传染性法氏囊病病毒(IBDV)快速检测与分型技术

根据已发表的传染性法氏囊病病毒 (IBDV)核苷酸序列 ,在病毒结构蛋白 VP2编码基因的高变区两端外侧的保守序列内设计合成了 2条寡核苷酸引物 ,对各种不同致病性的 12株参考毒株进行了 RT- PCR检测。结果 :12个参考毒株均能扩增出约 6 79bp的目的片段 ,而对照的 5种鸡源性病原体 NDV、IBV、CAIV、E.coli、PM均未扩增到相应片段 ;对疑似 IBD的 34份临床病料进行检测 ,并同时在其扩增的片段内设计另 1对引物进行 Nested- PCR检测 ,结果基础 RT- PCR检测到 11份阳性 ,Nested- PCR检测到 2 3份阳性 ,后者的检出率大大提高。结果表明 ,建立的 RT- PCR诊断技术具有特异、快捷、敏感的特点。取限制性内切酶 Sac 和 Ssp 以及设计的 2条 vv IBDV(超强毒株 )特异性引物 ,分别应用 v VP2片段 PCR扩增产物的限制性内切酶分析和型特异性引物的 PCR扩增 2种方法 ,对 7个 IBDV分离参考毒株和 2 4个临床样品进行致病性分型。结果 ,确定 2 1株属于 c IBDV(经典毒株 ) ,8株属于 vv IBDV,2株未能确定 ;2种分型方法的结果基本一致 ,均可用于 IBDV的快速分型 ,型特异性引物的

鸡白细胞介素2增强传染性法氏囊病病毒多聚蛋白DNA疫苗免疫原性的研究

鸡白细胞介素 2 (IL 2 )基因是新近被确定的非哺乳类IL 2基因。将鸡白细胞介素 2 (IL 2 )基因和传染性法氏囊病病毒 (IBDV)多聚蛋白基因 (VP2 VP4 VP3 )分别插入真核表达载体pCI的CMV启动子下游 ,制备DNA疫苗 ,免疫 14日龄SPF鸡 ,14d后二免 ,二免后 3d攻击标准强毒株。结果表明共注射鸡IL 2质粒能明显增强DNA疫苗对强毒攻击 ,保护率达 80 % ;能增强DNA疫苗诱导的中和抗体效价 (P <0 0 5 ) ;能显著促进鸡胸腺、脾脏和外周血液T淋巴细胞及法氏囊B淋巴细胞增殖反应 (P <0 0 5 )。这些结果提示鸡IL 2能明显增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫原性 ,是一种优良的禽类DNA疫苗佐剂。

表达传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建

【目的】重组新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景,本研究旨在探讨新城疫病毒作为防制传染性法氏囊病超强毒(very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV)及新城疫重组二联活病毒载体疫苗的可行性。【方法】采用单股负链RNA病毒反向遗传操作技术,救获野生型NDV LaSota疫苗株rLaSota及表达vvIBDV Gx株VP2基因的重组疫苗株rLaSota-VP2,分别经滴鼻点眼途径免疫SPF雏鸡,免疫后21d分别以vvIBDVGx超强毒和新城疫强毒进行攻击。【结果】rLaSota及表达vvIBDV-VP2基因平均鸡胚致死时间均大于120h,脑内致病指数(ICPI)分别为0.4和0.36,静脉内致病指数(IVPI)均为0;接种后72～96h每毫升尿囊液EID50则分别达到109.0以上。rLaSota-VP2以106.0EID50一次免疫7日龄SPF鸡雏,免疫后3周对新城疫强毒致死攻击100%保护,对vvIBDV攻击免疫保护率达90%以上。【结论】重组病毒rLaSota-VP2保持了LaSota亲本疫苗株高滴度的鸡胚生长特性和低致病性及遗传稳定性,免疫雏鸡对新城疫强毒和传染性法氏囊病毒超强毒株的致死均形成有效免疫保护。本研究为研制传染性法氏囊病-新城疫重组二联活载体疫苗奠定了基础。

传染性法氏囊病病毒VP2/4/3-ChIL-2融合基因DNA疫苗免疫原性研究

应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension,SOE),经3次PCR将传染性法氏囊病病毒(infectiousbursal disease virus,IBDV)多聚蛋白(VP2/4/3)基因和鸡白细胞介素2(Chicken IL-2,ChIL-2)基因进行融合,定向插入真核表达载体pCI的CMV启动子下游,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2和pCI-IL-2-VP2/4/3。将其制备成DNA疫苗,肌肉注射14日龄非免疫鸡,2周后加强免疫,定期测定鸡抗IBDV血清ELISA抗体效价及病毒中和抗体效价。加强免疫后3周用IBDV标准强毒株攻击,连续观察3天后全部扑杀,计算保护率及囊体比,并进行组织病理学检查。结果表明:1)融合基因重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3免疫后能明显增强IBDVDNA疫苗对强毒的攻击保护(保护率分别为83.3%、91.6%),显著高于pCI-VP2/4/3单独免疫对照组(58.3%);2)诱导产生的抗IBDV血清ELISA抗体效价明显增高(P<0.05),同时能提高DNA疫苗诱导产生的中和抗体效价(P<0.05);3)能显著促进鸡外周血液T淋巴细胞增殖反应。上述结果提示:IBDV VP2/4/3与ChIL-2基因融合后发挥了相互协同作用,ChIL-2产生了分子免疫佐剂效应;融合基因DNA疫苗能增强IBDV DNA疫苗的免疫原性,促进了机体特异性免疫应答。

传染性法氏囊病病毒DNA疫苗的免疫原性研究

将传染性法氏囊病病毒弱毒株 (IBDV JD1)和强毒株 (IBDV ZJ2 0 0 0 )的基因组A节段全长cDNA、多聚蛋白 (VP2 /VP4/VP3)和主要宿主保护性抗原 (VP2 )基因 ,分别克隆入两种真核表达载体pCI和 pcDNA3,构建成 12种真核表达质粒。将制备的DNA疫苗以 2 0 0 μg的剂量经腿肌和皮下结合途径首免 14日龄SPF鸡 ,2 8日龄以相同的剂量二免 ,二免后 14d攻击IBDV标准强毒BC6 / 85株。结果表明 ,含A节段或多聚蛋白基因的表达载体均能诱导较高水平的中和抗体并能提供对强毒的免疫保护 ,多聚蛋白基因构建成的DNA疫苗与弱毒苗B87的免疫效果相当 ;编码VP2基因的DNA疫苗仅能诱导很低水平的中和抗体 ,几乎不能提供免疫保护 ;以 pCI为表达载体的免疫效果优于pcDNA3;源于ZJ2 0 0 0株基因构建成的DNA疫苗诱导的免疫反应优于JD1株 ,提示DNA疫苗的免疫效果与VP2蛋白的构象、表达载体的调控元件和毒株差异等因素有关。

鸡传染性法氏囊病病毒VP5缺失标记疫苗的生物学特性研究

为评价鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP5缺失病毒株rHLJ0504HT△VP5的生物学特性,本研究首先对该缺失病毒与其亲本病毒rHLJ0504HT(vvIBDV HLJ0504 253/284双位点突变细胞适应病毒)进行了体外复制动力学比较研究。结果表明,VP5缺失病毒复制滴度明显低于亲本病毒(p<0.05)。动物实验结果表明,该缺失病毒可以诱导机体产生良好的免疫应答反应,免疫后10 d,其抗体水平与亲本病毒相当;并能够抵抗同源或异源超强毒的攻击,为免疫鸡提供100%保护。此外,该缺失病毒对免疫鸡无明显的致病性;VP5缺失病毒免疫组与未免疫组禽流感血凝抑制效价相当,不存在明显差异(p>0.05),表明该病毒对免疫鸡无免疫抑制作用,不影响其它疫苗的免疫效果。而且,VP5的缺失可以作为鉴定该缺失病毒的生物学标记。以上结果表明,rHLJ0504HT△VP5是一株安全有效的IBDV标记候选疫苗株。

靶向传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2有效miRNA的筛选

为筛选出能有效抑制传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因复制的miRNA,采用RT-PCR方法从病毒基因组中进行结构蛋白VP2的基因扩增与序列测定,构建融合表达载体pVP2-EGFP。根据VP2测序结果,借助genscript软件设计针对VP2的5条miRNA,分别命名为miVP2A、miVP2B、miVP2C、miVP2D和miVP2E,将合成的5条miRNAs分别插入到pRFPRNAiC中形成miVP2s表达载体,这些载体分别与pVP2-EGFP共转染DF-1细胞系,通过NortheringBlotting方法检测miVP2s的表达,利用荧光共聚焦显微镜定性、流式细胞术定量的方法进行有效miVP2s的筛选。结果显示:miVP2s能成功表达;转染miVP2s表达载体组的绿色荧光蛋白(GFP)强度和数量都明显弱于或少于阴性对照组;miVP2s对VP2的抑制效率为59.7%到78.5%。表明所设计的miRNAs对VP2均有抑制作用,其中miVP2A和miVP2E效果最为显著。

试纸探针条检测鸡传染性法氏囊病疫苗中病毒含量的试验

试纸探针条可识别市售的国产或进口鸡传染性法氏囊病(IBD)代表性疫苗毒株及其鸡胚培养毒或细胞培养毒或其接种鸡的囊毒,并可检出经甲醛灭活的IBD标准强毒、田野囊毒、鸡胚培养毒或细胞培养毒。活的或灭活待检疫苗水溶液中IBDV的含量越高,试纸探针条上阳性线显现越快、颜色越深且明显;在30分钟的结果观察时间内,该条可检出每0.1mL样品中800ELD50或107.0TCID50的病毒含量,该条检测灭活IBDV的效价是AGP测定效价的32倍以上。试纸探针条为估价疫苗中IBDV的含量或疫苗质量提供了一条简便、快速、经济的新途径。

传染性法氏囊病病毒变异株二价弱毒疫苗的研究

选用传染性法氏囊病病毒变异株 JD1、NB、HZ1弱毒株配制成 JN(JD1+NB毒株组成 )和 JH(JD1+HZ1毒株组成 )两种二价弱毒疫苗 .分别在 14日龄首免和 2 8日龄二免 SPF鸡 ,并于一免后 14d、2 1d,二免后 12 d分别用强毒株传染性法氏囊病病毒 (IBDV) BC6 / 85株攻击 ;同时观察疫苗的安全性 .结果表明 JN和 JH疫苗均能诱导 SPF免疫鸡产生优良的免疫应答反应 ,并能使免疫鸡对 IBDV-BC6 / 85株的攻击产生 10 0 %的保护 . JN和 JH疫苗的最佳免疫剂量分别为 6 0 0 0 TCID50 和 10 0 0

鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)病毒含量细胞间接免疫荧光方法的建立

为测定鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)的病毒含量,采用Vero细胞建立鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)病毒含量细胞间接免疫荧光方法,测定细胞半数感染量(TCID50)。通过与传统鸡胚半数致死量(ELD50)方法进行敏感性和相关性比较,间接免疫荧光方法具有更高的敏感性,两种方法的相关系数r为0.823。间接免疫荧光方法的建立为该疫苗的检验提供了一种新途径。

鸡传染性法氏囊病毒 超强毒新型疫苗的研究进展

传染性法氏囊病毒(IBDV)可引起鸡急性、高度接触传染性的免疫抑制性疾病,即传染性法氏囊病(IBD),该病是由Gosegrove(1957年)在美国首次发现的,现已遍及全世界主要养禽地区,给世界养禽业造成了巨大的损失,被国际公认为鸡的三大疫病之一.1962年Gosegrove正式报道了该病在美国特拉华州甘布罗镇的肉鸡群中发生,因此又称'甘布罗病'.

传染性法氏囊病活疫苗对重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1)免疫效果的影响

为评价鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗对重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1)免疫效果的影响,分别对蛋雏鸡和麻花肉雏鸡于14日龄同时接种鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)和重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1),设空白对照组(均不免疫禽流感和传染性法氏囊病疫苗)和免疫对照组(只免疫重组禽流感病毒灭活疫苗),进行法氏囊病理变化观察和血清H5N1亚型禽流感病毒抗体检测。结果显示,鸡传染性法氏囊病活疫苗均可对蛋雏鸡和麻花肉雏鸡引起法氏囊炎性反应,但对重组禽流感病毒灭活疫苗免疫抗体的产生无显著影响。

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其疫苗的研究进展

传染性法氏囊病病毒(IBDV)是鸡传染性法氏囊病(IBD)的病原。近年来IBDV变异毒株和超强毒株的流行,严重威胁着世界养鸡业的发展,传统疫苗已不能控制IBDV的流行,迫切需要研制新型疫苗。IBDV VP2蛋白是重要的结构蛋白,能诱导机体产生中和抗体,因此,利用VP2蛋白制备IBDV重组疫苗成为国内外研究的热点。综述了IBDV VP2蛋白的作用及在不同表达系统中用VP2蛋白制备疫苗的研究进展,以期为IBDV新型疫苗的开发提供参考。

鸡传染性法氏囊病病毒及疫苗的研究进展

鸡传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的急性、高度接触性传染病,主要感染3~6周龄雏鸡。自首次发现以来,它一直是家禽业经济损失的主要原因之一。IBDV具有分段的双链RNA基因组,易发生遗传变异,产生与现有商品化疫苗的抗原性不能完全匹配的流行毒株,从而导致免疫失败。因此迫切需要研发与临床流行毒株相匹配的新型疫苗用于IBD的防控。本文综述了该病毒当前流行病学和疫苗的研究进展,为IBD的防控提供参考。

免疫刺激复合物(ISCOM)介导的传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因免疫的研究

将传染性法氏囊病病毒 (IBDV)ZJ2 0 0 0株的多聚蛋白 (VP2 /VP4/VP3)基因插入 pCI质粒的CMV启动子下游 ,构建了真核表达质粒pCI VP2 /VP4/VP3,在Lipofectin介导下转染Vero细胞进行了多聚蛋白的瞬时表达。以免疫刺激复合物 (ISCOM)为佐剂制备DNA疫苗 ,进行不同免疫剂量间、不同免疫途径间、一次免疫和二次免疫间的效果对比试验。结果表明 :以肌内和皮内联合免疫法效果最好 ,而口服和点眼等途径未能诱导足够的免疫反应 ;大于 2 0 0 μg的剂量DNA疫苗才能产生良好的免疫力 ;二次免疫的效果明显优于一次免疫。与常规的弱毒疫苗B87和D78相比 ,DNA疫苗产生中和抗体的潜伏期长、效价相对较低 ,对强毒攻击的保护率相当。本试验还证实 ,免疫刺激复合物具有明显提高DNA疫苗免疫效果的作用。DNA疫苗能诱导产生保护性反应 ,为今后IBD疫苗的研究开创了一条新的途径。

传染性法氏囊病病毒Ⅰ型变异株的分离鉴定及其多价弱毒苗免疫试验

先后在江苏、浙江、四川等８省（区）从临床患传染性法氏囊病的鸡群中采集法氏囊病料，分离到３２个野毒株，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定，其中１７株病毒为传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ），应用交叉中和试验，将分离毒株分为５个亚型，用ＩＢＤＶⅠ型标准变异株高免血清作中和试验鉴定，其中５个分离毒株有较高中和价，初步定为ＩＢＤＶⅠ型变异株。将其在鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）上连续传代致弱，与标准Ⅰ型弱毒株联合制成多价弱毒疫苗，免疫试验表明多价弱毒疫苗具有良好的免疫效果，免疫组攻毒１００％保护，对照组攻毒死亡率为９２％

新城疫病毒F基因与传染性法氏囊病毒VP0基因在鸡痘病毒中共表达

目的 新城疫病毒（NDV）F基因和传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP0基因在鸡痘病毒中表达,以便研制新城疫和传染性法氏囊多价重组疫苗。方法 利用鸡痘病毒282E4株非必需区TK基因构建的表达载体PU-TA2,在已存在的复合启动子p7.5ATI下游同向插入F基因,反向插入复合启动子P7.5ATI,并在其下游反向插入VP0基因,构建由2个相同的复合启动子在相反方向分别表达F和VP0蛋白的PATI2-F-VP0表达载体。使其与鸡痘病毒282E4株共转染CEF细胞后,用BUDR法筛选重组病毒,通过间接免疫荧光法检测阳性重组病毒。用Western blot法检测F和VP0蛋白。结果 在重组病毒株中,用Western blot法可检测到F和VP0蛋白。结论 已成功地获得可同时表达F蛋白和VP0蛋白的重组鸡痘病毒。