传染性法氏囊病病毒超强毒株HLJ-0504全基因组克隆及其新特征分析

为了解传染性法氏囊病病毒(IBDV)HLJ-0504株的分子生物学特征,本研究利用融合PCR技术获得HLJ-0504株全基因组序列。核苷酸和推导氨基酸序列遗传演化分析发现,HLJ-0504A节段位于IBDV超强毒的分枝上,而B节段则介于超强毒株和减毒株之间,形成一个独立分枝,属于一株新的自然重组病毒。VP2抗原性预测分析表明,HLJ-0504株VP2第Ⅰ亲水区中的氨基酸发生突变(D212N),该突变可能导致了HLJ-0504株抗原性发生漂变。本实验结果为深入研究IBDV的分子特征奠定了基础。

传染性法氏囊病病毒超强毒感染SPF鸡免疫器官中CD4^+和CD8^+T淋巴细胞动态分布

利用免疫组织化学染色对传染性法氏囊病病毒 (IBDV)超强毒 L X株感染 SPF鸡免疫器官中 CD4 + 和 CD8+ T淋巴细胞的动态分布进行了研究。超强毒 L X株接种 2周龄 SPF雏鸡 ,在其法氏囊、脾脏、胸腺、盲肠扁桃体、骨髓和哈氏腺中均可检出 IBDV抗原的存在和 CD4 + 与 CD8+ T淋巴细胞的数量改变。在法氏囊中 ,CD4 + T淋巴细胞主要存在于淋巴滤泡间隙和滤泡皮质 ,而 CD8+ T淋巴细胞则存在于整个淋巴滤泡和滤泡间隙 ,并且 CD8+ T淋巴细胞数量明显多于 CD4 + T淋巴细胞 ,在接种后 14 d仍未见 CD4 + 和 CD8+ T淋巴细胞数量减少。脾脏中 CD4 + T淋巴细胞主要存在于外周小动脉淋巴鞘或散在 ,而 CD8+ T淋巴细胞则多存在于外周小动脉淋巴鞘和红髓。接种后胸腺中 CD4 +和CD8+ T淋巴细胞在皮质中减少 ,但在髓质增多 ,尤其是 CD8+ T淋巴细胞数明显多于 CD4 + T淋巴细胞。盲肠扁桃体中 CD4 + 和 CD8+ T淋巴细胞主要存在于生发中心 ,尤其是 CD8+ T淋巴细胞数比 CD4 + T淋巴细胞明显多。骨髓和哈氏腺中也可见 CD4 +和 CD8+ T淋巴细胞 ,而且 CD8+ T淋细胞更多。在这些淋巴器官中 ,病毒损伤部位出现 CD4 +和 CD8+ T淋巴细胞的迁入聚集 ,表明 T淋巴细胞可能参与 IBDV超强毒的免疫致病过程。

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株HLJ-0504 VP5基因缺失株感染性克隆的构建及鉴定

利用体外定点突变技术,缺失vvIBDV HLJ-0504株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列(HamRz)和丁肝病毒核酶序列(HdvRz)。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGGs的β肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGHLJ0504A△ VP5HRT,将该感染性克隆与pCAGGHLJ0504BHRT共转染DF-I细胞。IFA,RT-PCR,电镜观察均显示获得重组病毒,将其命名为rHLJ0504HT△VP5。vvIBDV VP5基因缺失感染性克隆的成功构建为我们利用反向遗传操作技术快速致弱vvIBDV,构建IBD的候选疫苗株奠定了基础。

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株HQ0806的分离与鉴定

为分离、鉴定鸡传染性法氏囊病病毒,通过对辽宁阜新近郊某鸡场数群15日龄左右的病鸡的临床症状、病理变化、病毒分离、纯化、动物回归、血清学检测、病毒形态观察等检测。结果显示:被检病毒效价达到10-5.8/0.2mL,在动物回归试验中其引起发病率达100%,死亡率为83%,剖检可见法氏囊呈"紫葡萄样"外观,胸腺萎缩,骨髓脂肪化等病变,表现了超强毒株的致病特点。

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒洛阳分离株VPP2基因的原核表达及鉴定

根据GenBank公布的鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列,设计合成1对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vv IBDV)洛阳分离株LY1的VP2基因并进行克隆,构建重组质粒p MD18-T-VP2,然后连接至原核表达载体p ET32a,将阳性质粒转化至感受态细胞Rosetta中进行诱导表达。SDS-PAGE结果显示VP2基因在大肠杆菌Rosetta细胞中实现融合表达,蛋白大小约66 ku,且主要存在于细胞上清中,Western blot试验证实表达的VP2蛋白具有较好的反应原性。研究结果可为IBDV的诊断抗原及基因工程疫苗研究奠定基础。

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株GX8/99株的致病性

鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV)超强毒株GX8/ 99,系 1999年从广西一自然发病鸡群采集到。用原始病鸡法氏囊悬液连续 3次人工感染SPF鸡后 ,再取其法氏囊制备悬液 ,分装 ,在 - 70℃保存。以此悬液经卵黄囊接种 10日龄SPF鸡胚 ,测定鸡胚的半数致死量 (ELD50 )。随着鸡的日龄和接种剂量的不同 ,其致死率有很大差异。对 2 8～ 30日龄SPF鸡 ,病毒接种量为 2 0 0个ELD50 时 ,感染后 7日内死亡率最高可达 73%～ 90 5 % (11/ 15和 19/ 2 1) ;感染量为 2 0个ELD50 时 ,死亡率亦可达 5 3%～ 92 % (8/ 15和 2 3/ 2 5 )。以 5 0 0个ELD50 感染 2 8～ 10 4日龄的SPF鸡 ,死亡率均在 5 5 1%～ 6 7 2 % ;甚至 113～ 12 0日龄的SPF鸡 ,感染后仍有 10 %～ 15 %致死率。但 12 8日龄的SPF鸡感染后既不引起死亡也不表现任何症状 ,但抗体全部转阳。人工接种发病死亡的鸡 ,其法氏囊的出血程度也随感染量和年龄而异。 5 0日龄鸡接种 2 0 0 0个ELD50 后 ,死亡的鸡 10 0 % (12 / 12 )法氏囊严重出血 ;而 4 0日龄鸡感染 2 0 0个ELD50 后 ,死亡鸡中仅 17% (3/ 18)发生出血。在 2、3、4周龄带有母源抗体的商品代蛋鸡 ,以 2 0 0 0个ELD50 病毒接种后 ,只引起 10 % (2 / 2 0 )、35 % (7/ 2 0 )和 35 % (7/ 2 0 )的死亡率。但在

2株鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株的分离鉴定

用分离的疑为鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV)超强毒株 (vv IBDV) He B- lf和 He B- bd接种 SPF鸡 ,36 h后接种鸡开始发病 ,发病率为 10 0 %,死亡率为 5 0 %以上。剖检可见与野外病例相同的病理变化 ,如肌肉、心脏、腺胃出血 ,法氏囊水肿或呈“紫葡萄”样外观。经血清学试验、毒力试验、鸡胚接种试验、分子生物学和电镜形态学观察均证明该两分离物为超强毒株 ,从而证明河北省鸡群中存在不同于经典 IBDV的超强毒株。

传染性法氏囊病病毒超强毒株致弱的分子生物学特征

为了探索传染性法氏囊病病毒 ( IBDV)超强毒株致弱的分子特征变化 ,采用 RT-PCR技术 ,从超强毒 ( vv IBDV)及其不同代次细胞传代致弱毒中扩增到编码 VP2蛋白的 c DNA高变区基因 ,并对其序列测定。将 vv IBDV及其致弱毒株 VP2高变区的氨基酸与其它血清 I型毒株比较 ,发现 vv IBDV与其致弱毒株在VP2高变区的 2 2 2、2 4 2、2 53、2 56、2 71、2 79、2 84、2 94、2 99和 3 0 0位氨基酸发生了改变 ,而这些氨基酸的变化使亲水区和七肽区发生了改变 。

传染性法氏囊病病毒超强毒株F9811VP_2基因的克隆及序列分析

根据 NCBIG Gene Bank记载的传染性法氏囊病病毒超强毒 ( vv IBDV) OKYM株的核苷酸序列 ,设计并合成 1对特异性扩增 IBDV主要宿主保护性抗原 VP2 基因的引物。从 IBDV F981 1感染发病鸡法氏囊组织中提取病毒 RNA,经 RT-PCR扩增出约 1 .5kb的基因片段 ,采用平端连接法将此基因片段克隆至p UC1 1 9质粒的 Sma 位点上。经核苷酸序列测定 ,并与国内外其他 vv IBDV VP2 基因序列进行比较分析 ,发现 F981 1与 OKYM在 VP2 基因上有 1 8个核苷酸不同 ,但在氨基酸序列上仅 2 1 2位存在差异 ,从而从分子生物学角度证明 F981 1为 vv IBDV。对 1 4 3～ 3 82氨基酸区域所作系统进化树分析表明 ,F981 1、G92 0 1与OKYM、UK661、HK4 6相近 ,而 F950 2、G93 0 3与 OKYM、U K661、HK4 6较远 ,说明我国存在许多不同的vv

传染性法氏囊病病毒超强毒地方株HN01的分离鉴定及分子系统进化分析

用分离的疑为鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)超强毒(vvIBDV)地方分离株HN01,经处理后接种SPF鸡,36h后接种鸡开始发病,发病率为100%,死亡率为70%以上。剖检可见与野外病例相同的病理变化,如肌肉、腺胃、心脏出血,法氏囊水肿且多呈"紫葡萄"样外观。经血清学试验、毒力试验、鸡胚接种试验、分子生物学和电镜形态学观察均证明该分离物为超强毒株,从而证明河南省鸡群中存在不同于IBDV一般强毒株、经典株和变异株的超强毒株。通过对IBDV不同毒株VP2基因高变区氨基酸序列的聚类分析发现,HN01与华南超强毒株G9201、欧洲超强毒株UK661关系最接近,而与HK46,OKYM,D6948,UPM92-04和KS等毒株关系依次渐远。

传染性法氏囊病病毒超强毒株的分离与VP2基因序列分析

为了探讨传染性法氏囊病流行的原因,从4个发生传染性法氏囊病的鸡场采集病变法氏囊,处理后用特异性单克隆抗体进行荧光检测,结果均为阳性;然后提取病毒RNA,利用RT-PCR扩增病毒VP2基因cDNA并进行序列和遗传进化分析。结果表明:所分离的4株病毒均具有超强毒的分子特征,属于传染性法氏囊病病毒超强毒病毒群,4株病毒在第1亲水区的212位有1个氨基酸突变(D→N);HLJ-3和HLJ-4在第2亲水区321位还有1个突变(A→V),这些突变可能造成传染性法氏囊病病毒的抗原发生变异,进而发生免疫失败。

传染性法氏囊病病毒超强毒株高免卵黄抗体的研制及应用

本研究从山西某养殖场分离到一株传染性法氏囊病病毒,经序列比对,发现其与国外经典超强毒株的同源性高达99.6%,除222位点,其他位点均具备超强毒株的序列特征,结合临床发病特征,确定为超强毒株。用此超强毒株研制成传染性法氏囊病灭活疫苗,对健康鸡群三免,当卵黄抗体滴度达到27时,收集鸡蛋,制备高免卵黄抗体,用此高免卵黄抗体治疗IBDV感染鸡群,有效率达100%。

幼鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株VP2基因的克隆和分析

利用反转录 聚合酶链反应(RT PCR),扩增并克隆传染性法氏囊病病毒超强毒株(vvIBDV)SH9901VP2基因,并对其进行全序列测定 结果表明,克隆到的VP2基因序列长1 3kb;强毒株SH9901VP2片段与超强毒株OKMY高度相似;核苷酸与氨基酸同源性分别为99 26%,99 8%.

传染性法氏囊病病毒超强毒株HB-bp人工感染雏鸡的病理学观察

5周龄非免疫健康鸡人工感染传染性法氏囊病病毒超强毒株河北分离株HB-bp,3d后出现明显的临床症状,3～4d内死亡率达80%。法氏囊、脾脏、盲肠扁桃体、胸腺及腺胃有病理组织学变化,各个免疫器官和组织中均含有病毒,法氏囊内病毒含量最高,其次是脾脏。而对照组未见任何异常变化。

传染性法氏囊病病毒超强毒株河北分离株HB-bp的生物学特性

将分离毒HB -bp与STC(Ⅰ型)、CJ801(Ⅰ型)标准毒株比较 ,分析了其病原性、形态结构、理化特性、血凝活性、血清型、抗原特异性及结构蛋白分析。结果表明 ,HB -bp的病毒基因组有两个特征性片段 ,电泳后呈现两个条带 ,在SDS -PAGE中出现5条病毒特异蛋白带 ,在形态学、密度、理化特性、血凝性上与标准IBD毒株相似 ,具有较好的抗原性。血清中和试验测定该毒株为血清Ⅰ型毒株 ,鸡胚接种传代培养可引起鸡胚规律性死亡 ,致病力试验具有超强毒株的高致病性和高死亡率的特征 ,表明本分离株为超强毒株。

传染性法氏囊病病毒超强毒株ZHA001株的分离及鉴定

为研究某817肉鸡群发生传染性法氏囊病(IBD)原因,从病料中进行病毒分离,通过RT-PCR扩增分离株VP2基因后进行相关分析,并对分离株的致病性进行测定。结果显示,分离到一株传染性法氏囊病病毒(IBDV),将其命名为ZHA001株;ZHA001株VP2基因序列与超强毒株(vvIBDV)的同源性为97.5%~99.1%,氨基酸序列同源性大于99.3%;具有超强毒株的特征性氨基酸位点;遗传进化分析发现,ZHA001株属于超强毒株分支;致病性试验中,发病率为100%,致死率为90%。试验结果表明引起该鸡群IBD的病原为超强毒病毒,致病力强。

三株传染性法氏囊病病毒超强毒株全基因组的克隆与序列分析

为了获得本实验室3株(HuB-1、HeB10XS02、SD10LY01)传染性法氏囊病病毒(IBDV)分离毒株的全基因组序列,并了解其序列特征,首先测定了这3株毒株对SPF鸡的致死率,然后利用融合PCR技术扩增获得全基因组序列,对其进行遗传进化分析。结果显示,3株毒株对SPF鸡的致死率均在60%以上,为IBDV超强毒株(vvIBDV)。遗传进化分析表明,3株分离毒株的A节段均位于超强毒分支。IBDV的B节段分为明显的3个亚群,其中HuB-1、SD10LY01的B节段属于第Ⅲ亚群,HeB10XS02的B节段则属于第Ⅱ亚群。第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚群之间在VP1蛋白上存在17个保守氨基酸差异位点,其中第145~147位氨基酸形成独特的'三联体'基序,不同亚群具有不同的基序。本研究结果为更好地了解vvIBDV基因组特征以及致病性分子基础的研究提供了重要理论依据。

超强传染性法氏囊病病毒株宿主保护抗原的分子特征

为了探索超强传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）株毒力增强的原因，采用反转录－聚合酶链反应技术，从中国广东、福建分离到的３株超强ＩＢＤＶ毒株中扩增到编码ＶＰ２蛋白的ｃＤＮＡ基因片段，并对ＶＰ２基因的高可变区进行了序列测定。序列分析和聚类分析表明，３株超强毒株与欧洲超强毒株非常相似，而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。将超强毒株ＶＰ２高可变区的氨基酸序列与其他血清Ⅰ型毒株进行比较，发现除了具有一般ＩＢＤＶ强毒株的分子特征之外，所有超强毒株在２２２、２５６、２９４和２９９位上的氨基酸均相同，分别为Ａ、Ⅰ、Ⅰ和Ｓ，与其他毒株均不相同。而２２２、２９４和２９９位上的特征性氨基酸使超强毒株ＶＰ２中诱导中和抗体的抗原决定簇的构象发生细微变化，从而导致毒力增强。

鸡传染性法氏囊病超强毒感染后SPF鸡免疫器官病理学观察

IBDV超强毒株LX株接种 2周龄SPF雏鸡后 ,其致病性不同于经典强毒株CJ80 1株 ,它主要引起接种鸡全身性炎症反应 ,法氏囊、脾脏、盲肠扁桃体等免疫器官中大量异嗜性白细胞、巨噬细胞浸润 ,淋巴细胞严重坏死崩解 ,胸腺皮质严重萎缩、坏死 ,骨髓中造血细胞减少、巨噬细胞和脂肪细胞增生。在接种后 14d法氏囊淋巴滤泡严重萎缩、淋巴细胞排空形成囊腺样结构 ,未见恢复正常 ,其它免疫器官形态基本恢复正常。电镜观察 ,接种后 2和4d可见胸腺淋巴细胞胞浆浓集、染色质周边化形成新月形 ,表现细胞凋亡特征 ;在法氏囊坏死淋巴细胞胞浆中可见6 0nm大小呈晶格排列或散在的病毒粒子。研究初步探明了鸡传染性法氏囊病病毒超强毒的致病机理。

表达传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建

【目的】重组新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景,本研究旨在探讨新城疫病毒作为防制传染性法氏囊病超强毒(very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV)及新城疫重组二联活病毒载体疫苗的可行性。【方法】采用单股负链RNA病毒反向遗传操作技术,救获野生型NDV LaSota疫苗株rLaSota及表达vvIBDV Gx株VP2基因的重组疫苗株rLaSota-VP2,分别经滴鼻点眼途径免疫SPF雏鸡,免疫后21d分别以vvIBDVGx超强毒和新城疫强毒进行攻击。【结果】rLaSota及表达vvIBDV-VP2基因平均鸡胚致死时间均大于120h,脑内致病指数(ICPI)分别为0.4和0.36,静脉内致病指数(IVPI)均为0;接种后72～96h每毫升尿囊液EID50则分别达到109.0以上。rLaSota-VP2以106.0EID50一次免疫7日龄SPF鸡雏,免疫后3周对新城疫强毒致死攻击100%保护,对vvIBDV攻击免疫保护率达90%以上。【结论】重组病毒rLaSota-VP2保持了LaSota亲本疫苗株高滴度的鸡胚生长特性和低致病性及遗传稳定性,免疫雏鸡对新城疫强毒和传染性法氏囊病毒超强毒株的致死均形成有效免疫保护。本研究为研制传染性法氏囊病-新城疫重组二联活载体疫苗奠定了基础。