麻杏石甘汤对A型流感病毒感染的犬肾传代细胞凋亡的影响

目的:探讨麻杏石甘汤对A型流感病毒感染的犬肾传代(MDCK)细胞凋亡的影响。方法:运用原位末端标记技术和流式细胞术分别检测最大无毒限量的麻杏石甘汤对A型流感病毒感染的MDCK细胞凋亡百分率与细胞周期变化的影响。结果:麻杏石甘汤能显著降低A型流感病毒感染的MDCK细胞的凋亡百分率,下调其G1/G0期细胞比例,上调其S期、G2/M期细胞比例以及细胞增殖指数(PI)值。结论:麻杏石甘汤通过调整流感病毒感染的MDCK细胞的细胞周期,降低细胞凋亡百分率而发挥抗流感病毒作用。

狐脑炎犬肾传代细胞弱毒苗的研制和应用

采用A 72细胞复壮CAV—2弱毒、CK细胞培养病毒的方法,成功地研制出狐脑炎犬肾传代细胞弱毒苗。经安全试验、效力试验、免疫期试验等证明,该苗不仅制造工艺简单、纯度高、安全可靠,而且免疫原性好、免疫期长,能有效地预防狐脑炎。

肾综合征出血热Vero传代细胞疫苗的研究

目的 研究肾综合征出血热 (HFRS)Vero传代细胞疫苗。方法 将HFRS双价沙鼠肾细胞灭活疫苗的生产疫苗株Z10 (Ⅰ型 )、Z3 7(Ⅱ型 )适应到Vero细胞上进行连续传代 ,并用不同代次的Vero细胞适应株制备Vero传代细胞疫苗。结果 Z10 、Z3 7株感染Vero细胞后第 1代即可达到较高病毒滴度 ,并且在Vero细胞中持续传代适应 ,病毒滴度分别维持在 6.2 5～ 6.75和 6.5 0～ 7.0 0logTCID50 /ml之间 ,较为稳定。用不同代次的Vero细胞适应株制备而成的HFRSVero细胞灭活疫苗抗原效价和疫苗的病毒滴度有较大提高 ,反向间接血凝效价从Z10 Cp1Vero细胞疫苗的阴性上升到Z10 Cp10 Vero细胞疫苗的 1∶64 ,从Z3 7Cp1Vero细胞疫苗的 1∶2上升到Z3 7Cp10 Vero细胞疫苗的 1∶64 ;疫苗病毒滴度(logTCID50 /ml)从Z10 Cp1Vero细胞疫苗的 4.2 5上升到Z10 Cp10 Vero细胞疫苗的 6.5 0 ,从Z3 7Cp1Vero细胞疫苗的 6.2 5上升到Z3 7Cp10 Vero细胞疫苗的 7.5 0。疫苗在抗原量和病毒滴度上基本符合中国生物制品的要求。结论 HFRSVero传代细胞疫苗的生产 ,疫苗株在Vero细胞中的连续传代适应起关键性作用。

犬肾（DK）传代细胞中霉形体的分离与鉴定

取经电镜观察证实有霉形体污染的ＤＫ传代细胞，分别接种于霉形体检验用液体、半流体和固体培养基，证明为霉形体混合感染，即该培养物在液体培养基和半流体培养基上，同时显示出水解精氨酸和发酵葡萄糖２种特性，前者使培养基ｐＨ上升，后者使ｐＨ下降。通过反复挑选单个菌落进行克隆传代和有目的地加入单一种属的霉形体抗血清的方法，将混合的２株霉形体纯化分开。经鉴定，一株为精氨酸霉形体，一株为莱氏无（需）胆甾醇霉形体。

甲型流感病毒H3N2诱导狗肾传代细胞凋亡的研究

目的探讨甲型流感病毒对体外培养的狗肾传代细胞系(MDCK)的凋亡诱导作用。方法用不同血凝单位的甲型流感病毒感染MDCK细胞,经HE染色、琼脂糖凝胶电泳以及流式细胞术等方法检测凋亡情况。结果甲型流感病毒感染MDCK后,在细胞形态上呈现凋亡特有变化;电泳出现典型梯状条带;AnnexinV染色流式细胞仪检测出在一定范围内,细胞凋亡率与病毒的浓度呈正相关。结论甲型流感病毒能够诱导体外培养的MDCK细胞凋亡,且在一定范围内,细胞凋亡率与病毒的浓度呈正相关。

犬肾传代细胞与犬肺巨噬细胞杂合体的获得与鉴定

通过细胞融合技术获得了１３个犬肾传代细胞（ＭＤＣＫ）与大肺巨噬细胞（ＤＬＭ）杂合细胞株，其中２株（分别命名为ｋＭＨ—１和ｋＭＨ—２）对犬瘟热病毒（ＣＤＶ）强毒敏感。对ＫＭＨ—１鉴定结果表明该细胞在外观上与亲本细胞ＭＤＣＫ相似，呈现上皮细胞样形态，２５世代细胞在２４～１４４小时之间为对数生长期，群体倍增时间为２３．６小时，染色体众数为７７条，呈现近二倍体样核型。该细胞对ＣＤＶ强毒和弱毒敏感，并产生典型的多核巨细胞样细胞病变（ＣＰＥ），同时也能支持传染性犬肝炎病毒（ＩＣＨＶ）的增殖，产生而萄串样ＣＰＥ，说明杂合细胞ｋＭＨ—１保留了双亲细胞的遗传特性，经传到７８代仍保持低代次细胞特性。

甘草酸单铵对体外培养的兔肾传代细胞的影响

甘草酸单铵对体外培养的兔肾传代细胞的影响刘军，吴一迪，董占双，宋艾芝陈誉华，张福会，苏若萍，宋今丹（基础医学院微生物学教研室）（基础医学院细胞生物学教研室）关键词甘草酸单铵；传代细胞甘草酸单铵（Ｍｏｎｏａｍｍｏｎｉｕｍｇｌｙｃｙｒｈｉｚ－ｉｎａｔｅ，...

犬肾传代细胞HGPRT缺失株的诱变

应用８－氮鸟嘌呤（８－Ａｚａｇｕｉｚｉｎｅ），通过大剂量追加细胞法、剂量递增法和紫外线预先照射交替培养法，共获得９株犬肾传代细胞系（ＭＤＣＫ）抗药细胞（剂量分别为２０ｕｇ／ｍＬ和５０ｕｇ／ｍＬ），经ＨＡＴ系统敏感性试验和６－疏鸟嘌呤抗性鉴定，其中有８株为犬肾传代细胞ＨＧ－ＰＲＴ缺失突变株（ＭＤＣＫ／ＨＧＰＲＴ－）。该突变株细胞Ｇｉｅｍｓａ染色后呈卵圆形，核呈圆形，８３世代细胞（ＭＤＣＫ８３／ＨＧＰＲＴ－）在分种后２４～９６ｈ为细胞分裂的对数生长期，其群体倍增时间为１８．７ｈ，细胞染色体众数为７９条，呈现近二倍体核型，该细胞对ＩＣＨＶ的ＴＣＩＤ５０为１０４．９／ｍＬ。这些指标与诱变前细胞相似。

非洲绿猴肾细胞传代培养中细胞消化液的优化试验

通过比较0.25%胰蛋白酶和改良的细胞消化液(0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶)对非洲绿猴肾(Vero)传代细胞系的消化分散效果,确定最适合实际生产需要的细胞消化液。结果表明,用改良的细胞消化液消化Vero传代细胞系,消化时间短,消化效果好,优于0.25%胰蛋白酶的消化效果。

培养液中铜水平对PK15细胞内铜离子浓度与CuZn-SOD活性的影响

在 PK15细胞无血清液体培养基中添加 0、7.8、15 .6、31.2、6 2 .5 μmol/L Cu,观察了培养液中不同铜水平对PK15细胞内铜离子浓度和 Cu Zn- SOD活性的影响及二者的相关性。结果表明 ,PK15细胞内铜离子浓度及 Cu Zn-SOD活性均随培养液中添加铜离子浓度升高和培养时间的延长而有不同程度的升高 ,其中以添加 Cu31.2 μmol/L组最高 (P<0 .0 5 )。PK15细胞内 Cu Zn- SOD活性与细胞内铜离子浓度和培养时间呈强正相关 (培养时间 :r=0 .873～0 .980 ,P<0 .0 5 ;铜离子浓度 :r=0 .90 0～ 0 .972 ,P<0 .0 5 )

不同培养基对PK15细胞增殖影响的研究

采用无血清液体培养基、DMEM培养基和MEM培养基进行PK15细胞的培养,观察细胞增殖及传代效果,确定无血清液体培养基的营养功能。结果表明:无血清液体培养基只能维持第一代细胞的生长,不能用于第二代后的培养,效果不如DMEM、MEM培养基,且差异显著。

H1N1流感病毒在微载体培养MDCK细胞上增殖的研究

目的探索MDCK细胞在微载体上的培养条件,并研究H1N1型流感病毒在MDCK细胞上的增殖条件。方法在微载体上培养好MDCK细胞上用H1N1型流感病毒在不同的病毒感染复数(MOI)、胰酶浓度两个关键的病毒增殖条件进行流感病毒在细胞上的增殖研究。结果微载体质量浓度为6 g/L时,MDCK细胞培养密度可以达到4.5×106cells/mL。在MOI为0.05接种流感病毒,胰酶质量浓度4μg/mL,流感病毒在MDCK细胞上可获得较高的滴度。结论 MDCK细胞用微载体培养可以达到较高的细胞密度,可以作为规模化生产新型流感病毒疫苗的主要细胞基质进行进一步的研究。

疏风宣肺解毒汤抗甲1型流感病毒诱导细胞凋亡的研究

目的探讨疏风宣肺解毒汤对甲1型流感病毒感染的犬肾传代细胞凋亡的影响。方法将犬肾传代细胞分为六组:正常细胞对照组、病毒对照组、疏风宣肺解毒汤治疗组、疏风宣肺解毒汤对照组、奥司他韦治疗组、奥司他韦对照组,含药组均加入相应的最大无毒限量药液,Annexin V和PI双染用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测定细胞凋亡的百分率。结果疏风宣肺解毒汤治疗组和奥司他韦治疗组的凋亡率显著低于病毒对照组(P<0.01),而高于其药物对照组(P<0.01);疏风宣肺解毒汤对甲1流感病毒诱导的细胞凋亡的抑制率(IR)为67.07%,奥司他韦为76.36%。结论疏风宣肺解毒汤可抵抗甲1型流感病毒诱导的细胞凋亡,作用与奥司他韦相近。

竞争性RT-PCR检测铜对Ctr1 mRNA表达的影响

为了应用竞争 RT- PCR法检测铜对猪传代肾细胞 (PK15 )中特异性铜转运蛋白 Ctr1基因 m RNA表达水平的影响 ,经 2次克隆 ,将筛选出一段 4 0 0 bp的核苷酸序列 ,插入 RT- PCR扩增出的 5 30 bp Ctr1目的片段中 ,构建了插入突变型 Ctr1- c DNA竞争模板。再将竞争模板与各试验组 c DNA同时进行 PCR扩增。结果 ,猪肾 PK15细胞 Ctr1基因m RNA表达量在 7.8～ 31.2 μmol/ L Cu范围内随铜添加浓度的升高减少 ,当铜添加浓度达到 6 2 .5 μmol/ L 时 ,其表达量又有所回升 ,呈双相反应。

应用复合PCR法检测猪圆环病毒

根据基因库中猪圆环病毒 (PCV)的基因序列设计引物 ,建立复合PCR方法 ,对 2株PK 15细胞进行了PCV检测。结果 2株PK 15细胞都可扩增出PCV 1的基因片段 ,其中 1株还扩增得到了PCV 2的DNA片段。由此可见 ,应用设计的引物进行复合PCR快速检测PCV是可行的 ,这为PCV的检测。

一株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及其致病性研究

应用Vero细胞对江苏省某猪场腹泻病料进行病毒分离,通过细胞病变观察、RT-PCR扩增、动物回归试验对病毒进行鉴定,通过半数致死量测定病毒的致病性。结果显示,成功分离到1株猪流行性腹泻病毒(PEDV),命名为PEDV JS14株。该毒株在Vero细胞上盲传至4代出现细胞病变,主要表现为细胞面粗糙、颗粒增多,细胞多核呈空斑样,细胞脱落等病变特征;分离株口服感染5头7日龄仔猪全部出现典型的临床症状,其中4头死亡。F6代培养物以不同滴度口服接种15头7日龄的仔猪,其半数致死量为105.0 TCID 50/mL。结果表明,本次分离的PEDV为强毒株,为进一步的生物学特性研究奠定了基础。

羧甲基茯苓多糖钠体外抗单纯疱疹病毒I型的作用

目的观察羧甲基茯苓多糖钠体外抗单纯疱疹病毒I型(HSV-I)的作用。方法采用细胞病变抑制试验法,观察羧甲基茯苓多糖钠对因感染HSV-I而引起的猪肾传代细胞病变的保护作用。结果在感染10和100TCID50(半数细胞培养感染量)的HSV-I情况下,羧甲基茯苓多糖钠(2.0mg/mL)对HSV-I的致猪肾传代细胞的细胞病变(CPE)具有抑制作用,在感染HSV-I10TCID50的情况下,羧甲基茯苓多糖钠的ID50为0.5mg/mL。结论羧甲基茯苓多糖钠在体外有抗HSV-I作用。

羌银解热汤治疗流行性感冒的基础研究

目的:研究羌银解热汤对小鼠感染甲1型流感病毒FM1株的抑制作用和对小鼠的保护作用;观察羌银解热汤对感染H3N2型人流感病毒的狗肾传代细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)的保护作用以及该汤药对H3N2型人流感病毒的直接灭活作用。方法:利用甲1型流感病毒FM1株感染小鼠为动物模型,观察羌银解热汤在小鼠体内的抗流感病毒作用,并与银翘散汤剂、荆防败毒散汤剂作以对比。用H3N2型人流感病毒感染体外培养成单层生长的MDCK细胞,观察羌银解热汤体外抗流感病毒的作用。结果:羌银解热汤可以有效抑制病毒引起的小鼠肺部病变、降低肺指数(P<0.05),改善小鼠组织病理变化,提高对感染流感病毒小鼠的死亡保护率(P<0.05),降低流感病毒诱导的血清干扰素IFN-α水平,其效果优于银翘散汤剂、荆防败毒散汤剂。体外实验显示羌银解热汤对H3N2型人流感病毒并无直接灭活作用,对MDCK细胞的保护作用并不明显。结论:实验结果表明羌银解热汤具有良好的体内抗流感病毒感染作用,其作用机理不能用该汤药的直接灭活流感病毒来解释。

芳香化浊液对流感病毒FM1株体外抑制作用实验研究

目的:观察芳香化浊液体外抑制甲1型流感病毒FM1株的作用。方法:通过在细胞培养液中加入不同浓度的芳香化浊液,并设置阳性药物、正常细胞对照,观察细胞不出现病变的最小稀释浓度作为该药的无毒界限。接种甲1型流感病毒FM1株于狗肾传代细胞(MDCK),采用细胞病变抑制法观察不同浓度的芳香化浊液体外抑制甲1型流感病毒FM1株的作用。结果:芳香化浊液的最大无毒浓度为1∶16000,细胞病变抑制法检测结果显示:芳香化浊液在最小无毒浓度1∶64000时可表现为对甲1型流感病毒FM1株的完全抑制作用。结论:芳香化浊液体外能明显抑制甲1型流感病毒FM1株,且有效治疗浓度无细胞毒性。

犬疱疹病毒的分离鉴定

犬疱疹病毒引起１周龄以下仔犬严重和高死亡的疾病，用犬肾传代细胞ＭＤＣＫ，从濒死发病犬的肾脏器官分离获得一株疱疹病毒，经鉴定为犬疱疹病毒。培养液观察病毒大小为１４０ｎｍ有囊膜病毒，核酸型为ＤＮＡ，对乙醚敏感，对热抵抗力弱，５６℃经４分钟灭活，ｐＨ４．５时３０分钟失去感染力，用分离毒接种７日龄的幼犬引起典型的疱疹病毒感染症状，并从人工感染试验的幼犬回收到病毒。