筛选出适用于葛根的SCoT引物,并对该体系进行验证。【结果】最佳葛根SCoT-PCR反应体系20.00μL:DNA模板50.00 ng,dNTPs 0.25 mmol/L,Mg^(2+)1.50 mmol/L,引物0.80μmol/L,Taq DNA聚合酶0.50 U。利用该体系从36条SCoT引物中筛选出35条可从葛根中扩增出清晰条带的引物。使用3条引物对18个葛根材料进行PCR扩增,PCR产物表现出良好的重复性、稳定性和丰富的多态性。【结论】建立的最佳葛根SCoT-PCR反应体系和筛选获得的35条SCoT引物可适用于葛根种质资种鉴定、遗传多样性分析、相关分子标记开发等研究。

菊花SRAP-PCR反应体系的优化与确立

采用L16(45)正交实验设计,对SRAP-PCR反应体系中Mg2+、dNTPs和引物浓度以及TaqDNA聚合酶和模板DNA用量等5个因素进行了优化,并确立了适合菊花〔Dendranthema×grandiflorum (Ramat.) Kitamura〕SRAP-PCR的反应体系。菊花的SRAP-PCR最佳反应体系为:反应体系总体积20μL,含3.125 mmol.L-1Mg2+、187.5μmol.L-1dNTPs、10.0μmol.L-1引物、50 ng模板DNA、0.5 UTaqDNA聚合酶及1×PCR buffer。各因素对菊花基因组DNA SRAP-PCR扩增结果的影响程度不同,其中dNTPs浓度影响最大,TaqDNA聚合酶用量的影响最小。运用菊花品种‘奥运含笑’和‘雨花落英’及二者的F1杂交后代单株的基因组DNA对优化的SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,表明所确立的菊花SRAP-PCR反应体系稳定可靠。

荷花SRAP-PCR反应体系的优化与确立

以荷花(Nelumbo nucifera Gaertn)品种‘新红’叶片为材料,采用L16(45)正交试验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物和模板DNA用量5因素进行了优化,并确立了适用于荷花SRAP-PCR的最佳反应体系。结果表明:荷花的SRAP-PCR最佳反应体系为:反应总体积10μL,包含2.0 mmol.L-1 Mg2+、300μmol.L-1 dNTPs、0.5 UTaqDNA聚合酶、4μmol.L-1上下游引物、50 ng DNA及10×PCR Buffer。各因素水平变化对反应体系影响由大到小依次为:TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物、dNTPs、DNA。用48个荷花品种对优化的SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得了条带清晰、多态性丰富的扩增图谱,证实了该体系的稳定性和适应性。

月季ISSR反应体系的优化

以萨曼莎月季为材料,对影响ISSR-PCR扩增的主要影响因子进行了优化,建立了适于月季的ISSR反应体系:25μl反应体积中,1×Buffer、1.5 mmol/L Mg2+、1 U Taq DNA聚合酶、0.6μmol/L引物、0.48 mmol/LdNTPs、20 ng模板DNA;并将该优化体系应用于其他5个ISSR引物和6个月季品种,证实了该体系的适用性和稳定性。

博白大果油茶ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以博白大果油茶Camellia gigantocarpa Hu et Huang为材料,通过单因素实验设计和正交设计L18(35)对影响PCR反应体系的主要成分及PCR扩增程序进行优化。建立了稳定的、可重复的博白大果油茶ISSR-PCR扩增反应体系。在20μL的反应体系中,Mg2+浓度为2.5mmol/L,模板DNA用量为20ng,Taq DNA聚合酶为1.75U,dNTPs浓度为0.25mmol/L,引物浓度为0.6mmol/L。反应程序为:94℃预变性4min,94℃变性30s,50℃退火45s,72℃延伸90s,35个循环,72℃延伸7min,4℃保存。

甘菊cDNA-AFLP反应体系的优化

以甘菊为试验材料,研究了影响cDNA-AFLP反应体系的几个关键因素,建立了适宜甘菊的cDNA-AFLP分析体系,并得到了清晰可辨的cDNA-AFLP指纹图谱。结果表明:适用于甘菊叶片总RNA提取的方法为改进的Trizol法;酶切连接采用一步法,dscDNA酶切用量为300ng,酶切连接时间为8h;PCR选择性扩增反应时,反应体系中最佳组合为:引物浓度0.4mM、Mg2+浓度1.25mM、Taq酶浓度0.9U、dNTP浓度0.3mM。

果梅ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以果梅品种桃梅为试材，通过单因子试验分别研究了DNA模板浓度、引物浓度、Mg^2＋浓度、dNTPs浓度、退火温度及循环数等对果梅ISSR-PCR反应的影响．建立了果梅ISSR-PCR的最佳反应体系：20μL反应体系中含10×buffer2μL，2．5mmol／LMgCl2，0．2mmol／LdNTPs，0．32μmol／L引物，20～80ng模板DNA，1UTaq DNA聚合酶．利用优化的反应体系，对19个果梅品种进行体系稳定性检测，结果表明该反应体系的重复性和稳定性良好．

银杏ISSR-PCR扩增反应体系的建立与优化

目的:为了对银杏进行分子鉴定和遗传关系的分析,建立银杏ISSR-PCR的最佳扩增反应体系。方法:采用正交设计和单因素梯度实验,对影响ISSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、dNTP、引物、模板DNA及Taq DNA聚合酶)进行筛选及优化。结果:银杏25μL ISSR最佳扩增反应体系包含10×Taq反应缓冲液、2.5 mmol/L MgCl2、0.45 mmol/L dNTP、1.2μmol/L引物(UBC861)、10 ng模板DNA及0.9 U Taq DNA聚合酶,使用此ISSR扩增反应体系,获得了10株不同性别银杏DNA的清晰条带,验证了该体系的稳定性。结论:优化的反应体系为采用ISSR分子标记技术对银杏进行遗传多样性分析、遗传育种和转基因等研究奠定了一定的理论基础。

樟树ISSR-PCR反应体系优化研究

以樟树基因组DNA为材料,分析了影响樟树ISSR-PCR的主要参数,确立了适用于樟树的ISSR反应体系和扩增条件。结果表明获得清晰、重复性高的樟树ISSR-PCR扩增条件为:20μL PCR反应体积中,1×PCR Buffer(10 mmol.L-1Tris.HCl,pH8.3,50 mmo.lL-1KCl),2.0 mmo.lL-1MgCl2,200μmol.L-1dNTPs,50 ng模板DNA,200 nmo.lL-1引物,0.5 UTaq DNA聚合酶。在扩增过程中,引物的适宜退火温度比其Tm值平均高3℃。这为今后利用ISSR标记技术开展樟树种间遗传多样性分析提供参考。

水稻TRAP-PCR反应体系优化与P-糖蛋白基因片段的分析

对影响TRAP-PCR反应体系的各参数,包括模板DNA、dNTP、TaqDNA聚合酶和引物浓度进行了优化,建立了适合水稻的稳定,可重复的TRAP-PCR反应体系。在20μLPCR反应体系中,含80ng模板DNA,0.25mmol/LdNTP,0.75UTaqDNA聚合酶,5ng/μL随机引物和7.5ng/μL特异引物。本研究对P-糖蛋白基因片段进行了克隆并序列分析,为深一步研究奠定了基础。

菊花SSR-PCR反应体系的建立和优化

为快速确定菊花SSR反应体系,利用正交实验设计L16(45)对菊花基因组SSR-PCR反应体系的5个因素(模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq酶)在4个水平上进行正交设计,筛选出适合菊花的最佳SSR-PCR反应体系,进一步利用单因素完全随机试验筛选各反应因素的最佳水平。结果表明:建立菊花基因组DNA SSR-PCR反应体系为25μL:60ng模板DNA、2.0mmol/L Mg2+、0.1mmol/L dNTP、0.3μmol/L引物、1UTaq酶。并对菊花引物进行梯度退火试验,其最佳退火温度在53.1℃;扩增程序是:95℃预变性5min;32个循环的94℃变性50s、53.1℃退火50s、72℃延伸50s;72℃延伸8min,4℃保存。该体系的建立为今后菊花SSR分析奠定了基础。

广西壮瑶药瘤果紫玉盘SCoT-PCR反应体系建立及引物筛选

【目的】建立瘤果紫玉盘SCoT-PCR最佳反应体系,并筛选出适宜的SCoT引物,为瘤果紫玉盘种质鉴定分类、亲缘关系分析和遗传多样性分析提供理论参考。【方法】以广西河池、百色、柳州、南宁4份瘤果紫玉盘野生种质为试材,通过单因素试验和正交试验对瘤果紫玉盘SCoT-PCR反应体系的DNA模板用量、引物用量和Mix预混液用量3个因素进行优化,并使用优化后最佳反应体系进行SCoT引物筛选。最后将SCoT-PCR最佳反应体系和筛选出的引物用于瘤果紫玉盘种质的遗传多样性分析。【结果】单因素试验结果显示,DNA模板用量为40~70 ng,引物(10μmoL/L)用量为1.0~1.4μL,Mix预混液用量为9.0~12.0μL范围内扩增效果较好,通过L16(43)正交试验确定瘤果紫玉盘的SCoT-PCR最佳反应体系20.0μL:DNA模板(40 ng/μL)1.0μL,引物(10μmoL/L)1.2μL,Mix预混液10.0μL,7.8μL ddH2O。利用最佳反应体系筛选出26条适用于瘤果紫玉盘的SCoT引物,并确定了各引物最适的退火温度。26条SCoT引物在4份瘤果紫玉盘材料中共扩增出305个基因位点,其中多态性位点204个,多态性比率为66.89%,平均每条引物扩增出11.7个基因位点,有8.7个多态性位点。4份瘤果紫玉盘种质的平均等位基因数(Na)为1.7377,平均有效等位基因数(Ne)为1.5344,Nei’s基因多样性指数(H′)为0.3053,Shannon指数(I)为0.4449。4份瘤果紫玉盘间的遗传相似系数为0.5443~0.6492,遗传距离为0.4320~0.6083,说明4份瘤果紫玉盘种质间存在较大的遗传变异,遗传多样性水平较高。【结论】建立的SCoT-PCR最佳反应体系和筛选出的26条SCoT标记引物扩增效果较好,可用于瘤果紫玉盘种质资源的鉴定分类、亲缘关系分析和遗传多样性分析。

早熟马铃薯ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为得出马铃薯ISSR-PCR最佳的反应体系,采用正交试验设计,对r Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、d NTPs和引物进行5因素4水平筛选。结果表明,马铃薯ISSR-PCR的最佳反应体系为:总体积25μL的反应体系中含有r Taq DNA聚合酶0.5 U、Mg2+浓度为2.5 mmol/L、模板DNA用量为75 ng、d NTPs浓度为200μmol/L、引物浓度为0.8μmol/L。这些因素对PCR反应的影响大小顺序为Mg2+浓度>r Taq DNA聚合酶用量>d NTPs浓度=引物浓度>模板DNA用量。应用该最佳反应体系对39条ISSR引物进行筛选,得出15条条带清晰、条带数多、重复性好的引物。并通过退火温度梯度试验得出筛选引物的最佳退火温度。

真藓科植物ISSR-PCR反应体系的优化及ISSR指纹图谱的初步构建

[目的]试图通过ISSR指纹图谱的构建,为真藓科(Bryacae)植物的种类鉴定提供分子分析数据。[方法]为获得标准试验程序,首先利用正交试验设计的方法对真藓科植物的ISSR-PCR反应的5因素(Mg2+、dNTPs、引物、DNA模板、Taq DNA聚合酶)4水平进行试验。[结果]最适扩增条件是:在20μl PCR反应体系中,5 ng模板DNA,0.2μmol/L引物,2.25 mmol/L MgCl2,0.6 U Taq DNA聚合酶,进行PCR扩增,共扩增出86条带,多态性带为86条,多态率达100%。根据扩增结果进行NJ聚类分析,得到的支序图呈星状。[结论]ISSR指纹能够在种级分类水平提供适度的多态性,利用引物UBC808、811以及826构建的ISSR指纹图谱能够区分所有供试植物,为利用ISSR指纹技术解决真藓科植物种级水平分类关系问题时提供了分子辅助证据的可行性。

桦剥管菌SRAP分子标记反应体系优化与遗传多样性分析

桦剥管菌Piptoporus betulinus作为一种褐腐真菌,是白桦木材的专性腐朽菌,在工业污染物降解和医药领域中起着重要作用。以桦剥管菌为材料,在SRAP-PCR体系优化的基础上,对来自东北主要林区(带岭、塔河、帽儿山以及敦化)不同种群的桦剥管菌进行遗传多样性分析,为桦剥管菌多态性鉴定以及进一步利用提供理论依据。结果表明:用单因素法及均匀设计法优化后的SRAP-PCR体系为10×Buffer 2.0μL、Primer各8μmol/L、dNTP 16 mmol/L、Taq polymerase 2.5 U、DNA 12 ng、Mg^(2+)45 mmol/L,总体积20μL;利用优化的反应体系筛选出15对引物,并扩增出239条清晰的条带,其中237条为多态性条带,多态性比率为99.16%;采用POPGENE软件分析,4个种群的平均有效等位基因平均数、平均Nei’s多样性指数、平均Shannon多样性指数分别为1.499 5、0.303 0、0.465 5;系统聚类结果显示,15个菌株分成了两个类群,这一结果表明来自同一地点菌株的遗传背景较为相似,揭示了桦剥管菌菌株间遗传特性与地理分布间的相互关系。

牛血清白蛋白对连香树PCR反应体系的优化

[目的]为了取得更好的PCR扩增效果,建立高效的PCR反应体系。[方法]首先通过6因素5水平的正交试验对连香树RAPD-PCR反应体系优化组合,然后不再改变该结果中的其他条件,而仅改变Taq酶的浓度及在反应体系中加入不同浓度的牛血清白蛋白(BSA)。[结果]在25组Taq酶和BSA浓度组合中,BSA改善连香树RAPD-PCR反应的最佳浓度为0.6μg/μl,Taq酶浓度可由1.0μg/μl减少至0.4μg/μl。最后优化得到的20.0μl连香树RAPD反应体系为:25mmol/LMg2+2.0μl,dNTPs0.4μl,1U的TaqDNA酶1.0μl,10×Buffer缓冲液2.5μl,0.5OD引物0.8μl,约25ng模板0.6μl。[结论]BSA的适当加入减少了Taq酶的用量,在保证更好的试验效果前提下,节约了试验成本。