一株麻鸡传染性法氏囊病毒新型变异株的分离鉴定

近几年,鸡传染性法氏囊病毒新型变异株在我国广泛流行,主要发生于肉鸡,其致病力弱、隐蔽性强但能造成法氏囊严重萎缩。本研究从山东济宁地区临床出现法氏囊萎缩的发病麻鸡中采集法氏囊病料,接种SPF鸡胚进行病毒分离,通过RT-PCR方法进行病毒鉴定,将分离毒株回归SPF鸡进行致病性试验,同时对其主要抗原基因VP2进行进化分析。结果发现,该毒株能致死鸡胚;对其VP2基因进行测序比对和进化树分析发现,其与近几年的新型变异株基因序列的进化关系较近,同源性为96.1%~99.2%;人工感染SPF鸡第7 d法氏囊即出现较为明显的萎缩,第14 d萎缩更为明显,囊体比显著小于对照组(P<0.01)。本研究分离到的麻鸡源传染性法氏囊病毒JN22株属于新型变异株,能导致SPF鸡法氏囊显著萎缩。

鸡传染性法氏囊病毒变异株的分离鉴定与致病性研究

为了分析和研究扬州地区某养殖场中鸡传染性法氏囊病毒变异株的致病性,本文选取发生鸡传染性法氏囊病的30只病鸡作为研究对象,采集病料组织,进行病毒分离鉴定和致病性研究。病鸡呈典型的临床病理症状,RT-PCR检测的琼脂糖凝胶电泳显示有一条大小为709 bp的特异性电泳条带,测序比对分析发现该鸡群中存在两种类型的变异病毒株,分别命名为IBDVYZ-1和IBDVYZ-2。琼脂扩散试验显示IBDV阳性对照毒株(BC6/85)、分离毒株IBDVYZ-1、分离毒株IBDVYZ-2三株病毒株的琼脂板样品孔均出现了明显的白色沉淀线,阴性对照却未见任何明显的沉淀线。IBDVYZ-1病毒株的ELD50为105.5/0.2 mL,IBDVYZ-2病毒株的ELD50为106.5/0.2 mL,IBDV阳性对照毒株(BC6/85)的ELD50为106.0/0.2 mL。人工接种感染SPF鸡14 d后,IBDVYZ-1病毒株的致死率为70.0%(7/10),IBDVYZ-2病毒株的致死率为100.0%(10/10),IBDV阳性对照毒株(BC6/85)的致死率为90.0%(9/10)。本研究成功分离鉴定出鸡传染性法氏囊病毒变异株,并在致病性方面展开了研究,这为今后江苏扬州地区的鸡传染性法氏囊病的科学有效防治提供参考价值。

传染性法氏囊病毒新型变异株荧光定量RT-PCR检测方法的建立

传染性法氏囊病病毒新型变异株(Novel variant Infectious bursal disease virus,nVarIBDV)给我国养禽业防控法氏囊带来更大的挑战。目前缺乏快速、灵敏的针对nVarIBDV的检测方法。为解决这一问题,该试验根据已发表的nVarIBD的VP2基因序列,设计了一对引物和一条特异性Taq Man探针,建立了一种nVarIBD的Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法,该方法可通过特异性扩增nVarIBD VP2基因来确定样品是否为IBDV新型变异株。通过构建重组质粒pMD18-T-VP2对引物和探针进行灵敏性和重复性试验,以及特异性检测,最后使用该检测方法对临床样品进行验证。荧光定量RT-PCR结果显示灵敏性可达1.32×10^(1)copies/μL,高于常规RT-PCR的100倍。批内和批间重复试验变异系数(CV)均小于0.5%,结果表明该检测方法有良好的重复性与稳定性。该方法与常见禽病毒核酸无交叉反应,说明检测方法具有较好的特异性。综合本研究结果表明,该研究建立的nVarIBD荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好,可用于临床样品中IBDV新型变异株的监测。

一株鸡传染性法氏囊病毒变异株的鉴定与致病性

近日,在福建省南平市某鸡场发现一株新的鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)流行株,并将其命名为IBDV-FJ02.为了明晰IBDV-FJ02株遗传变异情况和临床致病特征,进行了A节段基因组序列和特征性氨基酸位点的分析、基于A节段和B节段的新型基因型分类以及对无特定病原体(SPF)鸡致病性的研究,旨在为鸡传染性法氏囊病的防治提供依据.结果显示:IBDV-FJ02株A节段核苷酸序列与早期变异株E的同源性最高,达95.6%,与中国变异株SHG558在同一分支上;IBDV-FJ02株VP2-4-3蛋白氨基酸序列第222位氨基酸为T,第249位为K,第318位为D,参考变异株中仅GLS、E与其一致,位点N^(213)、T^(222)、K^(249)、 D^(318)、E^(323)均符合变异株的特征.根据新型基因型分类方案,显示IBDV-FJ02株属于A2dB1基因型,即IBDV新型变异株类群.致病性测定结果显示:IBDV-FJ02株感染3周龄SPF鸡并不会导致感染鸡只死亡,在感染后21 d内,主要引起鸡只法氏囊的严重萎缩和脾脏的轻微肿大.上述结果表明,IBDV-FJ02株是一种IBDV新型变异株,具有明显的IBDV变异株致病特点.

传染性法氏囊病毒VP_2在酵母细胞内的高效表达及其免疫原性研究

应用Pichia酵母表达系统高效表达了传染性法氏囊病毒 (IBDV)VP2 基因片段。首先用OLIGO设计 1对引物P5、P6 ,以插入IBDVVP2 基因的 pUC19为模板 ,扩增出带有终止密码子的 1.5kb片段 ,将此片段正向亚克隆到 pPICZA表达载体上 ,将构建好的载体pPICVP2 用SacI内切酶线性化后 ,转染酵母PichiapastorisGS115细胞 ,经PCR鉴定 ,筛选出 5 0多个重组子。分别用甲醇诱导后 ,经SDS PAGE凝胶电泳、琼脂扩散试验、Dot ELISA检测 ,得到 9个不同程度表达 4 1kuVP2 活性蛋白的阳性重组子。经凝胶薄层扫描仪分析 ,表达蛋白占酵母细胞总蛋白的最高比率为 16 % ,表达量为 0 .6 2 0 8g·L-1。表达产物免疫SPF鸡可诱导产生特异性抗体 ,并能保护鸡抵抗超强毒致死性攻击 ,具有良好的免疫原性。

鸡传染性法氏囊病毒在DF-1细胞系上繁殖特性研究

对鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)HQ株在DF-1细胞上的适应及增殖条件进行了研究,结果表明,HQ株不适应在Vero细胞上生长,而在DF-1细胞上能够很好的适应.经培养条件优化,最终选用pH值为7.0,血清含量体积分数为2%的DMEM/F12培养基做维持液,在细胞传代后第2天接种IBDV HQ株,接毒量为1%(约0.7MOI)后36 h收毒,毒价可达8.5 mL-1以上,是在CEF细胞上培养时毒价的10倍.HQ株在DF-1细胞上培养24～36 h上清液与全悬液毒价基本相同,维持在同一高峰.糖耗的高峰要先于病毒毒价高峰的出现,糖耗在高峰之后快速下降,当降低到接近0时病毒的毒价最高.

鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的原核表达与抗原性分析

目的表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)弱毒株VP2蛋白并检测其抗原活性。方法以IBDV强毒致弱株Gt株基因组RNA为模板,应用RT-PCR方法扩增VP2基因,并将其克隆入pUC18载体,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,将其亚克隆到原核表达载体pET30a中,并经酶切、PCR、测序鉴定,阳性重组表达质粒转化E.coliBL21(DE3)菌,经IPTG诱导后,表达产物用SDS-PAGE及Westernblot检测。结果阳性重组表达质粒转化E.coliBL21(DE3)后,经诱导表达了目的蛋白,表达量占菌体总蛋白的15%。Westernblot检测表达蛋白可与IBDV阳性血清发生反应,而与阴性对照血清不发生反应。结论已成功表达了鸡传染性法氏囊病毒弱毒株VP2蛋白,且具有良好的抗原性。

中药成分对传染性法氏囊病毒感染细胞的影响

将黄芪多糖、当归多糖、蜂胶多糖、淫羊藿多糖、板蓝根多糖、黄芪黄酮、蜂胶黄酮、淫羊藿黄酮、黄芪皂甙、人参皂甙等 1 0种中药成分与鸡传染性法氏囊病毒 (IBDV)以 3种顺序加入到培养 2 4h的鸡胚成纤维细胞 (CEF)中。即先加中药后接种病毒、先接种病毒后加中药、中药和病毒同时加入 ,观察细胞病变的程度 ,以评价它们对IBDV感染细胞的影响。结果表明 ,先加中药后接种病毒和中药与病毒同时加入时 ,多数中药成分处理组在病毒接种后 72h的细胞病变程度明显减轻 ,表明多数中药能抑制病毒感染细胞 ,且有一定的量效和时效关系。

鸡传染性法氏囊病毒JS株毒力测定

35日龄SPF鸡半数致死量(LD50)和9日龄SPF鸡胚半数致死量(ELD50)试验结果显示,传染性法氏囊病毒(IBDV)JS株的LD50为10-3.60.1 mL/只,ELD50为10-5.20.1 mL/胚;1~6周龄SPF鸡及商品鸡的致病性试验结果显示,IBDV JS株对SPF鸡和商品鸡3周龄后的致病率为100%,最高致死率分别为93.75%和75%;应用RT-PCR方法从IBDV JS株中扩增的VP2基因,经序列测定分析结果显示,IBDV JS株的VP2基因与香港HK46、日本OKYM、英国UK661等国际超强毒株的氨基酸序列的同源性达99%以上。表明IBDV JS株为超强毒株。

表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其表达的优化

鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2蛋白是该病毒的主要抗原蛋白,为制备乳酸菌黏膜免疫口服疫苗,本研究采用乳酸乳球菌(L.lactis)及其Nisin诱导的表达系统,对VP2基因进行密码子优化,构建了表达IBDVVP2蛋白的重组乳酸乳球菌L.lactis/p NZ-VP2。经正交试验对诱导条件进行优化,重组VP2蛋白(r VP2)表达量比优化前明显提高,最终得到最佳诱导条件为:OD600nm=0.5开始诱导,Nisin终浓度为2 ng/m L,诱导时间为5 h,r VP2表达量达到最大值38μg/m L。经western blot检测,r VP2能够持续性表达并具有良好的抗原性。该重组乳酸菌的构建为进一步体内免疫实验奠定了基础。

表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建

为构建表达传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(rHVT-VP2),本研究利用RT-PCR方法扩增IBDV的VP2基因构建了重组真核表达质粒pCAGG-VP2,并采用限制性内切酶将携带Pec复合启动子和CMV增强子的VP2基因表达盒(Pec-VP2)切下,连接于Gateway系统入门质粒pENTR构建pENTR-VP2。采用Gateway LR克隆技术将pENTR-VP2与构建的重组粘粒f5354ccdBK+共同参与基因片段互换反应,构建重组粘粒f5354-VP2。f5354-VP2与其他4个相互重叠覆盖HVT全基因组的粘粒经酶切线性化后共同转染CEF细胞,并拯救出重组病毒rHVT-VP2。将重组病毒在CEF细胞中连续传代20次,每隔5代采用PCR、western blot和间接免疫荧光进行检测,结果表明VP2蛋白均得到稳定地表达。rHVT-VP2的构建为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。

新城疫病毒F基因与传染性法氏囊病毒VP0基因在鸡痘病毒中共表达

目的 新城疫病毒（NDV）F基因和传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP0基因在鸡痘病毒中表达,以便研制新城疫和传染性法氏囊多价重组疫苗。方法 利用鸡痘病毒282E4株非必需区TK基因构建的表达载体PU-TA2,在已存在的复合启动子p7.5ATI下游同向插入F基因,反向插入复合启动子P7.5ATI,并在其下游反向插入VP0基因,构建由2个相同的复合启动子在相反方向分别表达F和VP0蛋白的PATI2-F-VP0表达载体。使其与鸡痘病毒282E4株共转染CEF细胞后,用BUDR法筛选重组病毒,通过间接免疫荧光法检测阳性重组病毒。用Western blot法检测F和VP0蛋白。结果 在重组病毒株中,用Western blot法可检测到F和VP0蛋白。结论 已成功地获得可同时表达F蛋白和VP0蛋白的重组鸡痘病毒。

传染性法氏囊病毒的抗原及分子特征(英文)

用鸡胚成纤维细胞对来自野外的5个传染性法氏囊病毒株(IBDV-JD1、JD2、NB、HZ1、HZ2)进行分离,测定理化特性、致病性,同时进行血清亚型测定及A片段基因组的克隆分析.试验所用5个法氏囊组织悬液在鸡胚成纤维细胞盲传2～14代后适应细胞并产生细胞病变.细胞适应的IBDV毒株的理化和形态特征与经典传染性法氏囊病毒株一致.除IBDV-HZ1、HZ2属经典IBDV血清型外,IBDV-JD1、JD2和NB毒株分属不同的血清亚型.人工感染实验结果显示,分离的IBDV毒株产生与野外病例相似的临床症状和病变,出现法氏囊滤泡髓质的淋巴细胞变性、坏死和消失.基因组序列分析显示,IBDV-NB毒株A片段由3 264个核苷酸组成,编码由145个氨基酸残基组成的VP5和由1 012个氨基酸残基组成的多聚蛋白.与来自GenBank的IBDV Ⅰ型毒株比较,NB毒株A片段编码的多聚蛋白与JD1毒株的同源性最高,达99.5%,VP2与JD1、CEF94、D78的同源性为99.8%,VP3与JD1的同源性为99.2%,VP4与JD1的同源性为100%,VP5与JD1,HZ2,P2,CEF94,CT,Cu-1和D78毒株的同源性为99.3%.NB毒株VP2蛋白的第253、280、284位氨基酸残基与IBDV变异毒株和经典毒株一致,但不同于IBDV超强毒株.这些结果暗示IBDV的抗原表位是构象依赖性表位,IBDV血清亚型的形成与IBDV弱毒疫苗病毒株密切相关.

传染性法氏囊病毒HN株的分离鉴定及应用免疫荧光检测IBDV

河南郑州地区某养鸡场的三黄肉鸡出现精神沉郁,拉水样白色粪便,剖检可见法氏囊水肿、出血;肾脏出血肿大,有尿酸盐沉淀,呈花斑状;腿肌、胸肌有出血斑点;腺胃与肌胃交界处出血。经病毒分离、鸡胚接种、琼脂扩散试验和细胞接种试验,最后确诊为传染性法氏囊病。同时,采集病料,制备冰冻切片,建立一种检测病料中的IBDV免疫荧光检测方法。

鸡传染性法氏囊病毒超强毒株的分离及生物学特性鉴定

用SPF鸡及鸡胚 ,从吉林某鸡场病死鸡的法氏囊组织中分离到一株超强毒株 (J20株 )。此病毒不能凝集鸡的红细胞 ,可以被IBDV标准阳性血清检出IBDV抗原。通过对J2001分离毒株进行回归实验 ,测定病毒效价EID50 达106/0.2ml,发病率为100 % ,死亡率达70% ;病毒理化特性试验 ,电镜观察等证实J20株为鸡传染性法氏囊病超强毒株。

传染性法氏囊病毒基因组、蛋白和分子致病机理研究进展

近年来,由于分子生物学技术的发展,传染性法氏囊病(IBD)的得到了较好的控制。但传染性法氏囊病是一种主要传染幼鸡和雏火鸡的急性、高度接触性、杀淋巴细胞性疾病,可引起免疫抑制进而混合感染或继发感染其它传染性疾病。因此,该病仍引起有关学者的关注。该病由传染性法氏囊病毒(IBDV)引起。主要对该病毒的基因、蛋白及其分子致病机理研究的最新进展进行综述。

鸡传染性法氏囊病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立及应用

为快速检测鸡传染性法氏囊病毒,使用纯化的鸡抗IBDV多克隆抗体和鼠抗IBDV单克隆抗体,建立了抗原捕获ELISA检测鸡传染性法氏囊病毒的方法。使用建立的方法可以检测到1∶160倍稀释的IBDV疫苗及阳性法氏囊组织中的病毒。检测禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎病毒及沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎球菌等结果均为阴性。检测IBDV超强毒和疫苗毒人工感染鸡的法氏囊、脾、肝及临床样品78份,检出阳性24份,与RT-PCR检测结果相符率为96%(75/78)。说明建立的方法敏感、特异,可用于法氏囊病的诊断和监测。

三株鸡传染性法氏囊病毒弱毒株的分离与分子鉴定

本试验在江苏省鸡场分离获得3株鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV),采用RT-PCR法扩增VP2基因,将产物克隆入pMD18T载体,经测序,并与IBDV代表株VP2基因的高变区序列进行分析比较。结果显示,3个分离株与超强毒株、强毒株、突变株及弱毒株的核苷酸同源性在89.5(～98.9(之间,与弱毒株Cu-1和疫苗株PBG-98同源性最高,为98.9(;推导出的氨基酸序列与代表性毒株的同源性在98.2(～99.5(之间。其中,七肽区的第三个丝氨酸残基突变为精氨酸或苏氨酸,279和284位氨基酸残基突变为天冬氨酸和苏氨酸,222、294和299位氨基酸残基分别突变为脯氨酸、亮氨酸和天冬氨酸。上述试验表明3株分离株均为临床弱毒株。

乌鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR法,对分离于当地典型发病乌鸡群的IBDV(WJ株)进行了VP2基因的克隆与序列分析,并和相关毒株进行了比较。结果表明,WJ株与标准血清 型STC株的核苷酸和氨基酸的同源性只有91.39%和92.74%,而与超强毒株UK661和从当地鸡群中分离的超强毒株HN01株的核苷酸和氨基酸的同源性则较高,其中,与其核苷酸同源性分别为95.43%和95.87%,与其氨基酸同源性均为96.77%。且该毒株的VP2基因序列完全具备超强毒株的主要特征。由此说明,分离于当地发病乌鸡群的IBDV为超强毒株,并和当地流行的鸡IBD超强毒株有较高的同源性,但也有明显的差异。

鸡传染性法氏囊病毒3个毒株VP2高变区的基因扩增与序列分析

以用疫苗株V -hb和V1免疫后又发病的病鸡法氏囊分离毒株HeB -bdI的基因组RNA为模板 ,利用RT -PCR/Nested -PCR扩增出了cDNA产物。并对其VP2高变区基因序列测定 ,同时测定了V -hb和V1的基因序列。序列分析表明 :HeB -bdI毒株与UK661同源性较高为 98.4% ,而与弱毒株Cu -1、非致病性株PBG98和变异株相差较大 ;而疫苗株V -hb和V1疫苗株与HeB -bdI毒株的同源性较低仅为 93 .1%。